專利名稱：利用3C-SiC納米顆粒光致發光譜測量細胞內pH的方法
技術領域：
本發明涉及一種簡單、方便的利用3C-SiC納米顆粒光致發光信號測量細胞內pH 值的方法，測量精度高，無毒并可用于長時間測量。
背景技術：
碳化娃是第一元素半導體材料(Si)和第二代化合物半導體材料GaAs、GaP、和InP 之后發展起來的第三代寬帶隙半導體材料。3C-SiC具有較大的帶隙寬度(2. 24eV)而且具有高臨界擊穿電場、高熱導率、高載流子漂移速度等特點，在高溫、高頻、大功率、光電子和抗輻射等方面具有巨大的應用潛力。用碳化硅代替硅，制備光電器件與集成電路，可為軍用電子系統和武器裝備性能的提高，以及抗惡劣環境的電子設備提供新型器件。同時，碳化硅具有很好的生物相容性，并且SiC的密度較小，化學穩定性較好，所以碳化硅納米顆粒在生物醫學領域得到廣泛應用，如可以用作發光生物標簽等，臨床醫學上很早之前就已經開始使用碳化硅作為血管支架應用于冠狀血管清理手術。碳化硅納米顆粒可以通過兩種方法制備。第一種方法是通過各種化學反應生成碳化娃納米顆粒，比如碳離子注入娃片[L. S. Liao, X. M. Bao, Z. F. Yang, and N. B. Min, AppI. Phys. Lett. 66, 2382 (1995)]，碳離子和娃離子共派射二氧化娃薄膜[J. Zhao, D. S. Mao, Z. X. Lin, B. Y. Jiang, Y. H. Yu, X. H. Liu, H. Z. Wang, and G. Q. Yang，AppI. Phys. Lett. 73， 1838 (1998) ]，C60 偶聯多孔硅[X. L. Wu, G. G. Siu，M. J. Stokes，D. L Fan，Y. Gu，and X. M. Bao, Appl. Phys. Lett. 77,1292 (2000)]等制備方法。第二種方法是電化學腐蝕法，即用電化學法方法，腐蝕3C-SiC多晶片，再經超聲振蕩，得到懸浮于溶液的碳化硅納米顆粒，能穩定發射強度較高的藍光[X. L. ffu, J. Y. Fan, T. Qiu, X. Yang, G. G. Siu, and P. K. Chu, Phys. Rev. Lett. 94，026102 (2005)]。第三種是使用化學腐蝕法，在氫氟酸和硝酸混合液中加熱直接腐蝕碳化硅顆粒，腐蝕后產物在水溶液中過濾再超聲振蕩得到懸浮于溶液中的碳化娃納米顆粒[J. Zhu, Z. Liu, X. L. ffu, L. L. Xu, ff. C. Zhang and Paul K Chu, Nanotech. 18, 365603(2007)]。細胞內的pH值幾乎可以影響細胞內所有重大的化學反應，包括細胞生產和衰老、 細胞膜的離子輸運、細胞內酶活性以及細胞吞噬等。所以細胞內PH值的測量對于生物學有重要價值。傳統的測量手段是使用一系列有機熒光染料(如1，4-DHPN、HPTS、BCECF、BCPCF 等)，利用這些染料的發光強度來標定細胞內PH值。但是有機物在細胞內容易被酶分解從而被漂白，使得它們不能用于長時間的PH測量。另外，有些有機物會同細胞內的蛋白質特異性結合，使得蛋白質失活從而引起細胞毒性。

發明內容
本發明的目的在于克服有機熒光染料用于測量細胞內pH值的缺陷，首次提出一種簡單、廉價的應用無機3C-SiC納米顆粒測量細胞內pH值的方法。尤其是提出了應用無機納米材料測量細胞內PH值的方法，并在巨噬細胞、K562白血病細胞和倉鼠卵巢細胞中進行細胞內PH測量實驗，結果與用有機熒光染料測量出的細胞內pH值結論相符。本發明的技術方案是利用3C_SiC納米顆粒光致發光譜測量細胞內pH的方法，應用化學腐蝕方法制備3C-SiC納米顆粒，將所述3C-SiC納米顆粒加入細胞培養液中，逐漸改變培養液PH值同時在360nm波長的激發光源下測量溶液光致發光譜，將發光譜分解可得到帶帶復合的發光峰和表面H+和0H_離子鍵合的發光峰，兩峰強度比與pH值在5. 6-7. 4范圍內呈線性關系。發光譜線中可以得到3C-SiC由表面0H_和H+離子引起的表面態510nm發光峰同帶帶復合450nm發光峰的強度比值。應用此線性關系在巨噬細胞、K562白血病細胞和倉鼠卵巢細胞中進行細胞內PH測量實驗，結果與已知結論相符。將含3C-SiC納米顆粒的培養液用于細胞培養，培養之后將原細胞培養液加入新鮮不含3C-SiC的培養液，測量此溶液光致發光，得到的發光峰強度比值代入線性關系即可得到細胞內PH值。含3C-SiC納米顆粒的培養液的的濃度一般O. 5-2g的3C-SiC納米顆粒/IOml細胞培養液。細胞培養時間16-48小時左右，可根據情況調節培養時間，為使發光信號足夠強， 培養時間不得低于6小時。所述培養液中的3C-SiC納米顆粒尺寸應在4-7nm左右。所述的化學腐蝕方法制備3C_SiC納米顆粒的制備方法為現有技術將3C_SiC粉末IOg加入混和酸IOO-IlOml中，加熱反應(一般在100_110°C加熱I小時)，冷卻后將反應后的酸液與粉末一起離心，倒出上層酸液，取下層粉末，干燥，在干燥后的粉末里加入20 40ml細胞培養液，超聲振蕩30-60min，靜置，取上層清液，所述混合酸由體積比為3 I 3.5 I的40%的氫氟酸與65%的硝酸組成。含3C_SiC納米顆粒的培養液用于細胞培養時間可以視情況調節，由于無機材料不會被細胞內酶漂白，可以長時間培養，本實驗選擇的培養時間為24小時。本發明的有益效果是本發明首先使用無機納米材料測量細胞內pH值的方法，測量的結果準確，材料制備簡單，無毒并可用于長時間測量。本發明使用無機材料測量細胞內 PH值的方法，這種新材料在測量過程中不易被細胞內酶分解，可用于長時間測量，同時不與細胞內蛋白質結合，細胞毒性低。可以有效的克服有機熒光染料的不足，具有廣闊的應用前
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圖I——制備于培養液中的3C-SiC納米顆粒的透射電鏡照片。其中(b)圖為高分辨圖片；(C)圖為電鏡拍攝圖片中納米顆粒的尺寸分布。圖2——360nm激發光下測量發光譜分解可得到表面H+和0H—離子鍵合的發光峰和帶帶復合的發光峰強度之比與PH值關系圖。圖3——巨噬細胞吞噬3C_SiC納米顆粒后的光致發光譜和共聚焦顯微鏡照片，測量得到巨噬細胞內PH值為7. 3。其中(a)圖為360nm激發光下測量巨噬細胞光致發光譜； (b)圖為360nm激發光和白光下巨曬細胞的顯微圖像；(c)圖為360nm激發光下巨曬細胞的顯微圖像；(d)圖為白光背景下巨噬細胞的顯微圖像。圖4——K562白血病細胞吞噬3C_SiC納米顆粒后的光致發光譜和共聚焦顯微鏡照片，測量得到K562白血病細胞內pH值為7. 4。其中(a)圖為360nm激發光下測量K562 白血病細胞光致發光譜；(b)圖為360nm激發光和白光下K562白血病細胞的顯微圖像；(c) 圖為360nm激發光下K562白血病細胞的顯微圖像；(d)圖為白光背景下K562白血病細胞的顯微圖像。圖5——倉鼠卵巢細胞吞噬3C_SiC納米顆粒后的光致發光譜和共聚焦顯微鏡照片，測量得到倉鼠卵巢細胞內PH值為6. 7。其中(a)圖為360nm激發光下測量倉鼠卵巢細胞光致發光譜；(b)圖為360nm激發光和白光下倉鼠卵巢細胞的顯微圖像；(c)圖為360nm 激發光下倉鼠卵巢細胞的顯微圖像；(d)圖為白光背景下倉鼠卵巢細胞的顯微圖像。
具體實施例方式普通化學腐蝕所用酸為40%的氫氟酸與65%的硝酸，體積比為3 I。制備時稱取3C-SiC粉末10g，加入以上混和酸IOOml中，在恒溫浴槽100°C加熱I小時。冷卻后將反應后的酸液與粉末一起在高速離心機中離心，倒除上層酸液，取下層粉末，在烘箱中80°C左右進行干燥。在干燥后的粉末中加入20 40ml細胞培養液，超聲振蕩30分鐘，靜置數小時，取上層清液。此清液中即含有尺寸4nm左右的3C-SiC納米顆粒。取IOml上述培養液稀釋10倍，將此培養液用于細胞培養，選擇的細胞為巨噬細胞、K562白血病細胞和倉鼠卵巢細胞三種細胞。24小時后將原培養液去除并加入新鮮不含 3C-SiC的培養液，測量此細胞溶液的光致發光。將得到的譜線分解，相應的發光強度比與對應的線性關系對照，得到細胞內PH值。
權利要求
1.一種利用3C-SiC納米顆粒光致發光譜測量細胞內pH值的方法，其特征是將3C-SiC 納米顆粒加入培養液中，逐漸改變培養液pH值同時在360nm激發光下測量溶液光致發光譜，將發光譜擬合可得到帶帶復合的發光峰和表面H+和0H_離子鍵合的發光峰，兩峰強度比與pH值在5. 6-7. 4范圍內呈線性關系。
2.根據權利要求I所述的利用3C-SiC納米顆粒光致發光譜測量細胞內pH值的方法，其特征是用含有3C-SiC納米顆粒的培養液培養細胞，培養后將細胞培養液換為不含 3C-SiC納米顆粒的培養液，測量細胞溶液的光致發光譜，得到的發光峰強度比值代入線性關系即可得到細胞內PH值；含3C-SiC納米顆粒的培養液的的濃度l_5mg的3C_SiC納米顆粒/IOml細胞培養液。
3.如權利要求2所述的利用3C-SiC納米顆粒光致發光譜測量細胞內pH值的方法，其特征是細胞培養時間為24小時左右，可根據情況調節培養時間，為使發光信號足夠強，培養時間不得低于6小時。
4.如權利要求I中所述的利用3C-SiC納米顆粒光致發光譜測量細胞內pH值的方法， 其特征是培養液中的3C-SiC納米顆粒尺寸在4-7nm左右。
全文摘要
本發明涉及一種利用3C-SiC納米顆粒光致發光譜測量細胞內pH值的方法，將3C-SiC納米顆粒加入培養液中，逐漸改變培養液pH值同時在360nm激發光下測量溶液光致發光譜，將發光譜擬合可得到帶帶復合的發光峰和表面H+和OH-離子鍵合的發光峰，兩峰強度比與pH值在5.6-7.4范圍內呈線性關系。本發明使用無機材料測量細胞內pH值的方法，這種新材料在測量過程中不易被細胞內酶分解，可用于長時間測量，同時不與細胞內蛋白質結合，細胞毒性低。可以有效的克服有機熒光染料的不足，具有廣闊的應用前景。
文檔編號G01N21/63GK102590154SQ20121000664
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者吳興龍, 沈劍滄, 郭俊宏 申請人:南京大學