專利名稱：一種利用魷魚肝臟蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魷魚肝臟蛋白深加工的方法，尤其涉及一種利用魷魚肝臟蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽的方法。
背景技術(shù)：
魷魚加工過程中有約占魷魚體重30%的頭、足、肝臟及表皮等廢棄物產(chǎn)生。對(duì)于這些廢棄物，一般的處理方法是加工魚粉，或者掩埋，這不但是對(duì)漁業(yè)資源的巨大浪費(fèi)，而且還存在著環(huán)境污染的問題。在國外，如西班牙和日本對(duì)于魷魚肝臟的利用采用自身酶解發(fā)酵法生產(chǎn)魷溶漿、魷魚粉等作為魚類飼料。在國內(nèi)魷魚肝臟的利用和研究還有比較大的發(fā)展空間，目前僅有魷魚肝臟干粉的加工，并且是用作飼料，技術(shù)水平不高。目前，有從魷魚皮制備膠原蛋白活性肽，如專利號(hào)為200710013140. 2，一種魷魚皮膠原蛋白活性肽的制備，將魷魚皮用清水洗凈，加入NaOH的水溶液浸泡，再用清水反復(fù)洗滌至pH中性；加入稀酸水溶液浸泡，再洗滌至PH中性；攪拌下，在熱水中抽提膠原蛋白，過濾除去不溶物；在攪拌下，加酶酶解l_6h，酶解溫度為40-50°C，在90-100°C下滅酶4-lOmin ；用堿液調(diào)pH至中性，酶解液經(jīng)過濾后，再依次經(jīng)過截留分子量為8KD的超濾膜超濾、納濾脫鹽，最后真空濃縮，噴霧干燥。產(chǎn)品具有很強(qiáng)的生物活性，可用于制備抗氧化、降血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化或美容的保健食品或藥品。但是它是從魷魚皮來制取。本研究的目的就是從廢棄的魷魚肝臟中提取蛋白質(zhì)和生物活性肽，以使寶貴的蛋白質(zhì)和油脂資源得以綜合利用，提高附加值，減少廢棄物的排放，凈化環(huán)境。魷魚肝臟中提取生物活性肽的研究，可提供消化吸收效率更高的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，用于食品和飼料行業(yè)，而且制備的生物活性肽還可應(yīng)用于疾病的防治，能為維護(hù)人類的健康作貢獻(xiàn)。目前，有許多不同種類的藥物應(yīng)用于高血壓的治療，其中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE) 抑制肽(即降血壓活性肽)是一種治療高血壓的主要藥物。從1981年第一個(gè)口服有效的人工合成ACE抑制劑卡托普利(Captopril)批準(zhǔn)使用以來，現(xiàn)在應(yīng)用于臨床上的ACE抑制劑已達(dá)18種，但人工合成的ACE抑制劑在臨床應(yīng)用過程中往往會(huì)產(chǎn)生副作用，如咳嗽、味覺功能紊亂及皮疹等。因此，尋找天然的ACE抑制劑引起了研究者的極大興趣。試驗(yàn)表明，天然的ACE抑制肽對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)及高血壓患者具有降壓作用，而對(duì)正常血壓大鼠及人無降壓作用。另外，這些肽是經(jīng)食品級(jí)酶在混合條件下處理獲得的，其安全性高。ACE 抑制肽在開發(fā)具有降血壓功能的功能食品中具有廣闊前景。目前生產(chǎn)ACE抑制肽的方法大體有三種一是提取存在于生物體中的各類天然 ACE抑制肽；二是通過化學(xué)法或酶法水解蛋白質(zhì)，化學(xué)法常采用加熱和酸處理的方法，而體外蛋白酶水解包括直接酶解和利用微生物間接酶解兩類；三是用重組DNA技術(shù)、酶法、化學(xué)法合成活性肽。其中，酶解蛋白質(zhì)生產(chǎn)ACE抑制肽因其安全性高、能在溫和的條件下進(jìn)行定位水解分裂產(chǎn)生特定的肽段，而且水解過程易受控制，價(jià)廉易推廣，引起人們的極大興趣。因而近幾年報(bào)道的ACE抑制肽的制備方法皆為酶解法，酶的選擇是酶解法生產(chǎn)活性肽的關(guān)鍵，應(yīng)根據(jù)酶的專一性從眾多的蛋白酶中篩選出能水解所需肽段，目前廣泛使用的蛋白酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。由于ACE抑制肽的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)差別均較大，沒有一個(gè)固定或較特殊的氨基酸組成，并且蛋白酶解產(chǎn)物成分相當(dāng)復(fù)雜，這就增加了它的分離提取難度。因此，建立一套適宜的分離提取技術(shù)工藝是將ACE抑制肽推向商業(yè)化生產(chǎn)的必要條件。ACE抑制肽的分離提取甚至結(jié)構(gòu)鑒定是一項(xiàng)最復(fù)雜，也是最有意義的工作。所用的分離純化的方法主要有離子交換樹脂、超濾、凝膠過濾色譜、高效液相色譜、聚丙稀酰胺凝較電泳等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是根據(jù)上述技術(shù)現(xiàn)狀提供一種從廢棄的魷魚肝臟中提取蛋白質(zhì)進(jìn)而制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽的方法，提取分離工藝合理，易控制易操作，制得的活性肽具有較高的活性。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種利用魷魚肝臟蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的方法，其特征在于包括以下步驟1)采取丙酮浸提法提取魷魚肝臟蛋白將魷魚肝臟與水按質(zhì)量比1 1 1 1.5 混合，充入氮?dú)?0 20分鐘，加入占魷魚肝臟重量0. 1 0. 5 %的L-抗壞血酸-6-棕櫚酸酯抗氧劑，放入高壓鍋中處理20 30min，離心處理，除去上層魚油，用丙酮洗滌數(shù)次，將組織脫水制成丙酮粉，真空干燥即得脫脂魷魚肝臟蛋白；2)用胃蛋白酶酶解魷魚肝臟蛋白以脫脂魷魚肝臟蛋白為底物，在水解溫度35 38°C，pH為1. 5-2. 5，酶與底物的比為2 3%，底物濃度為1 3%條件下水解魷魚肝臟蛋白18 25h，其中百分比為質(zhì)量百分比；3)將得到的魷魚肝臟蛋白酶解液進(jìn)行超濾處理；4)將超濾后的產(chǎn)物用kphadex G_50凝膠柱初步分離，得到粗分物的ACE抑制肽；5)在粗分物的ACE抑制肽中選取活性高的組分用DEAE陰離子交換柱進(jìn)行分離純化；6)將純化后得到的活性高的組分用kphadex LH-20繼續(xù)分離純化；7)最后檢測(cè)純度，得到血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽。所述步驟3的超濾處理的過程為1)采用超濾裝置將魷魚肝臟蛋白酶解液進(jìn)行超濾，濾膜為截留分子量IkDa 30kDao2)將截留液用蒸餾水稀釋后繼續(xù)超濾，合并收集的超濾液并進(jìn)行冷凍干燥。所述步驟1中離心處理工藝為4000 10000rpm/min處理20 40min。所述步驟4的凝膠柱初步分離的工藝為將超濾后凍干樣品溶解，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速為20 40mL/h，優(yōu)選30mL/h，紫外檢測(cè)儀HD2-CA,檢測(cè)波長280nm ；并測(cè)定各肽峰抑制ACE的活性，其半抑制濃度(IC5tl)達(dá)到2. 10 5. 08mg/mL。將得到的對(duì)ACE抑制活性高的粗分物組分進(jìn)行穩(wěn)定性及抑制模式分析。所述的凝膠柱中凝膠采用葡萄糖凝膠，分離的分子量為lOOODa-lOOOODa。
所述步驟5的分離純化具體過程為選取活性高的組分用DEAE陰離子交換柱分離，上樣先用水洗脫，再用0 lmol/LNaCl溶液進(jìn)行線性洗脫，流速為20 ^mL/h，優(yōu)選 24mL/h，并測(cè)定各肽峰抑制ACE的活性，其半抑制濃度(IC5tl)達(dá)到1. 80 2. 10mg/mL。所述步驟6的分離純化工藝條件為洗脫液為25 35% (wt)的甲醇溶液，優(yōu)選 30 %的甲醇溶液，流速為20 ^mL/h，優(yōu)選24mL/h，并測(cè)定各肽峰抑制ACE的活性。其半抑制濃度(IC50)達(dá)到1. 50 1. 80mg/mL。所述步驟7的檢測(cè)純度是采用反相高效液相色譜C18柱檢測(cè)純度，洗脫液甲為含 0. 01 % 0. 03 % TFA的水，洗脫液乙為含0. 01 % 0. 03 % TFA的乙腈溶液，先用5 % 10 % 的甲液洗脫，再用洗脫梯度為95% 98%乙液洗脫，流速為20 24mL/h。所述步驟2中胃蛋白酶酶解魷魚肝臟蛋白的工藝參數(shù)優(yōu)選為底物濃度2.5%，酶與底物比2%，在36°C條件下酶解20h。所述高壓鍋采用115 125 °C。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明是對(duì)魷魚肝臟廢棄物的綜合利用研究，將提取魚油后的魷魚肝臟蛋白用丙酮處理除脂，用胃蛋白酶進(jìn)行酶解，并對(duì)其酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，并將酶解液進(jìn)行超濾處理、凝膠過濾層析、DEAE陰離胃子交換、RP-HPLC等方法分離純化ACE抑制肽，制得的ACE抑制肽在溫度2 100°C、pH值1 12之間對(duì)ACE的抑制活性基本沒有變化，比較穩(wěn)定，而且模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)對(duì)組分的ACE抑制活性的影響不大，經(jīng)過胃腸消化后仍具有較高的ACE抑制活性。本方法不僅工藝合理，易控制易操作，而且減少了廢物排放，變廢為寶，制得的ACE抑制肽可應(yīng)用于開發(fā)具有降血壓功能食品及醫(yī)藥領(lǐng)域。


圖1是底物濃度對(duì)酶解液水解度和ACE抑制活性的影響曲線圖；圖2是酶解時(shí)間對(duì)酶解液水解度和ACE抑制活性的影響曲線圖；圖3是酶與底物比對(duì)酶解液水解度和ACE抑制活性的影響曲線圖；圖4是胃蛋白酶酶解液在kphadex G-50上的洗脫圖；圖5是溫度對(duì)組分B抑制活性影響曲線圖；圖6是pH對(duì)組分B的抑制活性影響曲線圖；圖7是組分B在DEAE陰離子交換柱上的洗脫圖；圖8是F組分在kphadex LH-20上的洗脫圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。一種利用魷魚肝臟蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽的方法，具體包括以下步驟1、采取丙酮浸提法提取魷魚肝臟蛋白按1 1.5比例加水，充入氮?dú)鈒Omin，并加入占油量0.2%的L-抗壞血酸-6-棕櫚酸酯防止氧化，放入高壓鍋中，高溫高壓(121°C，0. 5Mpa)處理20min，然后在8000rpm/ min條件下離心30min，最上層為魚油層，離心魚油后，用丙酮洗滌數(shù)次，將組織迅速脫水制成丙酮粉，真空干燥即得脫脂魷魚肝臟蛋白；2、用胃蛋白酶酶解魷魚肝臟蛋白在水解溫度36 °C，pH為1. 5-2. 5，酶與底物的比為2 %，底物濃度為2. 5%條件下水解魷魚肝臟蛋白20h ；3、將得到的魷魚肝臟蛋白酶解液采用超濾裝置將魷魚肝臟蛋白酶解液進(jìn)行超濾， 濾膜為截留分子量小于等于IOOOODa ；將截留液用蒸餾水稀釋后繼續(xù)超濾，合并收集的超濾液并進(jìn)行冷凍干燥；4、將超濾后的產(chǎn)G-50凝膠柱初步分離，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速為 0. 5mL/min,紫外檢測(cè)儀HD2-CA，檢測(cè)波長^Onm ；并測(cè)定各肽峰抑制ACE的活性。5、選取活性高的組分用DEAE陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，用水洗脫，再用0 lmol/L NaCl溶液進(jìn)行線性洗脫，流速為24mL/h，并測(cè)定各肽峰抑制ACE的活性。6、將純化后得到的活性高的組分用kphadex LH-20繼續(xù)分離純化，洗脫液為 30%的甲醇溶液，流速為24mL/h，并測(cè)定各肽峰抑制ACE的活性。7、采用反相高效液相色譜C18柱檢測(cè)純度，洗脫液甲為含0.01% TFA的水，洗脫液乙為含0. 01 % TFA的乙腈溶液，先用5%的甲液洗脫，再用洗脫梯度為95%乙液洗脫，流速為24mL/h，及制得ACE抑制肽。以下對(duì)胃蛋白酶酶解魷魚肝臟蛋白酶解條件的優(yōu)化及ACE抑制活性分析做詳細(xì)說明。—、胃蛋白酶酶解魷魚肝臟蛋白酶解條件的優(yōu)化1、底物濃度的優(yōu)化水解溫度為36°C，pH為2.0，酶與底物的比為2%，分別在底物濃度為1^^2.5%, 5.0%,7. 5 ^UOW條件下水解魷魚肝臟蛋白Mh，檢測(cè)酶解液的水解度和對(duì)ACE的抑制活性。如圖1所示，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低(1% 2. 5% )時(shí)，酶與底物結(jié)合幾率較少，反應(yīng)速度較低，導(dǎo)致水解度較低。適當(dāng)增加底物濃度有利于反應(yīng)速度的升高即水解度的升高。但底物濃度達(dá)2. 5%以后，隨著濃度的進(jìn)一步升高，水解度反而呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)榈孜餄舛容^大時(shí)在不斷受熱情況下，蛋白分子易于產(chǎn)生交聯(lián)聚合現(xiàn)象。使蛋白酶分子與底物蛋白分子之間的接觸機(jī)會(huì)減少，且溶解性差，黏度增大，反而影響反應(yīng)速度，從而導(dǎo)致水解度下降。 而且從圖1可以看出底物濃度的變化對(duì)抑制ACE活性的影響不大，因此實(shí)驗(yàn)中選擇2. 5%為酶解反應(yīng)的底物濃度。2、酶解時(shí)間的優(yōu)化 水解溫度為36°C，pH為2. 0，以酶與底物的比為2 %，底物濃度為2. 5 %的條件酶解魷魚肝臟蛋白，分別酶解2、4、8、12、20、24、32h，檢測(cè)酶解液的水解度和對(duì)ACE的抑制活性。如圖2所示，在前20h水解度隨著時(shí)間的延長而顯著增加，但在20h后，水解度隨時(shí)間的延長幾乎沒有變化。而且時(shí)間的延長對(duì)抑制ACE活性的影響也不大，因此實(shí)驗(yàn)中選用酶解時(shí)間為20h。3、酶與底物比的優(yōu)化水解溫度為36°C，pH為2. 0，底物濃度為2. 5%，分別在酶與底物的比0%、0. 5%、 1.0%,2%,2. 5^^5%條件下水解魷魚肝臟蛋白20h，檢測(cè)酶解液的水解度和對(duì)ACE的抑制活性。
酶解液的水解度隨著酶與底物比的增加而增加。當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，底物的水解度取決于酶的濃度，理論上講，酶分子越多，水解度就會(huì)越來越大，但圖3顯示，酶濃度較低時(shí)，水解度增長很快，當(dāng)酶與底物比達(dá)2%時(shí)，水解度變化很小，這是因?yàn)槊笣舛容^高，與蛋白質(zhì)分子肽鏈的接觸機(jī)率越多，則底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物可溶性肽也就相應(yīng)地增加。但當(dāng)酶與底物比較高時(shí)，蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度較低，酶分子已過飽和，有一部分酶分子將不能與蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致水解度隨著酶與底物比的升高而緩慢上升。同樣，隨著酶與底物比的變化對(duì)抑制 ACE活性的影響也不大，因此實(shí)驗(yàn)中選擇2%為酶與底物的比。用胃蛋白酶酶解魷魚肝臟蛋白的酶解條件最終確定為底物濃度2. 5%，酶與底物比為2%，在36°C條件下酶解20h。二、ACE抑制肽的初步分離及其ACE抑制活性分析1、用kphadex G-50初步分離ACE抑制肽采用凝較過濾分離法分離魷魚肝臟蛋白酶解的產(chǎn)物。凝較過濾是以被分離物質(zhì)的分子量差異為基礎(chǔ)的一種層析方法，此類層析的固相載體是具有分子篩作用的凝膠。本實(shí)驗(yàn)中使用的是葡聚糖凝膠。葡聚糖凝膠是由一定平均分子量的葡聚糖和甘油基相互交聯(lián)形成的三維空洞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)眼的大小決定了被分離物質(zhì)能夠自由出入凝膠內(nèi)部的分子量范圍。S印hadex G-50的分離范圍是IOOODa 30000Da分子量。用S^)hadex G-50初步分離魷魚肝臟蛋白酶解液，用30%的甲醇作為洗脫液，以24mL/h的恒速進(jìn)行洗脫，如圖4所示， 有5個(gè)主要的峰(A，B，C，D，F(xiàn))被檢測(cè)到，對(duì)每個(gè)峰分別收集、真空濃縮、冷凍干燥后測(cè)定其對(duì)ACE的抑制活性。如表1所示，第A，B，C區(qū)洗脫下來的蛋白具有ACE抑制活性，其IC5tl分別為 2. 26mg/mLU. 80mg/mL、5. 08mg/mL。結(jié)果表明分子量較大的多肽具有較好的ACE抑制活性。 選取粗分物中活性最高的組分B，對(duì)ACE抑制活性相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析。表ISephadex G-50初步分離各片斷ACE抑制活性和回收率
權(quán)利要求
1.一種利用魷魚肝臟蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的方法，其特征在于包括以下步驟1)采取丙酮浸提法提取魷魚肝臟蛋白將魷魚肝臟與水按質(zhì)量比1 1 1 1.5混合，充入氮?dú)?0 20分鐘，加入占魷魚肝臟重量0. 1 0. 5 %的L-抗壞血酸-6-棕櫚酸酯抗氧劑，放入高壓鍋中處理20 30min，離心處理，除去上層魚油，用丙酮洗滌數(shù)次，將組織脫水制成丙酮粉，真空干燥即得脫脂魷魚肝臟蛋白；2)用胃蛋白酶酶解魷魚肝臟蛋白以脫脂魷魚肝臟蛋白為底物，在水解溫度35 38°C，pH為1. 5-2. 5，酶與底物的比為2 3%，底物濃度為1 3%條件下水解魷魚肝臟蛋白18 25h，其中百分比為質(zhì)量百分比；3)將得到的魷魚肝臟蛋白酶解液進(jìn)行超濾處理；4)將超濾后的產(chǎn)物用kphadexG_50凝膠柱初步分離，得到粗分物的ACE抑制肽；5)在粗分物的ACE抑制肽中選取活性高的組分用DEAE陰離子交換柱進(jìn)行分離純化；6)將純化后得到的活性高的組分用kphadexLH-20繼續(xù)分離純化；7)最后檢測(cè)純度，得到血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1中離心處理工藝為4000 10000rpm/min 處理 20 40min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟3的超濾處理的過程為1)采用超濾裝置將魷魚肝臟蛋白酶解液進(jìn)行超濾，濾膜為截留分子量IkDa 30kDa。2)將截留液用蒸餾水稀釋后繼續(xù)超濾，合并收集的超濾液并進(jìn)行冷凍干燥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟4的凝膠柱初步分離的工藝為 用蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速為20 40mL/h，并測(cè)定各肽峰抑制ACE的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的凝膠柱中凝膠采用葡萄糖凝膠，分離的分子量為IkDa lOkDa。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟5的分離純化具體過程為選取活性高的組分上樣先用水洗脫，再用0 lmol/L NaCl溶液進(jìn)行線性洗脫，流速為20 28mL/h,并測(cè)定各肽峰抑制ACE的活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟6的分離純化工藝條件為洗脫液為25 35% (wt)的甲醇溶液，流速為20 ^mL/h，并測(cè)定各肽峰抑制ACE的活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟7的檢測(cè)純度是采用反相高效液相色譜C18柱檢測(cè)純度，洗脫液甲為含0. 01% 0. 03% TFA的水，洗脫液乙 為含0. 01% 0. 03 % TFA的乙腈溶液，先用5 % 10 %的甲液洗脫，再用洗脫梯度為95 % 98 %乙液洗脫，流速為20 24mL/h，采用體積濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述高壓鍋采用115 125°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用魷魚肝臟蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的方法，包括將提取魚油后的魷魚肝臟蛋白用丙酮處理除脂，選用胃蛋白酶在在水解溫度35～38℃，pH為1.5～2.5，酶與底物的比為2～3％，底物濃度為1～3％條件下水解魷魚肝臟蛋白18～25h；將酶解液進(jìn)行超濾處理后，跟蹤其ACE抑制活性，應(yīng)用凝膠過濾層析、DEAE陰離胃子交換、RP-HPLC等方法分離純化ACE抑制肽，制得的ACE抑制肽在溫度2～100℃、pH值1～12之間對(duì)ACE的抑制活性基本沒有變化，比較穩(wěn)定，而且模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)對(duì)組分的ACE抑制活性的影響不大，經(jīng)過胃腸消化后仍具有較高的ACE抑制活性。本方法不僅工藝合理，易操作，而且減少了廢物排放，變廢為寶，制得的ACE抑制肽可應(yīng)用于開發(fā)具有降血壓功能食品及醫(yī)藥領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C07K14/435GK102250994SQ201010177329
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者丁璞, 謝超, 霍建聰 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院