一種酶法拆分阿巴卡韋手性中間體文斯內酯的方法【專利摘要】本發明公開了一種酶法拆分阿巴卡韋手性中間體文斯內酯的方法，催化劑采用脂肪酶YCJ01，具體包括如下步驟：耐有機溶劑脂肪酶YCJ01在有機相中，催化底物N?羥甲基文斯內酯和乙酸乙烯酯進行轉酯反應，高效拆分N?羥甲基文斯內酯。本發明采用來自于BurkholderiaambifariaYCJ01的具有獨特底物特異性和立體選擇性的耐有機溶劑脂肪酶YCJ01來催化拆分N?羥甲基文斯內酯，能夠達到很好的拆分效果，并獲得高純度的單一對映體。【專利說明】一種酶法拆分阿巴卡韋手性中間體文斯內酯的方法
技術領域：
[0001]本發明涉及生物催化工程研究領域，具體涉及一種可以作為醫藥中間體的文斯內酯的手性拆分工藝。【
背景技術：
】[0002]本發明所涉及的文斯內酯，是制備碳環核苷類藥物的重要手性中間體。化學名稱為2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，分子量為109.13，結構式為：[0004]目前，碳環核苷類化合物在核苷類藥物中的重要性與日倶增，在已經公開的抗病毒藥物中核苷類藥物占絕大多數。由光學純的（1R，4S)_文斯內酯出發合成的藥物主要有抗HIV藥物阿巴卡韋，由（1S，4R)_文斯內酯出發合成的主要有抗流感藥物帕拉米韋。阿巴卡韋是治療艾滋病和皰疹病毒感染的藥物，也是"雞尾酒療法"中的關鍵藥物組成成分。目前世界上艾滋病發展趨勢日趨嚴重，阿巴卡韋具有廣闊的市場前景，銷量正在逐年遞增。此外，近年來全球爆發了數次流感疫情。在這種情況下，繼續研究開發新型高效、副作用小的抗流感藥物迫在眉睫。帕拉米韋是一種新型的抗流感病毒藥物，能有效抑制各種流感病毒株的復制和傳播過程，耐受性好、毒性小。研究表明，帕拉米韋在禽流感方面的治療效果比"達菲"更加明顯。因而拆分外消旋文斯內酯具有重要的經濟價值和社會價值。[0005]目前報道的文斯內酯的拆分方法主要有兩種，不對稱合成法、酶法拆分。FranciscoVelazquez等（Theapplicationofchiraloxazolidinethionesandthiazolidinethionedinasymmetricsynthesis.CurrentOrganicChemistry，2002，[6]:1-38)首先利用不對稱合成法來制備單一構型的文斯內酯，但該方法存在很大的弊端，步驟煩瑣，成本高，不利于工業化生產。酶法主要有采用γ-內酰胺酶催化水解拆分(+/_)γ-內酰胺（即文斯內酯）以及利用脂肪酶催化拆分文斯內酯。TalorStephen等(Developmentofthebiocatalyticresolutionof2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5en-3-oneasanentrytosingle-enantiomercarbocyclicnucleosides.Tetrahedron:Asy_dtry，1993,4(6):1117-1118)利用內酰胺酶對拆分文斯內酯的效果進行了研究，他們通過完整細胞轉化實驗，達到了良好的拆分效果，并分離得到了兩種分別可以專一性水解一種對映體的酶。但該方法會造成另一種單一對映體的浪費以及限制了最大的理論量。Brabban(R.Stereospecificy-lactamaseactivityinaPseudomonasfluoreseensspecies.JIndMicrobiol，1996，16(1):8-14)和Mahmoudian等（ApracticalenzymicprocedureforresolutionofN-substituted2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-ones·Tetrahedron:Asy_dtry，1999，10(6):1201-1206)利用乙醜苯丙氛酸為唯一碳源篩選得到了產γ-內酰胺酶菌株，并應用于拆分γ-內酰胺。但是采用γ-內酰胺酶催化水解拆分文斯內酯仍然存在一些問題，高效率、高穩定性的適于工業化生產的γ-內酰胺酶不易尋找，拆分反應存在副產物γ-氨基丁酸，尚未見產業化報道，因此該方法并不是最優的方法。HirotoNakano等（Hiroto，Ν·，Kazuto，I.，Yuko，0·，Hiroshi，H.Lipase_catalyzedresolutionof2-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-〇nes.Tetrahedron:Asymmetry.1996,7:2381-2386)首先利用脂肪酶對(+/-)γ-內酰胺（即文斯內酯)進行了拆分，由于脂肪酶的立體選擇性，它只催化拆分消旋體中的一種，從而達到了拆分，但該方法底物濃度不高，拆分效果一般。【
發明內容】[0006]本發明目的在于克服現有技術的不足，提供一種利用酶法制備阿巴卡韋重要手性中間體文斯內酯的方法。[0007]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：[0008]選用耐有機溶劑脂肪酶YCJ01催化拆分阿巴卡韋手性中間體文斯內酯。所選用脂肪酶YCJ01已公開在同一發明人的在先授權專利CN102329745B中，產脂肪酶YCJ01菌株保藏登記號CCTCCN0:M2011058。[0009]脂肪酶YCJ01催化拆分阿巴卡韋手性中間體文斯內酯步驟具體如下：[0010](1)向密封瓶中加入N-羥甲基文斯內酯，酰基供體，有機溶劑和脂肪酶YCJ01，置于搖床中反應。[0011](2)反應結束后，過濾反應液，濾液用乙醚萃取三次，合并有機相，之后過柱純化，加入無水硫酸鈉干燥，獲得（1S，4R)-N-羥甲基文斯內酯固體，將（1S，4R)-N-羥甲基文斯內酯固體溶于甲醇后，加入ΝΗ40Η，室溫條件下攪拌后，經旋轉蒸發除去溶劑，之后過柱純化，真空干燥得淡黃色固體，即為(1S，4R)_文斯內酯。[0012]其中搖床轉速設定為180rpm/min。[0013]其中反應底物外消旋體N-羥甲基文斯內酯采用化學法制備，具體制備方法參考HirotoNakano等的文南犬（ElirotoNakano,Kazutolwasa,YukoOkuyanm,andHiroshiHongo.Lipase-catalyzedresolutionof2-azabicyclo[2.2.l]hept-5-en-3-ones.Tetrahedron:Asymmetry.1996,7:2381-2386)，N_輕甲基文斯內酯最終產率為85%。[0014]本發明的反應式如下：[0016]其中，所述步驟（1)中脂肪酶YCJ01拆分在有機相中進行，所述有機溶劑可為單組分或雙組分。所述有機溶劑采用單組分時，選自環己烷、甲苯、異丙醇、甲基叔丁基醚、正己烷或丙酮中的一種，優選甲基叔丁基醚。[0017]當脂肪酶拆分在雙組分有機溶劑中進行時，固定雙組分中的其中一個組分為甲基叔丁基醚，另一組分為環己烷、甲苯、異丙醇、正己烷或丙酮;雙組分有機溶劑優選甲基叔丁基醚和正己烷，其中正己烷在混合液中的體積濃度(V/V)為0%-40%，優選5%-15%，更優選10%〇[0018]所述步驟（1)中酰基供體選自乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、戊酸乙烯酯、己酸乙烯酯中的一種。優選的，所述酰基供體采用乙酸乙烯酯，所述乙酸乙烯酯的濃度為200~2000mM，優選1000~1400mM。[0019]所述步驟（1)中耐有機溶劑脂肪酶YCJ01的用量為50~250U/ml，優選125~150U/ml，更優選150U/ml。[0020]所述步驟（1)中N-輕甲基文斯內酯濃度為50~600mM，優選300~350mM。[0021]所述步驟⑴中N-羥甲基文斯內酯和乙酸乙烯酯的反應濃度摩爾比為1:1~10,優選1:1~5,更優選1:4。[0022]所述步驟（1)中，反應體系在搖床中反應溫度為10~50°C，優選25°C~40°C，更優選32~37°C;反應時間為6~24h，優選12h。[0023]采用本發明所述的方法拆分文斯內酯，轉化率達49.9~50.1%，產物（1R，4S)-N-羥甲基文斯內酰胺酯的eeP值彡99.0%;拆分后其中剩余底物（1S，4R)-N-羥甲基文斯內酯的ees值彡99.2%〇〇[0024]本發明的有益效果在于使用來自于BurkholderiaambifariaYCJ01的具有獨特底物特異性和立體選擇性的耐有機溶劑脂肪酶YCJ01來催化拆分N-羥甲基文斯內酯，并對其各個條件進行了優化，并篩選出了適合于使用脂肪酶YCJ01手性拆分N-羥甲基文斯內酯的生產條件。此方法步驟簡單，無副產物，所使用的脂肪酶YCJ01立體選擇性高，不但可以保證有比較高的收率，而且保證最終手性產品的ee值達到99%以上，達到了很好的拆分效果。[0025]本發明所使用的自主知識產權的脂肪酶立體選擇性高，應用于催化外消旋底物N-羥甲基文斯內酯的拆分反應，拆分后底物（1S，4R)-N-羥甲基文斯內酯ees值彡99%;產物(1R，4S)-N-羥甲基文斯內酰胺酯eeP值彡99%。本發明的工藝路線具有較好的經濟性和技術可行性，具備一定的科研與實用意義。【具體實施方式】[0026]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但并不限制本發明。[0027]本發明所述的耐有機溶劑脂肪酶YCJ01來自于Burkholderia，所選用脂肪酶YCJ01已公開在同一發明人的在先授權專利CN102329745B中，產脂肪酶YCJ01菌株保藏登記號CCTCCN0：M2011058〇[0028]脂肪酶YCJ01的粗酶粉制備參考Yao等的文獻（AnorganicsolventandthermallystablelipasefromBurkholderiaambifariaYCJ01:Purification,characteristicsandapplicationforchiralresolutionofmandelicacid)。[0029]實施例1[0030]向4ml的密封瓶中加入質量為83.4mg，濃度為300mmol的N-羥甲基文斯內酯，222μ1濃度為1200mmol的乙酸乙烯酯和2ml甲基叔丁基醚(包含10%體積的正己烷)和30mg脂肪酶YCJ01，置于搖床中反應。搖床反應溫度為35°C，搖床轉速為180rpm/min，反應12h。[0031]反應結束后，過濾反應液，濾液用乙醚萃取劑約12ml，分3次萃取，合并有機相，之后過柱子純化，加入400mg無水硫酸鈉干燥2h，獲得（1S，4R)-N-羥甲基文斯內酯固體，將其溶于10ml甲醇后，加入lmlNH40H，室溫條件下攪拌12h后，經旋轉蒸發除去溶劑，之后過柱純化，真空干燥得淡黃色固體，即為(1S，4R)_文斯內酯。[0032]反應的轉化率C%為50.1%，eeP%S99.0%，eesS99.2%。[0033]實施例2[0034]本實施例反應體系中的底物濃度為:300mM的N-羥甲基文斯內酯，200mM的乙酸乙烯酯，并加入30mg脂肪酶YCJ01，在2ml甲基叔丁基醚(包含10%體積的正己烷）中置于35°C、180rpm的搖床中反應6h。實驗操作步驟同實施例1中的步驟。具體的結果如下：[0035][0036]實施例3[0037]本實施例反應體系中的底物濃度為:300mM的N-羥甲基文斯內酯，2000mM的乙酸乙烯酯，并加入30mg脂肪酶YCJ01，在2ml甲基叔丁基醚(包含10%體積比的正己烷）中置于35°C、180rpm的搖床中反應24h。實驗操作步驟同實施例1中的步驟。具體的結果如下：[0038][0039]實施例4[0040]本實施例反應體系中的底物濃度為:300mM的N-羥甲基文斯內酯，1400mM的乙酸乙烯酯，并加入30mg脂肪酶YCJ01，在2ml甲基叔丁基醚(包含10%體積比的正己烷）中置于35°C、180rpm的搖床中反應12h。實驗操作步驟同實施例1中的步驟。具體的結果如下：[0041][0042]實施例5[0043]本實施例反應體系中的底物濃度為:300mM的N-羥甲基文斯內酯，lOOOmM的乙酸乙烯酯，并加入30mg脂肪酶YCJ01，在2ml甲基叔丁基醚(包含10%體積比的正己烷）中置于35°C、180rpm的搖床中反應12h。實驗操作步驟同實施例1中的步驟。具體的結果如下：[0044][0045]實施例6:有機溶劑對N-輕甲基文斯內酯酶促拆分的影響[0046]實施例6采用和實施例1同樣的實驗步驟，對有機溶劑種類對N-羥甲基文斯內酯酶粗拆分的影響進行了討論。[0047]由于有機溶劑可以通過改變酶蛋白分子的動態移動性及構象，從而顯著影響酶的活性及立體選擇性，所以在有機相中進行酶促反應時，選擇合適的有機溶劑是十分必要的。相關研究表明有機溶劑對酶活性及立體選擇性的影響大小主要與溶劑的極性（logP)有關，因此同時根據脂肪酶YCJ01對有機溶劑的耐受性，選擇環己烷、甲苯、異丙醇、甲基叔丁基醚、環己烷和丙酮作為溶劑，考察它們對N-羥甲基文斯內酯拆分效果的影響。在本實施例中，底物N-羥甲基文斯內酯的濃度為100禮，乙酸乙烯酯的濃度為500禮，分別選取以上幾種有機溶劑，在35°C條件下反應12h來催化拆分N-羥甲基文斯內酯，其中耐有機溶劑脂肪酶的用量為lOOU/ml。具體的拆分效率與不同有機溶劑的關系為：[0048]表1.不同有機溶劑對N-輕甲基文斯內酯拆分的影響[0051]由此可見，甲基叔丁基醚最適合作為脂肪酶YCJ01催化N-羥甲基文斯內酯轉酯反應的反應介質。在極性較強的溶劑中，酶通常不會有太高的活力，并且通常反應體系需要較高的水活度才能保持酶分子的適當活性構象，從而使酶表現出一定的催化活力。此外，有的有機溶劑還可能滲透到酶的活性中心從而改變酶的構像，進而影響酶的性能。以甲基叔丁基醚作為反應溶劑效果佳，故而進一步通過條件的進一步優化來提高拆分效率。[0052]實施例7:兩種底物濃度摩爾比對N-輕甲基文斯內酯酶促拆分的影響[0053]在酶促反應體系中，底物濃度的變化會影響酶的催化活性及立體選擇性，而底物濃度的變化可以通過改變反應體系中兩種底物的摩爾濃度比來實現。通常在此類反應中，過量的乙酸乙烯酯可以防止產物酯的水解，從而提高了反應平衡以及增加理論最大的產品產量。本實驗中固定N-羥甲基文斯內酯的摩爾濃度為100mM，通過改變乙酸乙烯酯的摩爾濃度來調節兩種底物的摩爾濃度比(N-羥甲基文斯內酯與乙酸乙烯酯摩爾濃度比為1:1~6)，選取甲基叔丁基醚作為反應溶劑，在35°C條件下反應12h來催化拆分N-羥甲基文斯內酯，其中耐有機溶劑脂肪酶的用量為l〇〇U/ml。具體的拆分效率與不同摩爾濃度比的關系為：[0054]表2:不同底物摩爾濃度比對N-輕甲基文斯內酯拆分的影響[0057]由此可見，脂肪酶YCJ01的催化活力隨乙酸乙烯酯與N-羥甲基文斯內酰胺的摩爾濃度比的增加而增大，當比值為4:1時達到最大，繼續增大摩爾濃度比，隨著乙酸乙烯酯濃度的增大，催化活力逐漸降低。[0058]實施例8:催化劑用量對N-輕甲基文斯內酯酶促拆分的影響[0059]脂肪酶催化非對稱轉酯反應時的催化活力和立體選擇性在很大程度上受用酶量的影響。本實驗針對甲基叔丁基醚中脂肪酶YCJ01的用量對N-羥甲基文斯內酯的轉酯反應的影響進行了研究。本實驗中底物N-羥甲基文斯內酯的濃度為100mM，乙酸乙烯酯的濃度為400mM，選取甲基叔丁基醚作為反應溶劑，在35°C條件下反應12h來催化拆分N-羥甲基文斯內酯，脂肪酶YCJ01的用量分別為10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg。具體的加酶量對N-羥甲基文斯內酯拆分的影響關系為：[0060]表3:不同加酶量對N-輕甲基文斯內酯拆分的影響[0062]由此可見，在50~200U/ml的用酶量范圍內，隨著酶量的增加，脂肪酶YCJ01的催化活性升高，且在用酶量為125~150U/ml時活性達到最大，超過150U/ml時活性提高甚微。原因可能是當用酶量較少時，酶與底物碰撞機會小，導致酶活不高，隨著用酶量的增加，酶與底物碰撞幾率增大，使酶的活性增大，而加酶量超過一定值時，與底物接觸的酶已達飽和，所以酶活力幾乎不再提高。因此采用125~150U/ml作為后續的實驗用酶量。[0063]實施例9:酰基供體對N-輕甲基文斯內酯酶促拆分的影響[0064]脂肪酶催化動力學拆分過程中，乙烯酯類酰化試劑具有重要的作用，它通常在脂肪酶催化的手性醇的轉酯反應中作為酰基供體，先與酶形成酰基復合體，而后酰基酶復合體優先與手性醇中的某一對映體結合，將其酯化，從而達到拆分手性醇的目的。酰基供體的鏈長不同造成的位阻差異會引起脂肪酶的立體選擇性發生改變。本實驗選擇了5種不同鏈長的酰基供體，對N-羥甲基文斯內酯的轉酯反應的影響進行了研究。本實驗中底物N-羥甲基文斯內酯的濃度為l〇〇mM，酰基供體的濃度為400mM，選取甲基叔丁基醚作為反應溶劑，在35°C條件下反應12h來催化拆分N-羥甲基文斯內酯，脂肪酶YCJ01的用量為150U/ml。不同鏈長的酰基供體對N-羥甲基文斯內酯拆分的影響關系為：[0065]表4:不同鏈長的酰基供體對N-輕甲基文斯內酯拆分的影響[0066][0067]由此可見，中等長度鏈長的酰基供體對脂肪酶YCJ01拆分N-羥甲基文斯內酯的效果比較好，當丁酸乙烯酯作為酰基供體時，脂肪酶YCJ01的催化拆分效果最好。但隨著鏈長的增加，其催化效果明顯降低。因此，中等長度鏈長的酰基供體是脂肪酶YCJ01的最佳作用底物。由于乙酸乙烯酯，丙酸乙烯酯及丁酸乙烯酯對脂肪酶YCJ01的催化活性及立體選擇性的影響相差不大，而乙酸乙烯酯價格相對低廉。從經濟層面考慮，選擇乙酸乙烯酯作為脂肪酶YCJ01催化N-羥甲基文斯內酯反應的酰基供體。[0068]實施例10:雙組分混合有機溶劑對N-輕甲基文斯內酯酶促拆分的影響[0069]有機溶劑耐受性是衡量脂肪酶催化活性的重要特征之一。非水相體系中的酶催化不僅取決于酶的性質，同時與所選有機溶劑也密切相關。相關研究表明，使用雙組分有機溶劑作為反應介質對底物熱力學活度和反應活化能有重要影響。因此固定雙組分中的其中一個組分為甲基叔丁基醚。雙組分有機溶劑選自甲基叔丁基醚和環己烷，甲基叔丁基醚和甲苯，甲基叔丁基醚和異丙醇，甲基叔丁基醚和正己烷，甲基叔丁基醚和丙酮中的一種。本實驗對不同的雙組分溶劑對酶促拆分的影響進行了研究，為了保證實驗的可行性，其中甲基叔丁基醚的含量設定為90%，另一有機溶劑含量為10%，底物N-羥甲基文斯內酯的濃度為1OOmM，乙酸乙烯酯的濃度為400mM，在35°C條件下反應12h來催化拆分N-羥甲基文斯內酯，脂肪酶YCJ01的用量為150U/ml。不同的雙有機溶劑組分對N-羥甲基文斯內酯拆分的影響關系為：[0070]表5:不同雙有機溶劑組分對N-輕甲基文斯內酯拆分的影響[0071][0072]由此可見，當雙有機溶劑組分選擇甲基叔丁基醚和正己烷時，反應效果最好。為了更進一步的提高反應效率，在其他條件不變的情況下，對不同含量的正己烷進行了研究，具體結果如下：[0073]表6:不同含量正己烷對N-輕甲基文斯內酯拆分的影響[0076]由此可見，當往反應體系中添加10%正己烷時，脂肪酶YCJ01催化拆分N-羥甲基文斯內酯效果最佳。同時可以看出，采用雙有機溶劑體系確實提高了催化效率。原因可能是脂肪酶YCJ01在正己烷中具有非常好的耐受性，脂肪酶的穩定性比較好。有研究表明在疏水性較強溶劑中酶的催化活力和對映體選擇性較高。與此同時，雙組分有機溶劑中進行酶促酯化反應，對反應的活化能有一定的影響，同時也會影響脂肪酶的催化活性。[0077]實施例11:反應溫度對N-輕甲基文斯內酯酶促拆分的影響[0078]酶的生物本質為蛋白質，因此溫度對酶催化的反應必然有很大的影響。相關研究表明，溫度不僅可以影響酶的活性，有時還可能會影響酶的立體選擇性。本實驗研究了不同的溫度對N-羥甲基文斯內酯酶促拆分的影響。本實驗中底物N-羥甲基文斯內酯的濃度為100mM，酰基供體的濃度為400mM，選取甲基叔丁基醚和正己烷(9:lv/v)雙組分有機溶劑作為反應溶劑，在不同的溫度條件下反應12h來催化拆分N-羥甲基文斯內酯，脂肪酶YCJ01的用量為150U/ml。不同溫度對N-羥甲基文斯內酯拆分的影響關系為：[0079]表7:不同反應溫度對N-輕甲基文斯內酯拆分的影響[0081]由此可見，隨著反應溫度的升高，脂肪酶YCJ01的催化效率隨之升高，但當溫度到達35°C之后，隨著溫度的升高，脂肪酶的催化效率趨于不變。從該反應中酶的催化活力與立體選擇性以及經濟節能方面考慮，選擇32~40°C作為有機相中脂肪酶YCJ01催化N-羥甲基文斯內酯酶促拆分的反應溫度。[0082]實施例12:底物N-輕甲基文斯內酯濃度對酶促拆分的影響[0083]由于過多的底物對于酶具有抑制作用，所以N-羥甲基文斯內酯的濃度對于脂肪酶YCJ01的拆分效率具有很大的影響。本實驗中兩種底物濃度摩爾比(N-羥甲基文斯內酯與乙酸乙烯酯摩爾濃度比）為1:4，N-羥甲基文斯內酯的濃度分別為100mM，200mM，300mM，400mM，500mM，600mM在35°C條件下反應12h來催化拆分N-羥甲基文斯內酯，脂肪酶YCJ01的用量為150U/ml。不同濃度的N-羥甲基文斯內酯對拆分的影響關系為：[0084]表8:不同濃度N-輕甲基文斯內酯對拆分的影響[0085][0086]由此可見，當N-羥甲基文斯內酯濃度小于300mM時，脂肪酶YCJ01催化拆分的效率很高且相差不大。但當N-羥甲基文斯內酯的濃度超過300mM時，脂肪酶YCJ01催化拆分的效率逐漸下降，因此選取300~350mM作為最優的底物濃度，提高底物濃度，有利于擴大化生產。[0087]基于以上原因，脂肪酶YCJ01能夠在較高底物濃度下實現高效拆分N-羥甲基文斯內酯。拆分反應結束后，產物為（1R，4S)-N-羥甲基文斯內酰胺酯，eeP值彡99.0%，底物為(15,41〇4-羥甲基文斯內酯，^值彡99.2%，達到了很好的拆分效果。并且為以后使用脂肪酶YCJ01催化拆分手性物質提供了一種方法。最后，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。【主權項】1.一種酶法拆分阿巴卡韋手性中間體文斯內酯的方法，其特征在于:采用耐有機溶劑脂肪酶YCJO1催化拆分N-羥甲基文斯內酯，具體步驟如下：(1)向密封瓶中加入N-羥甲基文斯內酯，酰基供體，有機溶劑和脂肪酶YCJ01，置于搖床中反應；(2)過濾反應液，濾液用乙醚萃取三次，合并有機相，之后過柱純化，加入無水硫酸鈉干燥，獲得（1S，4R)-N-羥甲基文斯內酯固體;將（1S，4R)-N-羥甲基文斯內酯固體溶于甲醇后，加入ΝΗ40Η，室溫條件下攪拌后，經旋轉蒸發除去溶劑，之后過柱純化，真空干燥得淡黃色固體，即為（1S，4R)_文斯內酯。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述有機溶劑采用單組分或雙組分;選用單組分有機溶劑時，所述有機溶劑選自正己烷、環己烷、甲苯、異丙醇、甲基叔丁基醚、或丙酮中的一種;選用雙組分有機溶劑時，固定雙組分中的其中一個組分為甲基叔丁基醚，另一組分為環己烷、甲苯、異丙醇、正己烷或丙酮。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述有機溶劑為雙組分有機溶劑，所述有機溶劑為甲基叔丁基醚和正己烷，其中正己烷在混合液中的體積濃度(v/v)為0%-40%，優選5%-15%，更優選10%。4.根據根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述有機溶劑為單組分有機溶劑，所述單組分有機溶劑為甲基叔丁基醚。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酰基供體選自乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、戊酸乙烯酯、己酸乙烯酯中的一種。6.根據權利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述酰基供體為乙酸乙烯酯，所述乙酸乙烯酯的濃度為200~2000mM，優選1000~1400mM。7.根據根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐有機溶劑脂肪酶YCJ01的用量為50~250U/ml，優選125~150U/ml。8.根據根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述N-羥甲基文斯內酯濃度為50~600mM，優選300~350mM。9.根據根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述N-羥甲基文斯內酯與乙酸乙烯酯的反應摩爾濃度比為1:1~10，優選1:1~5，更優選1:4。10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述搖床反應溫度為10~50°C，優選25°C>40°C，更優選32~37°C;反應時間為6~24h，優選12h。【文檔編號】C12P17/10GK105969836SQ201610310542【公開日】2016年9月28日【申請日】2016年5月11日【發明人】何冰芳,朱玲,劉可可,儲建林,吳斌【申請人】南京工業大學