專利名稱：一種生物拆分制備阿巴卡韋手性中間體的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物拆分制備阿巴卡韋手性中間體的方法，屬于生物工程技術領域。具體涉及采用Pseudomonas cepacia DSM9959固定化細胞在生物拆分制備阿巴卡韋手 性中間體中的應用。
背景技術：
聯合國艾滋病規劃署在中國上海發表的《2009年全球艾滋病流行報告》指出，截至 2009年10月31日，全球累計艾滋病感染者和艾滋病病人為3340萬例。AIDS嚴重威脅著 人類的健康和生存，已成為全球最為關注的問題之一。中國于1985年發現首例艾滋病感染 病例，截至2009年底，估計中國目前存活艾滋病感染者和病人約74萬人。面對這一嚴峻挑 戰，世界各國都在為控制艾滋病而積極地研制、開發抗艾滋病藥物。據聯合國艾滋病規劃署報告中提到，全球用于艾滋病防治的資金大幅增加。在 2007年，全球用于艾滋病防治的資金總額達100億美元，是2000年的7倍，2010年預計還需 要投入154億美元，2015年則可能需要投入225億美元。報告呼吁各國加大投入力度，并特 別呼吁發達國家進一步加大對中低收入國家應對艾滋病努力的資金扶持。國務院在《關于 切實加強艾滋病防治工作的通知》中指出，要加強新型艾滋病治療藥品的研制和生產。食品 藥品監管部門要繼續支持艾滋病治療藥品的研制與開發，加快艾滋病治療藥品審批過程， 努力推出一批安全、有效的艾滋病治療藥品?，F階段最有效的抗艾滋病藥物的主體仍為核苷類逆轉錄酶抑制劑，阿巴卡韋 (abacavir)就是這類新型具有光學活性的抗艾滋病藥物。其硫酸鹽片劑和口服液(商品名 Ziagen)有良好的抗HIV活性，生物利用度佳、交叉耐藥性較小，易滲入中樞神經系統，對細 胞色素P450酶無影響，是當今抗艾滋病“雞尾酒療法”的重要成分之一。其臨床療效高于 AZT(Zid0Vuding)，預計2010年將有超過10億美元的銷售額，有取代AZT的趨勢，其市場前 景十分看好。目前市場上進口阿巴卡韋的價格已超過10000元/Kg，按目前艾滋病治療現 狀，阿巴卡韋全世界約有每年150噸的市場需求。而我國迄今為止，尚無廠家能獨立批量生 產具有光學活性的阿巴卡韋。合成阿巴卡韋首先必須制備兩個中間體1) (1S，4R) -cis-4-氨基_2_環戊 烯-1-甲醇；2) 2-氨基-4，6-二氯-5-甲酰氨基嘧啶。兩個中間體經過縮合、環合等一系 列反應最終得到阿巴卡韋原料藥，其中手性中間體1的合成是關鍵。包括兩個中間體合成 在內，化學法合成阿巴卡韋手性的總反應步驟接近20步，而且化學法的產率和立體選擇性 都比較低，成本較高。上海瑪耀化學技術有限公司孫猛等報道了一種制造阿巴卡韋的方法，該方法以 4_氯-2-氨基-嘌呤為原料，與[(4-溴)-環戊-2-烯-1-基]甲醇反應制備關鍵中間 體{(lR，4S)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9基)環戊_2_烯_1_基}甲醇，然后再用常 規方法制造阿巴卡韋(中國專利200510029670. 7)；該公司還報道了采用4，6-二氯-5-硝 基-2-氨基-嘧啶為起始原料制備阿巴卡韋的方法(中國專利200510029671. 1)。上海中科院有機所姜標等報道了以[1R，4S] -4-氨基-2-環戊烯基-1-甲醇和2，5- 二氨基-4，6- 二 氯嘧啶為起始原料，獲得99. 9% ee值的光學純阿巴卡韋(中國專利200610027649. 8)，其 起始反應物已為手性中間體。以上方法均采用化學合成法。在生物催化法方面，北京化工大學鄭國鈞等報道了將具有內酰胺水解酶 活性的微桿菌Microbacterium hydrocarbonoxydans應用于阿巴卡韋手性中間體[1R， 4S]-2-氮雜雙環-[2，2，1]_庚烷-5-烯-3-酮的制備(中國專利200710118064. 1)，對該 菌株進行了誘變以提高酰胺水解酶活(中國專利200810056829. 8)，并對該酶進行了純化 和固定化(中國專利200910084258. 3)。袁方等采用枯草蛋白酶交聯酶晶體催化制備阿 壩卡位的關鍵手性碳環中間體(中國專利200810123861. 3)。Taylor SJC等人將來源于 Comamonas acidovorans的Y -內酰胺酶在大腸桿菌中進行重組表達，并將部分純化后的 粗酶液應用于制備上述阿巴卡韋手性中間體。目前國內外的報道中，阿巴卡韋的制備方法包括化學法和酶催化法。在酶催化法 方面，有采用微生物整體細胞、粗酶液、固定化內酰胺酶以及枯草蛋白酶交聯酶晶體進 行拆分制備阿巴卡韋手性中間體。目前的報道沒有將Pseudomonas cepacia DSM9959整體細胞進行固定化并應用于 阿巴卡韋手性中間體制備的報道。本發明采用的菌種Pseudomonas cepacia DSM9959購自 德國DSMZ菌種保藏中心，通過對P. cepacia整體細胞進行固定化，并將該固定化細胞應用 于催化外消旋底物2-氮雜雙環-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮的拆分反應，獲得光學純產物 [1R，4S] 2-氮雜雙環_[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮。與游離細胞相比，達到其50%以上的 活性。本工藝路線催化劑制備簡易，可重復利用五次以上；反應條件溫和，無需進行底物保 護；反應步驟精簡；產物的對映體過量值達99. 5%以上。本發明的工藝路線具有較好的經 濟性和技術可行性，完全可應用于實際產業化，所得阿巴卡韋產品符合企業標準要求。
外消旋2-氮雜雙環-丨2，2，1-庚烷-5-烯-3-雨[1R，4S] 2-氮雜雙環-[2,2,1)-庚烷-5-烯-3-酮

發明內容
本發明的目的在于提供一種具有內酰胺酶活性的Pseudomonas cepacia DSM9959固定化細胞的制備方法，并將該固定化細胞應用于阿巴卡韋手性中間體的工業化 制備。以下是本發明內容的詳細描述。本發明提供了一種生物拆分制備阿巴卡韋手性中間體的方法，其包含以下步驟a.固定化細胞的制備方法將l-5g卡拉膠加入20-200mL生理鹽水溶液中，煮沸溶解后冷卻至45°C左右；與 20-200mL, 10-50%的P. cepacia菌懸液(生理鹽水)混合，倒入淺盤硬化；加入0. 1-0. 5M 的KC1溶液，靜置1-10小時，生理鹽水充分沖洗后切塊，存于4°C環境中。b.固定化細胞應用于阿巴卡韋手性中間體的制備將制備好的固定化Pseudomonas c印acia細胞應用于阿巴卡韋手性中間體的制備。底物溶液為含有10-500g/L外消旋底物2-氮雜雙環-[2，2，1]-庚烷_5_烯-3-酮的 50mM pH7. 5磷酸鉀緩沖液。在200mL底物溶液加入IO-IOOg步驟a所述固定化細胞，25°C， 200rpm水浴搖床轉化24-48小時。轉化液過濾，殘留的固定化細胞用磷酸鉀緩沖液淋洗，儲 存于4°C待下批重復使用。對反應液中的產物濃度和光學純度采用手性HPLC法測定。手性HPLC法測定濃度和光學純度采用的色譜柱為 Daicel的Chiralpark AS-H，流動相乙腈異丙醇=80 20， 流速0. 6mL/min,檢測波長230nm。本發明的有益效果是采用一株具有Y-內酰胺酶活性的菌種Pseudomonas c印aciaDSM9959，對其進行整體細胞固定化，并將固定化細胞應用于催化外消旋底物2-氮 雜雙環-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮的拆分反應，以獲得制備阿巴卡韋的關鍵手性中間體 [1R，4S] 2-氮雜雙環-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮。該固定化細胞反應與游離細胞相比，可 達到其50%以上的活性。本工藝路線催化劑制備簡易，可重復利用五次以上；反應條件溫 和，無需進行底物保護；反應步驟精簡；產物的對映體過量值達99. 5%以上。本發明的工藝 路線具有較好的經濟性和技術可行性，完全可應用于實際產業化，所得阿巴卡韋產品符合 企業標準要求。
具體實施例方式實施例1.采用卡拉膠包埋的固定化方法。將3g卡拉膠加入50mL生理鹽水溶液中，煮沸 溶解后冷卻至45°C左右，與50mL 20%的Pseudomonas c印acia細胞菌懸液(生理鹽水) 混合，倒入淺盤硬化，然后加入0. 3M的KCl溶液，靜置4小時，生理鹽水充分沖洗后切塊，存 于4°C待用。2.采用卡拉膠包埋的固定化方法。將5g卡拉膠加入50mL生理鹽水溶液中，煮沸 溶解后冷卻至45°C左右，與50mL 30%的Pseudomonas c印acia細胞菌懸液(生理鹽水) 混合，倒入淺盤硬化，然后加入0. 5M的KCl溶液，靜置10小時，生理鹽水充分沖洗后切塊， 存于4°C待用。3.于500mL具塞錐形瓶中加入200mL外消旋2_氮雜雙環-[2，2，1]-庚 烷-5-烯-3-酮底物溶液，50g步驟1的固定化細胞，在25°C 200rpm水浴搖床中轉化36小 時，期間取樣手性HPLC測定。反應最終轉化率為48.3%，e.e值為99.5%。反應液過濾， 用50mM pH7. 5磷酸鉀緩沖液淋洗，得到殘留固定化細胞，待重復利用。4.于500mL具塞錐形瓶中加入200mL外消旋2_氮雜雙環-[2，2，1]-庚 烷-5-烯-3-酮底物溶液，IOg步驟1的固定化細胞，在25°C 200rpm水浴搖床中轉化24小 時，期間取樣手性HPLC測定。反應最終轉化率為44.6%，e.e值為99.5%。反應液過濾， 用50mM pH7. 5磷酸鉀緩沖液淋洗，得到殘留固定化細胞，待重復利用。5.于500mL具塞錐形瓶中加入200mL外消旋2_氮雜雙環-[2，2，1]-庚 烷-5-烯-3-酮底物溶液，IOOg步驟1的固定化細胞，在25°C 200rpm水浴搖床中轉化48 小時，期間取樣手性HPLC測定。反應最終轉化率為48.5%，e.e.值為99.5%。反應液過 濾，用50mM pH7. 5磷酸鉀緩沖液淋洗，得到殘留固定化細胞，待重復利用。6.于500mL具塞錐形瓶中加入200mL上述的底物溶液，加入步驟2的殘留固定化細胞，25°C 200rpm水浴反應36h，期間取樣手性HPLC測定。反應最終轉化率為43. 7%, e. e.值為99.5%。實驗證明，該固定化細胞經過五次重復利用，轉化率大于35%，e. e.值 大于99. 5%。對比例將培養好的Pseudomonas c印acia游離細胞直接應用于阿巴卡韋手性中間體的制 備。底物溶液為含有200g/L底物的50mMpH7. 5磷酸鉀緩沖液。于500mL具塞錐形瓶中加 入200mL外消旋2-氮雜雙環-[2，2，1]-庚烷_5_烯-3-酮底物溶液，2. 5g Pseudomonas cepacia整體細胞，在25°C 200rpm水浴搖床中轉化36小時，期間取樣，離心，手性HPLC測 定上清液組分。反應最終轉化率為47. l%，e.e.值為99.5%。相對于本發明提供的方法， 該方法所采用的游離細胞較難進行回收重復利用，最終轉化率與本發明提供的方法的轉化 率相當。
權利要求
一種生物拆分制備阿巴卡韋手性中間體的方法，其特征在于包含以下步驟a.將1-5g卡拉膠加入20-200mL生理鹽水溶液中，煮沸溶解后冷卻至45℃左右；與20-200mL，10-50％的P.cepacia菌懸液(生理鹽水)混合，倒入淺盤硬化；加入0.1-0.5M的KCl溶液，靜置1-10小時，生理鹽水充分沖洗后切塊，存于4℃環境中；b.底物溶液為含有10-500g/L外消旋2-氮雜雙環-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮的50mM pH7.5磷酸鉀緩沖液；于200mL底物溶液中加入10-100g步驟a所述的固定化細胞，在25℃200rpm水浴搖床中轉化24-48小時；反應結束后過濾，用50mM pH7.5磷酸鉀緩沖液淋洗固定化細胞，待下批反應重復利用。
全文摘要
本發明公開了一種生物拆分制備阿巴卡韋手性中間體的方法，具體涉及采用Pseudomonas cepacia DSM9959固定化細胞在生物拆分制備阿巴卡韋手性中間體中的應用。該固定化細胞的用量為5-50g/100mL反應體系，在10-500g/L外消旋2-氮雜雙環-[2，2，1]-庚烷-5-烯-3-酮底物濃度，50mM pH7.5磷酸鉀緩沖液，25℃200rpm水浴搖床的條件下，轉化24-48小時，轉化率最高可達48.5％，e.e值大于99.5％。反應液過濾后得到的殘余固定化細胞，可在下批反應中重復利用五次以上，轉化率仍大于35％，e.e.值大于99.5％。與游離細胞轉化相比，達到其50％以上的活性。本工藝路線催化劑制備簡易，可重復利用五次以上；反應條件溫和，無需進行底物保護；反應步驟精簡；產物的對映體過量值達99.5％以上，因此具有較好的經濟性和技術可行性。
文檔編號C12P41/00GK101875959SQ20101019192
公開日2010年11月3日 申請日期2010年6月4日 優先權日2010年6月4日
發明者倪曄, 孫志浩, 徐小海, 曾錫瑞 申請人:江西省馳邦藥業有限公司;江南大學