專利名稱：一種烤煙gc/ms指紋圖譜的建立方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于煙草品質分級領域，具體涉及一種烤煙質量分析、烤煙品牌識別和打葉配方中的品質分析方法。
背景技術：
煙草作為一種天然植物，其成分相當復雜，目前已經分離鑒定出來的香氣質成分就高達5000多種。這些成分對其品質都有或大或小的影響，若依據常規的化學檢測只對其主要化學成分進行分析，以此來判別煙草的質量顯然有失偏頗。因此，現在對煙草質量的識別主要依靠人工評吸。人工評吸雖然能從整體上把握，但是容易受個人情緒和感官差異性等主觀因素的影響。有時也會出現較大偏差，且工作量大。指紋圖譜技術是一種著眼于整體，不追求分析對象的某個具體的細節，反應對象的整體特征，具有模糊性和專屬性。該技術已經在中藥等領域有較為成熟的發展。武政等人就曾通過HPLC的方法建立何首烏的指紋圖譜評價其質量，結果與中國藥典的結論相符合。 黎瓊紅等人也建立了丹參的HPLC指紋圖譜，在對11個不同產區丹參的分析中確定了 14個共有峰，以之判別丹參的質量。在煙草香氣質研究中，HPLC和GC / MS等儀器已成為常規的分析方法而廣泛應用。經檢索，中國發明專利中與指紋圖譜相關的發明專利申請涉及煙草和中成藥鑒定等多個方面。經檢索目前的相關專利文獻如下
1)申請號為CN201010M8519.5文獻涉及功能食品活性成分檢測方法領域，它以超臨界C02萃取蜂膠，然后進行GC-MS檢測，構建指紋圖譜。其GC/MS指紋圖譜共有峰有8個， 圖譜總長度為60min。具體的步驟為將蜂膠樣品置于超臨界C02萃取釜中萃取后得到蜂膠的超臨界C02萃取物；稱取蜂膠樣品置于樣品瓶中進行固相微萃??；再進行GC/MS分析； 最后將不同地區蜂膠超臨界C02萃取物的GC/MS圖譜進行比對，提取其共有峰，組成蜂膠超臨界C02萃取物的GC-MS指紋圖譜。該發明方便、穩定、精密度高、重現性好、易于掌握。檢測樣品時間短，所得蜂膠超臨界C02萃取物揮發性成分達120余種。2)申請號為CN200610149185. 8文獻涉及一種消痛貼粉或膏或提取物GC及GC/ MS指紋圖譜建立的方法及其標準指紋圖譜。它涉及的質量控制方法由以下步驟組成1.制備消痛貼供試品溶液，取消痛貼適量，精密稱重，置索氏提取器中，加入乙醚回流提取，過濾，濾液作為供試品溶液。2.用GC及GC/MS對消痛貼指紋圖譜18個共有峰中參考峰(10 號峰)進行鑒定，鑒定結果10號色譜峰為桉葉醇。3.依桉葉醇的特征峰為參考峰，計算相對保留時間、相對峰面積，即得消痛貼提取物的標準指紋圖譜。該方法簡便、穩定、精密度高、重現性好，能從色譜的整體特征面貌上把握消痛貼的質量情況，可作為消痛貼質量控制指標。3)申請號為200410066701. 1文獻涉及一種中藥指紋圖譜的制作方法，是一個用裂解-氣相色譜-質譜聯用技術來制作中藥指紋圖譜的方法，該方法包括下列三步步驟1、 中藥材的裂解；2、GC/MS分析；3、計算機處理，獲得標識混合體系的彩色二維條形碼，即是使得計算機能夠識別中藥的指紋圖譜。通過對同一藥材或不同藥材的標準譜圖進行精確的類似度比較，根據類似度的大小，人們可對中藥材進行鑒別。因而本發明制作方法可用來快速有效地鑒別中藥材，控制中藥材的質量，為提高中藥生產現代化程度提供一個重要的手段。4)申請號201010606325. 6文獻涉及一種貴州余慶GAP基地吳茱萸HPLC指紋圖譜的建立方法。具體包括供試品溶液的制備，提取物的制備，色譜條件的確定，使用HPLC進行測定，并首次選用吳茱萸的兩種偽品(花椒、馬桑子)完成指紋圖譜適用性檢驗，得到吳茱萸藥材及其提取物HPLC指紋圖譜，較全面地表達了吳茱萸藥材及其提取物的整體化學信息，確定其指紋特征，該指紋圖譜囊括了水溶性部分和脂溶性部分。它測定了 12批吳茱萸藥材樣品的HPLC指紋圖譜并進行分析比較，得到22個共有峰構成的吳茱萸藥材指紋圖譜。5)申請號20111002^23. 5文獻涉及一種馬尾松針揮發油成分的GC指紋圖譜的建立方法。它按照揮發油的提取法制備供試溶液，共鑒別出17個特征峰，并以6號峰(石竹烯)為參照峰，計算各共有指紋峰的相對保留時間，相對保留時間的RSD均小于1.0%。所有樣品中，共有指紋峰峰面積之和占總峰面積之比值均大于69%。6)申請號為200810196806. 7文獻涉及一種烤煙醇化品質判定的HPLC指紋圖譜分析方法。它是采用HPLC分析方法測定不同煙葉樣品，得出煙葉指紋圖譜特征峰，然后利用中草藥指紋圖譜軟件對特征峰進行分析，建立指紋圖譜特征峰總面積與煙葉樣品感官質量的回歸關系模型；以感官質量為依變量y，指紋圖譜總面積χ為因變量，建立兩者的回歸關系模型為:Y = 72. 04974+0. 1388*LN(X) *LN(X)或 Y = X/ (0. 011081*Χ+13· 247)；根據所測樣品的指紋圖譜總面積X，計算出感官質量Y。7)申請號為200810196807. 1文獻涉及一種烤煙醇化品質判定的HPLC指紋圖譜主成分分析方法。它是采用HPLC分析方法測定不同煙葉樣品，得出煙葉指紋圖譜特征峰， 然后利用中草藥指紋圖譜軟件對特征峰進行分析，建立特征峰主成分值與煙葉樣品感官質量的回歸關系模型；以感官評吸值Y為依變量，7個主成分值Al至Α7為因變量，建立特征峰主成分值與感官評吸值的多元回歸模型Y = 85. 64+1. 34Α1+1. 21Α2 +0. 27Α3-0. 40Α4 -1. 17Α5 -0.46Α6+0.48Α7，根據分析所得到的主成分值Α，計算出感官質量Y。8)申請號為201010106834. 2的文獻涉及一種天麻生化指紋圖譜分類與品質鑒定技術及其應用，涉及中藥和天然藥物的鑒定與品質評價技術。該發明提供了分離和檢測天麻生化成分的關鍵技術參數最佳流動相(梯度濃度乙腈溶液)和最佳檢測波長Gl9nm) 以及其他基本條件，提供了測定天麻生化指紋圖譜的技術和計算天麻有效成分天麻素含量的公式和方法。它不僅能用于天麻生化指紋圖譜的測定、天麻品種的分類、天麻品質的鑒定和評價，還能用于天麻適宜種植地區確定和天麻真偽鑒別。上述專利文獻雖然涉及有GC/MS指紋圖譜，但是并沒有涉及烤煙的GC/MS指紋圖譜的建立方法及其應用。其中2份涉及烤煙的指紋圖譜建立及其應用，但它是以HPLC的方法建立的指紋圖譜。2份GC/MS指紋圖譜的文獻所應用的對象和領域也不同，且方法也相差較多。因此本專利采用的方法及應用領域尚未見專利申請。

發明內容
本發明的目的在于建立烤煙香氣成分的GC/MS指紋圖譜，并以之分析烤煙質量的特征品質，應用于烤煙等級判別、產地識別及烤煙打葉配方應用。同時，克服現有技術的缺陷，科學的對烤煙進行分類，切實降低烤煙評吸工作量，提高打葉配方生產水平，達到國家標準的需要。本發明所述的一種烤煙GC/MS指紋圖譜的建立方法，經過下列步驟實現
1)待測液制備在與蒸餾萃取裝置一端相連的平底燒瓶中加入煙末，按15 30的液固比v/g加入純水，再按0. 015 0. 030的液固比v/g加入濃度為4pL/mL的丙酸苯乙酯， 進行加熱；在與蒸餾萃取裝置另一端相連的燒瓶中，按2 4的液固比v/g加入二氯甲烷， 并將該燒瓶置于溫度為陽 60°C的水浴鍋上加熱，進行蒸餾萃取2. 5 3. 0h，之后取下燒瓶，并在該燒瓶中按煙末質量的1/2 1/4的量加入無水硫酸鈉，密封過夜后，將其放在旋轉蒸發儀上使萃取液濃縮至體積為1 2mL，過0. 45Mffl的濾膜，濾液為待測溶液，備用；
2)烤煙GC/MS指紋圖譜的獲得將步驟1)的待測溶液用GC/MS儀器分析，GC/MS儀器分析條件為色譜柱HP-5MS ；載氣He ；流速0. 8-1.0 mL/min ；進樣口溫度200 2400C ；檢測器溫度220 - 2800C ；分流比8 15:1 ；進樣量1 5μ1 ；程序升溫第一分鐘從50°C開始，之后以2 4°C /min的升溫速度升至180°C，再以3 6°C /min的升溫速度升至270°C ；MS條件為電離電壓60 - 80ev ；離子源溫度為180 220°C ；傳輸線溫度 230 270°C，使用Wiley7與Mainlib圖譜庫進行檢索，得到烤煙GC/MS指紋圖譜；
3)GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫的建立根據Wiley7與Mainlib圖譜庫檢索的結果， 在步驟2)得到的指紋圖譜中挑選出60%以上樣品共有的峰，建立GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫；
4)根據步驟3)建立的GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫，對烤煙指紋圖譜共有峰數據庫進行聚類分析，判定煙草品質級別。對步驟2)所述方法可靠性的檢驗取步驟1)的待測溶液一份，按步驟2)的GC/ MS條件連續進樣六次，選取其主要的20個峰，使此20個峰的峰面積占總峰面積比>80%，考察烤煙GC/MS指紋圖譜的精密度，要求保留時間RSD<0. 1%，各單峰與總峰面積比RSD均小于 5% ；取步驟1)的待測溶液一份，按步驟2)的GC/MS條件，分別于0h,4h,8h, 12h,24h,48h進樣檢測，選取其主要的20個峰，且此20個峰的峰面積占總峰面積比>80%，考察烤煙GC/MS 指紋圖譜的穩定性，要求保留時間RSD<0. 1%，各單峰與總峰面積比RSD<6%，且樣品在48h內的穩定性達到分析要求；取步驟1)的待測溶液5份，分別按步驟2)的GC/MS條件進樣，考察烤煙GC/MS指紋圖譜的重現性，選取其主要的20個峰，此20個峰的峰面積占總峰面積比 >80%，保留時間RSD<0. 1%，各單峰與總峰面積比RSD<20%。本發明方法涉及在烤煙品質分類、品牌煙葉識別及烤煙配方打葉中煙葉質量控制中的應用。本發明具有下列優點和效果本發明針對烤煙的致香成分，采用超純水體系同時蒸餾萃取方法提取煙草樣品，采用GC/MS技術獲得指紋圖譜，再以聚類分析實現煙草在品質上的分類，獲得的GC/MS指紋圖譜具有基線分離好、特征峰多、峰響應度高的特點，本發明的核心是將建立的烤煙GC/MS指紋圖譜及其配套分析技術應用于烤煙品質分級、產地識別和配方打葉中煙葉質量的控制。本發明所提出的煙草品質分級新技術，能全部或部分替代煙草人工評吸，提高煙草品質分級、打葉配方的效率和科學性，對提高煙草生產水平和經濟效益具有十分重要的意義。從根本上解決了一直以來依靠人工的感官評吸和主要化學成分分析所帶來的下列問題人工評吸工作量大，且結果易受人的主觀影響，以及化學分析雖是烤煙品質分析的基本方法，但化學分析的指標有限，烤煙作為植物性原料，成分十分復雜，如已經探明的煙草香氣成分就高達5000種以上，所以化學分析也并不足以反映烤煙的品質，在應用中有嚴重的局限性等。本發明提供的烤煙GC/MS指紋圖譜的建立方法，是一種對成分復雜樣品也能進行很好分析的手段，它的整體性和模糊性，既能反映樣本的整體信息，且工作量并不大。更重要的是它如同人的指紋一樣具有唯一性，能達到區分不同產區、不同等級、不同品質的烤煙。所以，如果采用科學的方法對烤煙指紋圖譜進行表征和分析，就可以實現對烤煙品質的科學分類。


圖1 烤煙香氣成分GC-MS指紋圖譜總離子圖。圖2 云南烤煙8批次樣品香氣成分GC-MS指紋圖譜及其共有模式。圖3 2009年云南省典型產區C3F等級煙葉共有峰指紋圖譜聚類分析。圖4 2009年云南省典型產區B2F等級煙葉共有峰指紋圖譜聚類分析。圖5 2009年云南省典型產區X2F等級煙葉共有峰指紋圖譜聚類分析。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明做進一步的說明，但不限于實施例。實施例1
本發明所述的一種烤煙GC/MS指紋圖譜的建立方法，經過下列步驟實現
1)待測溶液制備在蒸餾萃取裝置一端連接500mL的平底燒瓶，在該平底燒瓶中裝入 20. OOg煙末，并加入350mL純水及0. 3mL濃度為4gL/mL的丙酸苯乙酯，并以可控制電壓的電熱套進行加熱；在蒸餾萃取裝置另一端連接IOOmL的燒瓶，在該燒瓶中放入50mL 二氯甲烷，將該燒瓶置于水浴鍋上加熱，在56°C水浴溫度下蒸餾萃取2.證，取下IOOmL的燒瓶，并在其中加入5g無水硫酸鈉，密封過夜，再放入旋轉蒸發儀上濃縮至lmL，過0. 45Mffl的濾膜， 濾液為待測溶液；
2)烤煙GC/MS指紋圖譜的獲得將步驟1)的待測溶液用GC/MS儀器分析，GC/MS儀器分析條件為色譜柱HP-5MS的規格為30mX0. 25mmX0. 25um ；載氣He ；流速0. 8mL/min ； 進樣口溫度220°C ；檢測器溫度250°C ；分流比10 1 ；進樣量 μ1 ；程序升溫第Imin為 50°C，之后以3°C /min的升溫速度升至180°C，再以5°C /min的升溫速度升至270°C ；MS條件為電離電壓70ev ；離子源溫度為200°C;傳輸線溫度250°C;使用Wiley7與Mainlib圖譜庫進行檢索，建立烤煙GC/MS指紋圖譜，所建立的烤煙GC/MS指紋圖譜的方法科學可靠， 所獲取的GC/MS圖譜不僅基線平穩、響應峰多、分離度好，而且穩定、重復性好，如圖1 ；
3)GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫的建立根據Wiley7與Mainlib圖譜庫檢索的結果， 在步驟2)得到的指紋圖譜中挑選出60%以上樣品共有的峰，建立GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫，若兩個峰未能完全的分開且在各樣品中有相當好的對應，則將其合并，如H1、H2、H3 分別是三甲基二氫萘和三甲基四氫萘酚、9 一甲基一順式十氫一 1，8 —二酮與二氫獼猴桃內酯、菲和肉豆蔻酸的加和，此外，有若干組峰，含量比較小且緊密相連，也將其合并為一個指標，如H4、H5、H6三組，如此一來，經簡化得到44個峰建立共有峰數據庫(表1)，其中8號峰為內標峰丙酸苯乙酯，以丙酸苯乙酯為參照峰計算各峰的相對保留時間α ；
4)根據步驟3)建立的GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫，對烤煙指紋圖譜共有峰數據庫進行聚類分析，判定煙草品質級別。實施例2
供試煙葉品種Κ326，等級為C3F，分別取自云南省15個不同煙葉產區。所有煙樣在 2009年采集，經統一復烤后制成煙絲。將煙絲樣品在40°C下烘干，用植物粉碎機粉碎，過60 目篩，用塑料袋密封，置于超低溫冰箱(_80°C)中保存待測，測定方法如下
1)待測溶液制備在蒸餾萃取裝置一端連接500mL的平底燒瓶，在該平底燒瓶中裝入 20. OOg煙末，并加入450mL純水及0. 6mL濃度為4gL/mL的丙酸苯乙酯，并用可控制電壓的電熱套加熱該平底燒瓶；在蒸餾萃取裝置另一端連接IOOmL的燒瓶，在該燒瓶中放入SOmL 二氯甲烷，將該燒瓶置于水浴鍋上加熱，在60°C水浴溫度下蒸餾萃取3. 0h，取下IOOmL的燒瓶，并在其中加入IOg無水硫酸鈉，密封過夜，再放入旋轉蒸發儀上濃縮至lmL，過0. 45Mffl的濾膜，濾液為待測溶液；
2)將步驟1)的待測溶液用GC/MS儀器分析，GC/MS儀器分析條件為色譜柱HP_5MS 的規格為:30mX0. 25mmX0. 25um ；載氣=He ；流速1. OmL/min ；進樣口溫度240°C ；檢測器溫度280°C;分流比15 :1 ；進樣量5μ1 ；程序升溫第Imin為50°C，之后以2V Mn的升溫速度升至180°C，再以6°C /min的升溫速度升至270°C ；MS條件為電離電壓70ev ；離子源溫度為220°C ；傳輸線溫度270°C ；使用Wiley7與Mainlib圖譜庫進行檢索，建立烤煙 GC/MS指紋圖譜；
3)GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫的建立根據圖譜庫檢索的結果，在步驟2)得到的指紋圖譜中挑選出60%以上樣品共有的峰，建立GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫，若兩個峰未能完全的分開且在各樣品中有相當好的對應，則將其合并，如H1、H2、H3分別是三甲基二氫萘和三甲基四氫萘酚、9 一甲基一順式十氫一 1，8 —二酮與二氫獼猴桃內酯、菲和肉豆蔻酸的加和，此外，有若干組峰，含量比較小且緊密相連，也將其合并為一個指標，如H4、H5、H6三組，如此一來，經簡化得到44個峰建立共有峰數據庫(表1)，其中8號峰為內標峰丙酸苯乙酯，以丙酸苯乙酯為參照峰計算各峰的相對保留時間α ；
4)根據步驟3)建立的GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫，對烤煙指紋圖譜共有峰數據庫進行聚類分析，判定煙草品質級別，具體是以挑選出的共有峰的峰面積比為指標，進行聚類分析(最短距離法)(圖3)，通過聚類分析圖3可以看出，在距離為0. 1左右時，可以將2009 年云南省各個產區C3F等級煙葉分成4類第一類煙葉產區是麒麟、沾益、保山、景東、祿勸、 麗江、紅河；第二類是昭通、臨滄、羅平、文山、楚雄；第三類是宣威、馬龍；富源區別于其它產地自成一類。實施例3
供試煙葉品種Κ326，等級為B2F，分別取自云南省17個不同煙葉產區。按照實施例1 的制備方法和分析方法進行分析，得出不同樣品的聚類圖(圖4)。通過聚類分析圖4可以看出，在距離為0. 05左右時，可以將2009年云南省各個產區B2F等級煙葉分成6類第一類煙葉產區是師宗、羅平、紅河；第二類是普洱、文山、陸良、 臨滄；第三類是大理、昭通、保山；第四類是尋甸、楚雄、富源、沾益；第五類是麒麟、玉溪；另外富源為第六類。實施例4
供試煙葉品種K326，等級為X2F，分別取自云南省13個不同煙葉產區。按照實施例1 的制備方法和分析方法進行分析，得出不同樣品的聚類圖(圖5)。通過聚類分析圖5可以看出，可以將云南省各個產區X2F等級煙葉分成4類第一類煙葉產區是大理、麒麟、普洱、宣威、昭通、楚雄；第二類是玉溪、羅平、富源；第三類是馬龍、保山、臨滄；祿勸單成一類。
表1云南烤煙GC/MS指紋圖譜共有峰列表
權利要求
1.一種烤煙GC/MS指紋圖譜的建立方法，其特征在于經過下列步驟1)待測液制備在與蒸餾萃取裝置一端相連的平底燒瓶中加入煙末，按15 30的液固比v/g加入純水，再按0. 015 0. 030的液固比v/g加入濃度為4pL/mL的丙酸苯乙酯， 進行加熱；在與蒸餾萃取裝置另一端相連的燒瓶中，按2 4的液固比v/g加入二氯甲烷， 并將該燒瓶置于溫度為陽 60°C的水浴鍋上加熱，進行蒸餾萃取2. 5 3. 0h，之后取下燒瓶，并在該燒瓶中按煙末質量的1/2 1/4的量加入無水硫酸鈉，密封過夜后，將其放在旋轉蒸發儀上使萃取液濃縮至體積為1 2mL，過0. 45Mffl的濾膜，濾液為待測溶液，備用；2)烤煙GC/MS指紋圖譜的獲得將步驟1)的待測溶液用GC/MS儀器分析，GC/MS儀器分析條件為色譜柱HP-5MS ；載氣He ；流速0. 8-1.0 mL/min ；進樣口溫度200 2400C ；檢測器溫度220 - 2800C ；分流比8 15:1 ；進樣量1 5μ1 ；程序升溫第一分鐘從50°C開始，之后以2 4°C /min的升溫速度升至180°C，再以3 6°C /min的升溫速度升至270°C ；MS條件為電離電壓60 - 80ev ；離子源溫度為180 220°C ；傳輸線溫度 230 270°C，使用Wiley7與Mainlib圖譜庫進行檢索，得到烤煙GC/MS指紋圖譜；3)GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫的建立根據圖譜庫檢索的結果，在步驟2)得到的指紋圖譜中挑選出60%以上樣品共有的峰，建立GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫；4)根據步驟3)建立的GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫，對烤煙指紋圖譜共有峰數據庫進行聚類分析，判定煙草品質級別。
2.一種如權利要求1所述的方法在烤煙品質分類、品牌煙葉識別及烤煙配方打葉中煙葉質量控制中的應用。
全文摘要
本發明提供一種烤煙GC/MS指紋圖譜的建立方法，經過待測液制備、烤煙GC/MS指紋圖譜的獲得、GC/MS指紋圖譜共有峰數據庫的建立，對烤煙指紋圖譜共有峰數據庫進行聚類分析，從而判定煙草品質級別。本發明能客觀的反應烤煙的內在品質，取代傳統的人工評吸和普通化學測定方法。不僅降低評吸人員的工作強度，還使煙草品質的評價更具科學性，對提高烤煙生產的經濟效益具有重要意義。本發明的特征是，針對烤煙的致香成分，采用超純水體系同時蒸餾萃取方法提取、GC/MS檢測，獲得基線分離好、特征峰多、峰響應度高的GC/MS指紋圖譜。本發明的核心是將建立的烤煙GC/MS指紋圖譜及其配套分析技術應用于烤煙品質分級、產地識別和配方打葉中的煙葉質量控制。
文檔編號G01N30/88GK102495163SQ20111036563
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月17日 優先權日2011年11月17日
發明者何云燕, 何結望, 劉磊, 尹曉東, 曹林海, 李琳, 涂書新, 矣躍平, 袁仕信, 閻鐵軍 申請人:云南省煙草煙葉公司