一種青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，包括以下步驟：（1）青蛤預(yù)處理；（2）酶解；（3）超濾分離；（4）快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化；（5）高效液相色譜系統(tǒng)分離純化。本發(fā)明以青蛤?yàn)樵希ㄟ^胰蛋白酶酶解青蛤，并利用超濾技術(shù)、快速蛋白純化系統(tǒng)和高效液相色譜系統(tǒng)對酶解液進(jìn)行分離純化后得到一種新的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽（ACE抑制肽），提取分離工藝合理，可操作性強(qiáng)，為從青蛤中制備高活性的ACE抑制肽提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專利說明】
一種青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高血壓是困擾當(dāng)今的一種心血管疾病，可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，對人類健康危害極大。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Ang1tensin-converting enzyme，ACE)在機(jī)體血壓調(diào)節(jié)過程中起重要作用，一方面ACE將無活性的血管緊張素I轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈收縮全身微動(dòng)脈，使血壓升高的血管緊張素Π;另一方面ACE能促進(jìn)有降血壓作用的緩激肽分解，引起血壓升高。
[0003]現(xiàn)今人工合成的卡托普利、依那普利和賴諾普利等ACE抑制劑，這些藥物具有很強(qiáng)的降血壓作用，但長期服用會(huì)產(chǎn)生眩暈、惡心、劇烈咳嗽、味覺異常、腎功能損害等副作用。許多研究表明源于食物中的短肽具有降血壓的功效，Da1-Hung Ngo等以太平洋鱈魚皮為原料，用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，經(jīng)分離純化后得到降血壓肽:Thr-Cys-Ser-Pro ； Hasan F等利用胃蛋白酶酶解鰹魚肉，經(jīng)分離純化后得到高活性降血壓肽(IKYGD);源于食物中的生物活性肽具有安全、無毒副作用，且易于機(jī)體吸收等特點(diǎn)。因此，從食物源中制備分離出高活性的ACE抑制肽仍是研究的熱點(diǎn)。
[0004]青蛤(Cyclinasinensis)是我國沿海常見的貝類，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白源。青蛤提取物具有抗氧化、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫作用等功效。但目前尚未見與青蛤降血壓肽相關(guān)的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了提供一種提取分離工藝合理，可操作性強(qiáng)，產(chǎn)品穩(wěn)定性好的青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，包括以下步驟:
(I)青蛤預(yù)處理:將青蛤除殼、剝?nèi)夂螅们逅迅蛉庀磧簦?jīng)高速組織攪碎機(jī)勻漿后用
0.lmol/L的NaOH浸泡3?5h，過濾后濾渣用純化水泡洗至pH呈中性，脫水后得青蛤肉渣，備用。對青蛤預(yù)處理主要是脫雜蛋白和除去脂質(zhì)。
[0007](2)酶解:將步驟(I)中的青蛤肉渣加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:料液比1:2-3，加酶量1000?1200U/g，pH值7.5-8.5,酶解溫度45?50°C，酶解時(shí)間9?12 h，酶解完成后用沸水浴滅活，預(yù)冷后離心，得上清液。
[0008](3)超濾分離:將上清液經(jīng)0.45μπι濾膜抽濾后，用截留分子量為3ku的超濾膜進(jìn)行超濾，得超濾液。
[0009](4)快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化:將步驟(3)中的超濾液經(jīng)快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，得到五個(gè)活性組分，分別取樣測定該五個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分A。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的檢測采用高效液相色譜(HPLC)法，該技術(shù)為現(xiàn)有技術(shù)，故不在此贅述。
[0010](5)高效液相色譜系統(tǒng)分離純化:將組分A經(jīng)高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)分離純化，得到七個(gè)活性組分，分別取樣測定該七個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分B，組分B經(jīng)純度檢測后，即得氨基酸序列為:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽。
[0011]作為優(yōu)選，步驟(2)中，酶解期間不斷攪拌。
[0012]作為優(yōu)選，步驟(2)中，預(yù)冷至4?6°C。預(yù)冷至4?6°C，有助于提高離心效果。
[0013]作為優(yōu)選，步驟(2)中，離心工藝條件為:轉(zhuǎn)速5000?10000rpm/min，離心時(shí)間10?30mino
[0014]作為優(yōu)選，步驟(4)中，快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化的具體方法為:采用Superose 12 10/300 GL瓊脂糖凝膠柱(填料粒徑10 μπι, 10 X 300 mm)，超濾液稀釋至0.1g/mL，#0.22 μπι濾膜后進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 yL;超純水洗脫，流速:0.5 mL/min;檢測波長:280 nm;自動(dòng)收集:3.5 mL/管，收集各峰。
[0015]作為優(yōu)選，步驟(5)中，高效液相色譜系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用ZORBAXSB-C18制備型色譜柱(填料粒徑5μπι，4.6 X 250 mm);流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脫方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.5 mL/min;檢測波長:214和280 nm;柱溫:25°C ;自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 yL，收集各峰。
[0016]作為優(yōu)選，步驟(5)中，組分B純度檢測方法為:采用ZORBAXSB-C18分析型色譜柱(填料粒徑:5μ??，4.6 X 150 mm);流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脫方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.0 mL/min;柱溫:25°C ;自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 yL;檢測波長:214和280 nm0
[0017]因此，本發(fā)明具有如下有益效果是:以青蛤?yàn)樵希ㄟ^胰蛋白酶酶解青蛤，并利用超濾技術(shù)、快速蛋白純化系統(tǒng)和高效液相色譜系統(tǒng)對酶解液進(jìn)行分離純化后得到一種新的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽(ACE抑制肽)，提取分離工藝合理，可操作性強(qiáng)，為從青蛤中制備高活性的ACE抑制肽提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面通過【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
[0019]實(shí)施例1
(I)青蛤預(yù)處理:將青蛤除殼、剝?nèi)夂螅们逅迅蛉庀磧簦?jīng)高速組織攪碎機(jī)勻漿后用
0.111101/1的他0田受泡311，過濾后濾渣用純化水泡洗至pH呈中性，脫水后得青蛤肉渣，備用。
[0020](2)酶解:將步驟(I)中的青蛤肉渣加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:料液比1:2，加酶量1000U/g，pH值7.5，酶解溫度45°C，酶解時(shí)間9 h，酶解期間不斷攪拌，酶解完成后用沸水浴滅活，預(yù)冷至4°C后以轉(zhuǎn)速5000rpm/min離心lOmin，得上清液；
(3)超濾分離:將上清液經(jīng)0.45μπι濾膜抽濾后，用截留分子量為3ku的超濾膜進(jìn)行超濾，得超濾液。
[0021](4)快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化:將步驟(3)中的超濾液經(jīng)快速蛋白純化系統(tǒng)(Apurifier UPC-100型快速蛋白純化儀，GE生命科學(xué)公司)進(jìn)行分離純化，得到五個(gè)活性組分，分別取樣測定該五個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分A，快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化的具體方法為:采用Superose 12 10/300 GL瓊脂糖凝膠柱(填料粒徑10 μπι, 10 X 300 mm)，超濾液稀釋至0.1g/mL，#0.22 μπι濾膜后進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 yL;超純水洗脫，流速:0.5 mL/min;檢測波長:280 nm;自動(dòng)收集:3.5 mL/管，收集各峰。
[0022](5)高效液相色譜系統(tǒng)分離純化:將組分A經(jīng)高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)分離純化，得到七個(gè)活性組分，分別取樣測定該七個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分B，組分B經(jīng)純度檢測后，即得氨基酸序列為:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，高效液相色譜系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用ZORBAX SB-C18制備型色譜柱(填料粒徑5μπι，4.6 X 250 mm);流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脫方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.5 mL/min;檢測波長:214和280 nm;柱溫:25°C ;自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 yL，收集各峰，組分B純度檢測方法為:采用ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(填料粒徑:5μπι,4.6Χ150 mm)；流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脫方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.0 mL/min;柱溫:25°C ;自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 yL;檢測波長:214和280 nm。
[0023]實(shí)施例2
(I)青蛤預(yù)處理:將青蛤除殼、剝?nèi)夂螅们逅迅蛉庀磧簦?jīng)高速組織攪碎機(jī)勻漿后用
0.111101/1的他0田受泡411，過濾后濾渣用純化水泡洗至pH呈中性，脫水后得青蛤肉渣，備用。
[0024](2)酶解:將步驟(I)中的青蛤肉渣加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:料液比1:2.5，加酶量1100U/g，pH值8，酶解溫度48°C，酶解時(shí)間10 h，酶解期間不斷攪拌，酶解完成后用沸水浴滅活，預(yù)冷至5°C后以轉(zhuǎn)速8000rpm/min離心20min，得上清液。
[0025](3)超濾分離:將上清液經(jīng)0.45μπι濾膜抽濾后，用截留分子量為3ku的超濾膜進(jìn)行超濾，得超濾液。
[0026](4)快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化:將步驟(3)中的超濾液經(jīng)快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，得到五個(gè)活性組分，分別取樣測定該五個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分A，快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化的具體方法為:采用Superose 12 10/300 GL瓊脂糖凝膠柱(填料粒徑10 μπι, 10 X 300 mm)，超濾液稀釋至0.1 g/mL，#0.22 ym濾膜后進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 ;超純水洗脫，流速:0.5mL/min;檢測波長:280 nm;自動(dòng)收集:3.5 mL/管，收集各峰。
[0027](5)高效液相色譜系統(tǒng)分離純化:將組分A經(jīng)高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)分離純化，得到七個(gè)活性組分，分別取樣測定該七個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分B，組分B經(jīng)純度檢測后，即得氨基酸序列為:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，高效液相色譜系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用ZORBAX SB-C18制備型色譜柱(填料粒徑5μπι，4.6 X 250 mm);流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脫方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.5 mL/min;檢測波長:214和280 nm;柱溫:25°C ;自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 yL，收集各峰，組分B純度檢測方法為:采用ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(填料粒徑:5μπι,4.6Χ150 mm)；流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脫方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.0 mL/min;柱溫:25°C ;自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 yL;檢測波長:214和280 nm。
[0028]實(shí)施例3
(I)青蛤預(yù)處理:將青蛤除殼、剝?nèi)夂螅们逅迅蛉庀磧簦?jīng)高速組織攪碎機(jī)勻漿后用
0.111101/1的他0田受泡511，過濾后濾渣用純化水泡洗至pH呈中性，脫水后得青蛤肉渣，備用。
[0029](2)酶解:將步驟(I)中的青蛤肉渣加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:料液比1:3，加酶量1200U/g，pH值8.5，酶解溫度50 °C，酶解時(shí)間12 h，酶解期間不斷攪拌，酶解完成后用沸水浴滅活，預(yù)冷至6°C后以轉(zhuǎn)速10000rpm/min離心30min，得上清液。
[0030](3)超濾分離:將上清液經(jīng)0.45μπι濾膜抽濾后，用截留分子量為3ku的超濾膜進(jìn)行超濾，得超濾液。
[0031](4)快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化:將步驟(3)中的超濾液經(jīng)快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，得到五個(gè)活性組分，分別取樣測定該五個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分A，快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化的具體方法為:采用Superose 12 10/300 GL瓊脂糖凝膠柱(填料粒徑10 μπι, 10 X 300 mm)，超濾液稀釋至0.1 g/mL，#0.22 ym濾膜后進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 ;超純水洗脫，流速:0.5mL/min;檢測波長:280 nm;自動(dòng)收集:3.5 mL/管，收集各峰。
[0032](5)高效液相色譜系統(tǒng)分離純化:將組分A經(jīng)高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)分離純化，得到七個(gè)活性組分，分別取樣測定該七個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分B，組分B經(jīng)純度檢測后，即得氨基酸序列為:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，高效液相色譜系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用ZORBAX SB-C18制備型色譜柱(填料粒徑5μπι，4.6 X 250 mm);流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脫方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.5 mL/min;檢測波長:214和280 nm;柱溫:25°C ;自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 yL，收集各峰，組分B純度檢測方法為:采用ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(填料粒徑:5μπι,4.6Χ150 mm)；流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脫方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.0 mL/min;柱溫:25°C ;自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 yL;檢測波長:214和280 nm。
[0033]本發(fā)明提取分離工藝合理，可操作性強(qiáng)，以青蛤?yàn)樵希ㄟ^胰蛋白酶酶解后利用超濾技術(shù)、快速蛋白純化系統(tǒng)和高效液相色譜系統(tǒng)對酶解液進(jìn)行分離純化得到一種新的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽(ACE抑制肽)，其經(jīng)氨基酸測序儀進(jìn)行N端降解測序，得到五肽，其氨基酸序列為:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)，其相對分子質(zhì)量為636.78 Da，TPMGP的 IC50為0.5025 mg/ml，具有較高的ACE抑制活性(ACE抑制率為87.58%以上)，為從青蛤中制備高活性的ACE抑制肽提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[0034]以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)青蛤預(yù)處理:將青蛤除殼、剝?nèi)夂螅们逅迅蛉庀磧簦?jīng)高速組織攪碎機(jī)勻漿后用0.lmol/L的NaOH浸泡3?5h，過濾后濾渣用純化水泡洗至pH呈中性，脫水后得青蛤肉渣，備用； (2)酶解:將步驟(I)中的青蛤肉渣加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:料液比1:2?3，加酶量1000~12001]/^，？!1值7.5-8.5,酶解溫度45?50°C，酶解時(shí)間9?12 h，酶解完成后用沸水浴滅活，預(yù)冷后離心，得上清液； (3)超濾分離:將上清液經(jīng)0.45μπι濾膜抽濾后，用截留分子量為3ku的超濾膜進(jìn)行超濾，得超濾液； (4)快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化:將步驟(3)中的超濾液經(jīng)快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，得到五個(gè)活性組分，分別取樣測定該五個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分A; (5)高效液相色譜系統(tǒng)分離純化:將組分A經(jīng)高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)分離純化，得到七個(gè)活性組分，分別取樣測定該七個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分B，組分B經(jīng)純度檢測后，即得氨基酸序列為:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(2)中，酶解期間不斷攪拌。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(2)中，預(yù)冷至4?6 °C。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(2)中，離心工藝條件為:轉(zhuǎn)速5000~10000rpm/min，離心時(shí)間10~30min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(4)中，快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化的具體方法為:采用Superose 12 10/300 GL瓊脂糖凝膠柱(填料粒徑1 μ??, 10 × 300 mm)，超濾液稀釋至0.1 g/mL，#0.22 μm濾膜后進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 UL;超純水洗脫，流速:0.5 mL/min;檢測波長:280 nm;自動(dòng)收集:3.5 mL/管，收集各峰。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(5)中，高效液相色譜系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用ZORBAX SB-C18制備型色譜柱(填料粒徑5μm，4.6 × 250 mm)；流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脫方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.5 mL/min;檢測波長:214和.280nm;柱溫:25℃;自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500μL，收集各峰。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種青蛤血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(5)中，組分B純度檢測方法為:采用ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(填料粒徑:5μm，4.6 X.150 mm);流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用梯度洗脫方式:5min 20% B，30min 100% B;流速:1.0 mL/min;柱溫:25°C ;自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:500 yL；檢測波長:214和280 nm。
【文檔編號(hào)】C07K7/06GK105821103SQ201511011197
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年12月30日
【發(fā)明人】余方苗, 羅李玉, 楊最素, 黃芳芳, 丁國芳
【申請人】浙江海洋學(xué)院