專利名稱：一種煙草hplc指紋圖譜數據庫的建立方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于煙草品質分級技術領域，具體涉及一種煙草HPLC指紋圖譜的分析方法及在烤煙質量分析、烤煙品牌識別和打葉配方中的用途。
背景技術：
指紋圖譜系指將分析對象經適當處理后，采用一定的儀器分析手段得到的能夠標示該對象特性的共有峰的圖譜。指紋圖譜技術具有模糊指紋特征分析、宏觀推斷分析等特點，是進行復雜物質質量評價的有效手段。指紋圖譜技術已經成功地應用于中藥品質分析和判斷及農產品朔源等領域。鑒于此，近年來，一些研究者對指紋圖譜技術在煙草科研與生產上應用的理論和實踐問題進行了有益的探索。經檢索，中國發明專利中指紋圖譜應用的發明專利申請涉及煙草和中成藥鑒定等多個方面。經檢索目前的相關專利文獻如下
申請號為200810196806. 7文獻涉及一種烤煙醇化品質判定的高效液相指紋圖譜分析方法。它是采用高效液相色譜分析方法測定不同煙葉樣品，得出煙葉指紋圖譜特征峰，然后利用中草藥指紋圖譜軟件對特征峰進行分析，建立指紋圖譜特征峰總面積與煙葉樣品感官質量的回歸關系模型；以感官質量為依變量y，指紋圖譜總面積χ為因變量，建立兩者的回歸關系模型為:Y = 72. 04974+0. 1388*LN(X) *LN(X)或 Y = X/ (0. 011081*Χ+13· 247)；根據所測樣品的指紋圖譜總面積X，計算出感官質量Y。本發明具有準確性高、穩定性好的特點， 實際操作中可節省大量的人力物力財力，使用方便，能夠代替利用傳統的感官評吸方法對煙葉醇化質量的判定。申請號為200810196807. 1文獻涉及一種烤煙醇化品質判定的高效液相指紋圖譜主成分分析方法。它是采用高效液相色譜分析方法測定不同煙葉樣品，得出煙葉指紋圖譜特征峰，然后利用中草藥指紋圖譜軟件對特征峰進行分析，建立特征峰主成分值與煙葉樣品感官質量的回歸關系模型；以感官評吸值Y為依變量，7個主成分值Al至Α7為因變量， 建立特征峰主成分值與感官評吸值的多元回歸模型
Y = 85. 64+1. 34Α1+1. 21Α2+0. 27Α3-0. 40Α4-1. 17Α5-0. 46Α6+0. 48Α7 根據分析所得到的主成分值Α，計算出感官質量Y。具有準確性高、穩定性好的特點，實際操作中可節省大量的人力物力財力，使用方便，能夠代替利用傳統的感官評吸方法對煙葉醇化質量的判定。申請號為01119925. 3的文獻涉及中藥丹參水溶性提取物HPLC指紋圖譜建立的方法及其標準指紋圖譜。首先制備供試品溶液，取丹參藥材粉末(過30目篩)4.00g，加水 50ml，精密稱重，回流提取2小時，放冷至室溫，補足失水，取2ml置25ml量瓶，甲醇定容至刻度，離心，取上清液作為供試品溶液。再配制對照品溶液，取丹參素鈉、原兒茶醛對照品適量，用流動相稀釋，制成每Iml中含丹參素鈉20 μ g，原兒茶醛5. 0 μ g，作為對照品溶液。測定法是分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各20μ 1、10μ 1，分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，計算，即得。建立丹參標準指紋圖譜。將待測丹參樣品指紋圖譜與標準指紋圖譜對比，比較其異同。本發明的優點是方法簡便、穩定、精密度高、重現性好、易于掌握，能從色譜的整體特征面貌上把握丹參的品種和質量情況，可將其作為丹參質量控制及真偽鑒別的指標之一。申請號為03147783. 6文獻涉及一種使用高速逆流色譜(HSCCC)制訂中藥指紋圖譜的方法。該方法包括制備各批次中藥材的粗提物；通過TLC確定主要化合物類型；選取 HSCCC使用的溶劑體系；使用高速逆流色譜儀純化中藥材的粗提物；使用紫外檢測器檢測洗脫液，繪制各組份的紫外吸收與洗脫時間的關系圖；通過HPLC和UV-Vis確定粗提物中各組份的對應性；判斷共有指紋峰；綜合中藥指紋圖譜方法學考察資料的數據即構成指紋圖譜。該法首次將HSCCC應用于中藥指紋圖譜的制訂，是對現有方法的重要補充，其精密度和重現性明顯優于TLC，又解決了 HPLC難以分析/分離高粘度和易填料吸附的樣品以及儀器耗材昂貴的問題。申請號為200410066701. 1文獻涉及一種中藥指紋圖譜的制作方法，是一個用裂解-氣相色譜-質譜聯用技術來制作中藥指紋圖譜的方法，該方法包括下列三步步驟1、中藥材的裂解；2、GC/MS分析；3、計算機處理，獲得標識混合體系的彩色二維條形碼，即是使得計算機能夠識別中藥的指紋圖譜。通過對同一藥材或不同藥材的標準譜圖進行精確的類似度比較，根據類似度的大小，人們可對中藥材進行鑒別。因而本發明制作方法可用來快速有效地鑒別中藥材，控制中藥材的質量，為提高中藥生產現代化程度提供一個重要的手段。申請號為200610(^9707. 0文獻涉及一種治療心血管疾病的中藥組合物及其指紋圖譜分析方法。該中藥組合物由人參、蟾酥、牛黃、肉桂、麝香、冰片、蘇合香七味藥材或者七味藥材的提取物組成。這種中藥組合物的非揮發性成分和揮發性成分的指紋圖譜具有一定數量的特征峰，各特征峰的相對保留時間和相對峰面積符合一定的比例。本發明對于發展我國傳統醫藥，促進人類健康具有十分重大的意義。申請號為201010106834. 2的文獻涉及天麻生化指紋圖譜分類與品質鑒定技術及其應用，涉及中藥和天然藥物的鑒定與品質評價技術。本發明提供了分離和檢測天麻生化成分的關鍵技術參數最佳流動相(梯度濃度乙腈溶液)和最佳檢測波長Ol9nm)以及其他基本條件，提供了測定天麻生化指紋圖譜的技術和計算天麻有效成分天麻素含量的公式和方法。本發明不僅能用于天麻生化指紋圖譜的測定、天麻品種的分類、天麻品質的鑒定和評價，還能用于天麻適宜種植地區確定和天麻真偽鑒別。上述專利文獻多是中藥指紋圖譜的分析及其應用，只有二份涉及烤煙的指紋圖譜建立及其應用。該二份烤煙指紋圖譜文獻均是采用多元分析方法預測烤煙的感官評吸值， 由于感官評吸受人為主觀因素影響，評吸值變異大、重現性差，因此上述二個專利文獻的應用具有局限性。中草藥指紋圖譜的測定對象和分析對象與烤煙有根本的不同，雖然其科學原理可以作為參考，但其技術方法不能照搬。另外，過去建立的烤煙和中草藥指紋圖譜均是采用共有峰圖譜，沒有考慮非共有峰的作用，在實際應用中，理論上存在誤判的可能性。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術沒有考慮指紋圖譜非共有峰、僅靠預測烤煙的感官評吸值來進行品質分析的缺陷，尋找一種高效經濟的烤煙品質分級方法及其應用技術途徑。本發明尋找一種能夠反映烤煙的特征品質的指紋圖譜分析方法，并提出具體的應用技術途徑。本發明提出的指紋圖譜分析方法能夠科學的將烤煙進行分類，切實降低烤煙評吸工作量，提高打葉配方生產水平，達到國家標準。本發明是這樣實現的一種煙草HPLC指紋圖譜數據庫的建立方法，其特征步驟為
1)、烤煙成分提取以甲醇為提取劑，提取條件為液固比v/g為20— 40，提取溫度為 20 30°C，超聲波提取時間50 60min，離心分離后取上清液過0. 45Mm的濾膜，濾液為待測溶液；
2)、HPLC指紋圖譜分析取步驟1)的待測溶液，采用HPLC進行指紋圖譜分析，得到烤煙原始指紋圖譜數據庫，分析條件為C18色譜柱，流動相A為乙腈，流動相B為0. 08 0. 2%的甲酸；梯度洗脫程序不同分析時間時，流動相A與B體積比分別是0min時為0 5 95 100，30min 時為 20 25 75 80，45min 時為 30 40 60 70，55min 時為 50 60:40 50并保持5 min，停止色譜分析；65min時，A與B的體積比為0 5:95 100 ； 保持aiiin后運行5min ；其體積流量范圍0. 8-1.2 ml/min ；柱溫20 30°C，檢測波長 250nm ；
3)、指紋圖譜分時數據庫的建立通過計算機編程技術，將步驟2)得到的烤煙原始指紋圖譜數據庫轉換成烤煙指紋圖譜分時數據庫；
4)、主成份一聚類分析法判定煙草品質級別采用主成份分析法對步驟3)的烤煙指紋圖譜分時數據庫進行分析，提取主成份，對不同樣品的主成份值進行聚類分析；或者直接對步驟3)的烤煙指紋圖譜分時數據庫指標進行聚類分析，以達到對不同品質的煙葉進行分類的目的。所述步驟3)的分時數據庫的時長為l-5min。所述步驟1)的超聲波頻率為20 80MHz，離心機離心力為5，000 12，000 g，離心時間8 15min。所述步驟2)的色譜柱為C18色譜柱。本發明方法涉及在烤煙品質分類及品牌煙葉識別中的應用。本發明首次提出分時圖譜數據庫，并直接將指紋圖譜信息轉化為烤煙品質的分類結果，理論上更為完善、方法上更為科學、實際上更好操作。本發明的烤煙HPLC指紋圖譜包括共有峰和非共有峰。所謂共有峰是在供研究樣品的指紋圖譜中都出現的特征峰。共有峰數據庫的優點是簡單明了，但其缺點是忽視了非共有峰的作用和貢獻。不可否認，一定條件下，可能正是非共有峰的作用和貢獻決定了煙葉的品質和級別的差異性。基于這一嶄新的指導思想，實施本發明的核心技術是建立HPLC分時指紋圖譜數據庫的方法，這一方法充分考慮到了非共有峰的貢獻，通過對分時數據庫進行主成份一聚類分析，從而確定烤煙品質級別，達到烤煙品質分級的目的。HPLC指紋圖譜分時數據庫建立的方法是，通過人工和計算機編程技術使原始指紋圖譜數據庫轉換成分時數據庫。理論上，任何時間段都可以選用來進行建庫。一般是時間段越短、信息量越豐富。通常根據計算要求，可以選1至5min不等。比如，為選取合適的時間段，采用lmin、2min、;3min和5min這四個時間段，分別將60min的圖譜剪切成60、30、20禾口 12個時段圖譜數據進行分析。從不同時間段選取的結果來看，Imin和^iin時間段太短，特征峰之間還是會出現漂移；而5min時間段包含的穩定性不高的特征峰太多。最終選取:3min時間段來對烤煙指紋圖譜進行化學計量學分析。本發明的研究結果表明，采用甲醇提取液，HPLC分析建立的煙草特征提取物色譜圖基線平穩、響應峰多、分離度好(如圖1)。對樣品提取液連續進樣5次，比較保留時間和峰面積的精密性和重現性，結果表明，峰面積RSD<3%以下。取烤煙樣品提取液相隔池，4h，他， 8h，10h, 12h進行方法穩定性檢測，結果發現，檢測結果RSD<3%以下，表明該方法很穩定。另外，選取10個樣本指紋圖譜，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版”，經過數據導入和數據匹配，以平均數法建立對照指紋圖譜(如圖2)。從圖2指紋圖譜共有模式和匹配結果可以看出，有48個峰為10個批次樣品所共有(表1)，經統計共有峰峰面積占總峰面積的90%以上。相似度分析表明，10批次樣品指紋圖譜的相似度在0. 98以上(表2)， 表明所建立的指紋圖譜完全符合技術規范。本發明首次提出了指紋圖譜分時數據庫的概念并提出了相應的計算軟件和方法 (圖3)。分時數據庫的提出是為了快速處理指紋圖譜數據，降低人為操作失誤，最大程度利用圖譜潛在信息，包括非共有峰對煙葉品質的影響。同時，可以實現數據的客觀性，降低人為誤差，使數據整理工作變的簡單方便，實現指紋圖譜工業化的目的。本發明采用HPLC技術獲得指紋圖譜，采用分時軟件構建指紋圖譜的分時數據庫，通過主成份一聚類分析實現對煙草品質的分類。本發明的HPLC指紋圖譜分析新技術，能夠提高煙草HPLC指紋圖譜分析的科學性，對于提高烤煙質量分級水平及提高煙草生產水平和經濟效益具有十分重要的
眉、ο本發明的技術原理是
烤煙的指紋圖譜是烤煙多種品質復雜成分的集合，如同人的指紋的唯一性一樣，烤煙的指紋圖譜是一定品質特征的反映。采用科學的方法對烤煙指紋圖譜進行表征和分析，就可以實現對烤煙品質的分類。采用HPLC技術建立的指紋圖譜包括共有峰和非共有峰，顯然，可能正是非共有峰的作用和貢獻決定了煙葉的品質和級別的差異性。然而，過去有關指紋圖譜的分析均是采用共有峰，而忽視了非共有峰的作用和貢獻。而且，HPLC指紋圖譜共有峰和非共有峰眾多， 靠人工辨別，很容易導致錯誤。本發明提出分時指紋圖譜數據庫的概念和分析技術，是為了快速處理指紋圖譜數據，降低人為操作失誤，最大程度地利用圖譜的潛在信息，包括非共有峰對煙葉品質的影響。同時，降低人為誤差，使數據整理工作變的簡單方便，實現指紋圖譜分析自動化的目的。本發明的有益效果是
1)本發明的分時數據庫的建立方法，簡單、實用、運行成本低；
2)指紋圖譜分時數據庫的更能反映烤煙的品質特征，以此為基礎的品質分析方法，更科學，更完善；
2)本發明采用的烤煙品質判定方法，能夠取代人工評吸方法實現對烤煙品質的判定及在打葉配方中的應用，避免了人的主觀錯誤，提高了打葉配方中烤煙品質判定的科學性，在實際運用中顯著提高經濟效益。


圖1 本發明的烤煙甲醇特征提取物HPLC指紋圖譜圖；圖2 本發明在實驗條件下，選用的云南烤煙10批次樣品甲醇提取物HPLC指紋圖譜及其共有模式。圖3 本發明提出的指紋圖譜數據庫分時數據軟件視窗示意圖。圖4:本發明在實驗條件下，2010年云南省典型產區C3F等級煙葉指紋圖譜聚類分析。圖5 本發明在實驗條件下，2010年云南省典型產區B2F等級煙葉指紋圖譜聚類分析。圖6 本發明在實驗條件下，2010年云南省典型產區X2F等級煙葉指紋圖譜聚類分析。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但本發明的內容并不限于實施例。實施例1
本發明提供的煙草HPLC指紋圖譜數據庫的建立方法，經過下列步驟
1)烤煙提取以甲醇為提取劑，具體提取條件是液固比(v/g)為30，提取溫度25°C， 頻率為40 MHz的超聲波中提取60min，離心機(10，000 g)離心8min ；離心后取上清液，過 0. 45Mffl的濾膜，濾液為待測溶液；
2)取步驟1)的待測溶液進行指紋圖譜分析HPLC，具體條件為C18色譜柱(250 mmX 4.6mm，5Mm)，乙腈為流動相A，0. 1% (ν/ν)的甲酸為流動相B ；梯度洗脫程序不同分析時間時，流動相A與B體積比分別是0min時為5: 95 ；30min時為20:80 ；45min時為 30:70 ；55min時為55:45，保持5 min停止色譜分析，65min時，A與B的體積比為5:95 ；保持anin后運行5min ；其體積流量0. 8ml/min，柱溫25°C，檢測波長250nm ；
3)指紋圖譜分時數據庫的建立通過計算機編程技術使原始指紋圖譜數據庫轉換成分時數據庫，時間段越短，信息量越豐富，根據計算要求，選取:3min時間段來對烤煙指紋圖譜進行化學計量學分析；
4)主成份一聚類分析法判定煙草品質級別采用主成份分析法對烤煙指紋圖譜分時數據庫進行分析，提取主成份，對不同樣品的主成份值進行聚類分析，即最短距離法，達到對不同品質的煙葉進行分類的目的。實施例2
本發明提供的煙草HPLC指紋圖譜數據庫的建立方法，經過下列步驟
1)烤煙提取以甲醇為特征提取劑，具體提取條件是液固比(v/g)為40，提取溫度 30°C，頻率為80 MHz的超聲波中提取50min，離心機(5，000 g)離心15min ；離心后取上清液，過0. 45Mffl的濾膜，濾液為待測溶液；
2)取步驟1)的待測溶液進行指紋圖譜分析HPLC，具體條件為C18色譜柱(250 mmX 4.6mm，5Mm)，乙腈為流動相A，0.2% (ν/ν)的甲酸為流動相B ；梯度洗脫程序不同分析時間時，流動相A與B體積比分別是=Omin時為0: 100 ；30min時為25:75 ；45min時為 40:60 ；55min時為50:50，保持5 min停止色譜分析，65min時，A與B的體積比為0:100 ；保持aiiin后運行5min ；其體積流量1. 2ml/min，柱溫30°C，檢測波長250nm ；
3)指紋圖譜分時數據庫的建立通過計算機編程技術使原始指紋圖譜數據庫轉換成分時數據庫，時間段越短，信息量越豐富，根據計算要求，選取^iin時間段來對烤煙指紋圖譜進行化學計量學分析；
4)主成份一聚類分析法判定煙草品質級別采用主成份分析法對烤煙指紋圖譜分時數據庫進行分析，提取主成份，對不同樣品的主成份值進行聚類分析，即最短距離法，達到對不同品質的煙葉進行分類的目的。實施例3
供試煙葉品種K326，等級為C3F，分別取自云南省16個不同煙葉產區。所有煙樣在 2010年分別收集上來，經云南省煙葉公司統一復烤后制成煙絲。將煙絲樣品在60°C下烘干，用植物粉碎機粉碎，過60目篩，用塑料袋密封，置于超低溫冰箱(-80°C)中保存待測。按照實施例1的分析方法進行分析，得出不同樣品的聚類圖(如圖4)。通過聚類分析圖4可以看出，在距離為0. 1左右時，可以將云南省各個產區C3F等級煙葉分成4類第一類煙葉產區是富源、沾益、馬龍和楚雄；第二類是宣威、會澤、昆明、保山、麗江和思茅；第三類是麒麟、羅平、紅河和文山；第四類是臨滄和昭通。實施例4
供試煙葉品種K326，等級為B2F，分別取自云南省17個不同煙葉產區。按照實施例2 的制備方法和分析方法進行分析，得出不同樣品的聚類圖(如圖5)。通過聚類分析圖5可以看出，在距離為0. 1左右時，可以將云南省各個產區B2F等級煙葉分成3類第一類煙葉產區是大理、師宗、楚雄、宣威；第二類是玉溪、昆明、昭通、沾益、文山、麒麟、保山；第三類是陸良、臨滄、紅河、羅平、富源、思茅。實施例5
供試煙葉品種K326，等級為X2F，分別取自云南省14個不同煙葉產區。按照實施例1 的制備方法和分析方法進行分析，得出不同樣品的聚類圖(如圖6)。通過聚類分析圖6可以看出，可以將云南省各個產區X2F等級煙葉分成2類第一類煙葉產區是宣威、易門、富源、祿勸、臨滄、羅平、楚雄、大理和景東；第二類是保山、紅河、 昭通、馬龍和麒麟。表1烤煙10批次樣品指紋圖譜共有峰的出峰時間
權利要求
1.一種煙草HPLC指紋圖譜數據庫的建立方法，其特征步驟在于1)、烤煙成分提取以甲醇為提取劑，提取條件為液固比v/g為20— 40，提取溫度為 20 30°C，超聲波提取時間50 60min，離心分離后取上清液過0. 45Mm的濾膜，濾液為待測溶液；2)、HPLC指紋圖譜分析取步驟1)的待測溶液，采用HPLC進行指紋圖譜分析，得到烤煙原始指紋圖譜數據庫，分析條件為C18色譜柱，流動相A為乙腈，流動相B為0. 08 0. 2%的甲酸；梯度洗脫程序不同分析時間時，流動相A與B體積比分別是0min時為0 5 95 100，30min 時為 20 25 75 80，45min 時為 30 40 60 70，55min 時為 50 60:40 50并保持5 min，停止色譜分析；65min時，A與B的體積比為0 5:95 100 ； 保持aiiin后運行5min ；其體積流量范圍0. 8-1.2 ml/min ；柱溫20 30°C，檢測波長 250nm ；3)、指紋圖譜分時數據庫的建立通過計算機編程技術，將步驟2)得到的烤煙原始指紋圖譜數據庫轉換成烤煙指紋圖譜分時數據庫；4)、主成份一聚類分析法判定煙草品質級別采用主成份分析法對步驟3)的烤煙指紋圖譜分時數據庫進行分析，提取主成份，對不同樣品的主成份值進行聚類分析；或者直接對步驟3)的烤煙指紋圖譜分時數據庫指標進行聚類分析，以達到對不同品質的煙葉進行分類的目的。
2.根據權利要求1所述的煙草HPLC指紋圖譜分時數據庫的建立方法，其特征在于所述步驟1)的超聲波頻率為20 80MHz，離心機離心力為5，000 12，000 g，離心時間8 15min。
3.根據權利要求1所述的煙草HPLC指紋圖譜分時數據庫的建立方法，其特征在于所述步驟3)的分時數據庫的時長為l-5min。
4.一種如權利要求1所述的方法在烤煙品質分類及品牌煙葉識別中的應用。
全文摘要
本發明提供一種煙草HPLC指紋圖譜數據庫的建立方法，經過烤煙成分提取、HPLC指紋圖譜分析，得到烤煙原始指紋圖譜數據庫，通過計算機編程技術，將烤煙原始指紋圖譜數據庫轉換成烤煙指紋圖譜分時數據庫，采用主成份分析法對烤煙指紋圖譜分時數據庫進行分析，以達到對不同品質的煙葉進行分類的目的。本發明能客觀的描述烤煙指紋圖譜的信息特征，更科學地反映煙草的內在品質，能取代傳統的人工評吸及普通化學測定等方法在烤煙品質判定實際中應用，對于提高煙草品質評價的科學性及提高烤煙生產經濟效益具有重要意義。本發明的特征是，利用指紋圖譜分時軟件建立烤煙指紋圖譜的分時數據庫，通過主成份－聚類分析方法建立烤煙質量分類體系。本發明還公開了這一方法在烤煙品質分級、打葉配方及品牌識別中的應用。
文檔編號G01N30/88GK102507829SQ20111036563
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月17日 優先權日2011年11月17日
發明者何云燕, 何結望, 劉磊, 唐徐紅, 尹曉東, 李琳, 涂書新, 矣躍平, 袁仕信, 閻鐵軍 申請人:云南省煙草煙葉公司