專利名稱：甘薯上馬鈴薯y病毒屬病毒的血清學檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，特別是涉及甘薯上的馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
甘薯羽狀斑駁病毒potato feathery mottle 口>狀，SPFMV)、甘薯潛隱病 : {Sweet potato latent virus, SPLV)^1^ G ^ {Sweet potato virus SPVG)禾口甘薯脈花葉病毒(Sfveet potato vein mosaic virus, SPVMV)是危害甘薯的主要病毒，4種病毒都屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)A種病毒或與其他病毒常常混合侵染甘薯，造成甘薯產量降低，品質變劣和種性退化，對甘薯生產造成嚴重危害。對甘薯病毒病目前尚無特別有效的化學防治方法，利用莖尖分生組織培養，培育脫毒甘薯是防治病毒病最有效的方法。 在脫毒甘薯的培養和脫毒種薯(苗)實現產業化過程中，病毒的快速檢測技術是保證脫毒種薯質量以及實現脫毒種薯產業化非常關鍵的技術。只有利用快速、高效的病毒檢測技術， 篩選出真正無毒的試管苗并及時淘汰不同級別的感病種苗，才能使真正的脫毒種薯用于生產，確保脫毒種薯的增產效果，進而加快脫毒種薯的推廣進程。因此，建立甘薯病毒高效的檢測技術是培育脫毒甘薯的前提和基礎。目前用于甘薯病毒檢測的常用方法是酶聯免疫吸附(ELISA)技術，以及在此基礎上建立的硝酸纖維素膜酶聯免疫吸附測定(NCM-ELISA)技術。由于侵染甘薯的PoiJ^ir皿^病毒種類較多，當不需要確定病毒種類，只需要確定樣品中是否含有病毒時(譬如對甘薯脫毒莖尖苗進行檢測)，利用上述方法進行檢測時需要對各種病毒逐一進行檢測，往往費時費力，造成浪費。

發明內容
本發明要解決的技術問題克服背景技術中的問題，提供一種簡便、高效和低成本的檢測甘薯上四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的試劑盒；
另外還提供了這種試劑盒的檢測方法。本發明的技術方案
甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學檢測試劑盒，所述試劑盒分為上、下兩層，上、下兩層之間設置有隔板，上層還設有試劑瓶插孔，插孔中放置有試劑瓶，下層為可推拉的抽屜，抽屜中放置有硝酸纖維素膜；不同試劑瓶中分別裝有馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體、馬鈴薯Y病毒屬病毒的混合抗體以及堿性磷酸脂酶標記的羊抗兔IgG、氯化硝基四氮唑藍、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽和1Tris-HCl溶液。所述試劑瓶為九個，其中一號試劑瓶裝有甘薯羽狀斑駁病毒SPFMV抗體，二號試劑瓶裝有甘薯潛隱病毒SPLV抗體，三號試劑瓶裝有甘薯G病毒SPVG抗體，四號試劑瓶裝有甘薯脈花葉病毒SPVMV抗體，五號試劑瓶裝有上述四種病毒的混合抗體；六號試劑瓶裝有工作濃度為1 :1000倍的堿性磷酸脂酶標記的羊抗兔IgG，七號試劑瓶裝有濃度為50mg/ml 的氯化硝基四氮唑藍NBT，八號試劑瓶裝有濃度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽BCIP，九號試劑瓶9裝有pH為7. 5的2M Tris-HCl溶液。所述四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體均是利用大腸桿菌中表達的病毒外殼蛋白，通過純化蛋白、免疫家兔的方法制備獲得，所述四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體和混合抗體的效價均為4096倍，工作濃度為1 :1000倍。甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟
(1)準備硝酸纖維素NC膜剪取合適大小的NC膜，用鉛筆在膜上做好標記，以便于點
樣；
(2)樣品處理將0.Ig甘薯樣品于液氮中速凍，并研磨成粉末，加入ΙΟΟμΙ抽提緩沖液， 繼續研磨至徹底裂解并轉移到離心管中，5000rpm離心5min ；
(3)點樣將NC膜置于TBS中浸泡1min，用濾紙吸去膜表面的液體，取上清液5μ1點于膜上，室溫晾干；
(4)封閉加入IOml封閉液于培養皿中，將膜浸入其中，室溫孵育60min ；
(5)洗膜棄去封閉液，用TBS洗膜一次；
(6)加一抗將NC膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的抗體中，室溫下以50rpm/min 的速度振蕩，孵育過夜；
(7)洗膜棄一抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；
(8)加二抗用濾紙吸去NC膜上多余的溶液，然后將NC膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的酶標抗體中，室溫下以50rpm/min的速度振蕩，孵育1 h ；
(9)洗膜棄二抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；
(10)顯色將NC膜置于NBT和BCIP的底物溶液中，每5ml底物緩沖液先加入33μ1 ΝΒΤ，再加入16. 5μ1 BCIP，室溫下以50 rpm/min的速度搖床振蕩，避光顯色5_30 min ；
(11)終止反應將NC膜從底物溶液中取出，用蒸餾水洗NC膜3次，3-4min/次；
(12)陽性判斷將NC膜晾干后觀察顏色反應，比較檢測樣品與正負對照的顏色反應， 出現紫色的樣品為陽性。所述抽提緩沖液為TBS和0. 2%亞硫酸鈉的混合液。所述封閉液的成分為TBSJ%脫脂奶粉和洲聚乙二醇辛基苯基醚的混合物。 所述工作濃度的抗體為SPFMV、SPLV, SPVG, SPVMV抗體或混合抗體，抗體工作濃度均為1 :1000倍；所述酶標抗體為堿性磷酸酯酶標記的羊抗兔IgG抗體，酶標抗體的工作濃度為1 :1000倍。本發明的有益效果
(1)本發明提供了一種檢測甘薯上病毒的簡便、高效和低成本的試劑盒。 檢測樣品時，當只需要確定樣品中是否含有PoiJ^ir皿M病毒時使用試劑盒中裝有混合抗體的試劑瓶進行檢測；當需要確定含有某種特定病毒時，再使用其他試劑瓶中的特異性抗體，檢測方便，節省了檢測成本。(2)本發明的檢測方法簡單、直觀，只需要將NC膜晾干后觀察顏色反應，比較檢測樣品與正負對照的顏色反應，出現紫色顏色反應的樣品為陽性，從而判斷出是否含有Potyviruses病毒，方便實用。
(3)本試劑盒可應用于脫毒甘薯莖尖苗和各級種薯的檢測，通過對/^ij^irMM 病毒的快速高效檢測，可以確保脫毒甘薯的質量和增產效果；也可對甘薯病毒的種類進行特異性檢測，可應用于甘薯種薯調運以及病害調查等過程中。
(4)本試劑盒特別適用于甘薯脫毒莖尖苗的檢測，也可直接推廣到基層農技單位開展病害普查和預測預報，或用于脫毒甘薯種薯的質量監測，使真正的脫毒甘薯應用于生產。


圖1 本發明的試劑盒結構示意圖；圖2 本發明的試劑盒對甘薯樣品檢測結果顯示圖。
具體實施方式
實施例1、甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學檢測試劑盒，參見圖1，圖中1為試劑盒上層，2為試劑瓶，3為試劑盒下層。
試劑盒中含有四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體和一種混合抗體，所述的試劑盒分為上、下兩層，上、下兩層之間設置有隔板，上層還設有試劑瓶插孔，插孔中放置有試劑瓶，下層為可推拉的抽屜，抽屜中放置有硝酸纖維素膜；上層的試劑瓶為九個，分別為一號至九號試劑瓶，其中一號試劑瓶中的甘薯羽狀斑駁病毒SPFMV抗體，二號試劑瓶為甘薯潛隱病毒SPLV抗體，三號試劑瓶為甘薯G病毒SPVG抗體，四號試劑瓶為甘薯脈花葉病毒 SPVMV抗體，五號試劑瓶為上述四種病毒的混合抗體；六號試劑瓶為工作濃度為1 :1000倍的堿性磷酸脂酶標記的羊抗兔IgG 二抗，七號試劑瓶為濃度為50mg/ml的氯化硝基四氮唑藍NBT，八號試劑瓶為濃度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽BCIP，九號試劑瓶 9 為 pH 為 7. 5 的 2M Tris-HCl 溶液。
SPFMV、SPLV、SPVG、SPVMV 4種病毒的抗體均是利用在大腸桿菌中表達的病毒外殼蛋白，通過純化蛋白，免疫家兔的方法制備獲得，4種病毒的抗體以及混合抗體的效價均為 4096倍，工作濃度為1 :1000倍。
用試劑盒檢測樣品時，當只需要確定樣品中是否含有馬鈴薯Y病毒屬病毒時，使用混合抗體的五號試劑瓶進行檢測；當需要確定含有馬鈴薯Y病毒屬病毒的某種病毒時， 則使用一號至四號試劑瓶進行檢測。
實施例2、甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟1、緩沖液的配制(1)TBS 0. 02M Tris+0. 50M NaCl，ρΗ7·5 ；(2)抽提緩沖液TBS+0.2%亞硫酸鈉；(3)封閉液:TBS+2%脫脂奶粉 +2% triton X-100 ；(4)抗體緩沖液TBS+^)脫脂奶粉；(5)T-TBS :TBS+0. 05% Tween 20 ；(6)底物緩沖液0.IM Tris+ 0. IM NaCl+5mM MgCl2'6H20, pH=9. 5 ；其中M是指單位mol/L。
2、檢測步驟(1)準備硝酸纖維素膜(NC膜):剪取合適大小的NC膜，用鉛筆在膜上做好標記，以便于點樣。
(2)樣品處理將0. Ig甘薯樣品于液氮中速凍并研磨呈粉末，加入ΙΟΟμΙ抽提緩沖液(TBS+ 0. 2%亞硫酸鈉)繼續研磨至徹底裂解，并轉移到1.5ml離心管中，5000rpm離心 5min。
(3)點樣將NC素膜于TBS中浸泡1 min，用濾紙吸去膜表面液體，取上清液5μ1 點于膜上，室溫晾干。
(4)封閉加入IOml封閉液(TBS+覬脫脂奶粉+2%triton X-100)于培養皿中，將 NC膜浸入其中，室溫孵育60 min。
(5)洗膜棄去封閉液，用TBS洗NC膜一次。
(6)加一抗(SPFMV、SPLV、SPVG、SPVMV 抗體或混合抗體)將NC膜置于用抗體緩沖液(TBS+洲脫脂奶粉)稀釋至工作濃度的抗體(SPFMV、SPLV、 SPVG、SPVMV抗體或混合抗體)中，室溫下振蕩(50rpm/min)孵育過夜，所有抗體的工作濃度均為1 :1000倍。
(7)洗膜棄一抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次。
(8)加二抗(堿性磷酸酯酶標記的羊抗兔IgG)用濾紙吸去膜上多余的溶液，然后將NC膜置于用抗體緩沖液(TBS+洲脫脂奶粉)稀釋至工作濃度的酶標抗體(堿性磷酸酯酶標記的羊抗兔IgG)中，室溫下振蕩(50rpm/min)孵育1 h ；二抗的工作濃度為1 :1000倍。
(9)洗膜棄二抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次。
(10)顯色將NC膜置于NBT/BCIP底物溶液中，每5ml底物緩沖液先加入33μ NBT, 再加入16. 5μ1 BCIP室溫下搖床振蕩(50 rpm/min)避光顯色5_30 min (必要時增加顯色時間)。
(11)終止反應將NC膜從底物溶液中取出，用蒸餾水洗NC膜3次，3-4min/次。
(12)陽性判斷晾干后觀察顏色反應，比較檢測樣品與正負對照的顏色反應，出現紫色顏色反應的樣品為陽性。
實施例3、甘薯上/^ij^irMM病毒血清學檢測試劑盒的應用利用本試劑盒，對采自田間的M份田間甘薯樣品進行檢測。檢測步驟按實施例2的步驟。一抗采用混合抗體抗血清(五號試劑瓶)。工作濃度為1 :1000倍。結果表明，M份甘薯樣品中有10份甘薯樣品呈陽性反應(見圖2)，陽性率為41. 7%，說明這些甘薯樣品上普遍每板Potyviruses病毒。
圖2中，上排1、2、3、4、5、6、7、8，以及下排1、2為陽性樣品。
權利要求
1.甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒分為上、 下兩層，上、下兩層之間設置有隔板，上層還設有試劑瓶插孔，插孔中放置有試劑瓶，下層為可推拉的抽屜，抽屜中放置有硝酸纖維素膜；不同試劑瓶中分別裝有馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體、馬鈴薯Y病毒屬病毒的混合抗體以及堿性磷酸脂酶標記的羊抗兔IgG、氯化硝基四氮唑藍、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽和Tris-HCl溶液。
2.如權利要求1所述的血清學檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑瓶為九個，其中一號試劑瓶裝有甘薯羽狀斑駁病毒SPFMV抗體，二號試劑瓶裝有甘薯潛隱病毒SPLV抗體，三號試劑瓶裝有甘薯G病毒SPVG抗體，四號試劑瓶裝有甘薯脈花葉病毒SPVMV抗體，五號試劑瓶裝有上述四種病毒的混合抗體；六號試劑瓶裝有工作濃度為1 :1000倍的堿性磷酸脂酶標記的羊抗兔IgG，七號試劑瓶裝有濃度為50mg/ml的氯化硝基四氮唑藍NBT，八號試劑瓶裝有濃度50mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽BCIP，九號試劑瓶9裝有pH為7. 5 的 2M Tris-HCl 溶液。
3.如權利要求1-3任一項所述的血清學檢測試劑盒，其特征在于，所述四種馬鈴薯Y 病毒屬病毒的特異性抗體均是利用大腸桿菌中表達的病毒外殼蛋白，通過純化蛋白、免疫家兔的方法制備獲得，所述四種馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體和混合抗體的效價均為 4096倍，工作濃度為1 :1000倍。
4.甘薯上馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于所述檢測方法包括以下步驟(1)準備硝酸纖維素NC膜剪取合適大小的NC膜，用鉛筆在膜上做好標記，以便于點樣；(2)樣品處理將0.Ig甘薯樣品于液氮中速凍，并研磨成粉末，加入ΙΟΟμΙ抽提緩沖液， 繼續研磨至徹底裂解并轉移到離心管中，5000rpm離心5min ；(3)點樣將NC膜置于TBS中浸泡1min，用濾紙吸去膜表面的液體，取上清液5μ1點于膜上，室溫晾干；(4)封閉加入IOml封閉液于培養皿中，將膜浸入其中，室溫孵育60min ；(5)洗膜棄去封閉液，用TBS洗膜一次；(6)加一抗將NC膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的抗體中，室溫下以50rpm/min 的速度振蕩，孵育過夜；(7)洗膜棄一抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；(8)加二抗用濾紙吸去NC膜上多余的溶液，然后將NC膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的酶標抗體中，室溫下以50rpm/min的速度振蕩，孵育1 h ；(9)洗膜棄二抗，用T-TBS溶液洗NC膜3-4次，3min/次；(10)顯色將NC膜置于NBT和BCIP的底物溶液中，每5ml底物緩沖液先加入33μ1 ΝΒΤ，再加入16. 5μ1 BCIP，室溫下以50 rpm/min的速度搖床振蕩，避光顯色5_30 min ；(11)終止反應將NC膜從底物溶液中取出，用蒸餾水洗NC膜3次，3-4min/次；(12)陽性判斷將NC膜晾干后觀察顏色反應，比較檢測樣品與正負對照的顏色反應， 出現紫色的樣品為陽性。
5.如權利要求4所述的檢測方法，其特征在于所述抽提緩沖液為TBS和0.2%亞硫酸鈉的混合液。
6.如權利要求4所述的檢測方法，其特征在于所述封閉液的成分為TBSJ%脫脂奶粉和洲聚乙二醇辛基苯基醚的混合物。
7.如權利要求4-6任一項所述的檢測方法，其特征在于所述工作濃度的抗體為 SPFMV, SPLV, SPVG, SPVMV抗體或混合抗體，抗體工作濃度均為1 :1000倍。
8.如權利要求4-6任一項所述的檢測方法，其特征在于所述酶標抗體為堿性磷酸酯酶標記的羊抗兔IgG抗體，酶標抗體的工作濃度為1 :1000倍。
全文摘要
本發明涉及涉及甘薯上的馬鈴薯Y病毒屬病毒的血清學檢測試劑盒及其檢測方法。試劑盒分為上、下兩層，上層放置有試劑瓶，下層為可推拉的抽屜，抽屜中放有硝酸纖維素膜；不同試劑瓶中分別裝有馬鈴薯Y病毒屬病毒的特異性抗體、馬鈴薯Y病毒屬病毒的混合抗體以及堿性磷酸脂酶標記的羊抗兔IgG、NBT、BCIP和Tris-HCl溶液。檢測樣品時，當需要確定樣品中是否含有馬鈴薯Y病毒屬病毒時，使用混合抗體試劑瓶檢測；當需要確定某種特定病毒時，使用其他特異性抗體檢測，檢測方便，節省成本，檢測方法簡單、直觀，方便實用。本發明可應用于脫毒甘薯莖尖苗和各級種薯的檢測，通過對Potyviruses病毒的快速高效檢測，可以確保脫毒甘薯的質量和增產效果。
文檔編號G01N33/558GK102520185SQ201110368009
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月18日 優先權日2011年11月18日
發明者喬奇, 張德勝, 張振臣, 王永江, 王爽, 田雨婷, 秦艷紅 申請人:河南省農業科學院