專利名稱：苯乙醇胺a的免疫膠體金檢測卡及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及β -腎上腺素受體激動劑檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，接連不斷的瘦肉精事件已成為中國食品安全領(lǐng)域揮之不去的幽靈。去年，湖南省成功破獲一起涉及福建、湖南、浙江三省的瘦肉精生產(chǎn)、銷售案件，并從飼料中檢測出以前從未出現(xiàn)過的苯乙醇胺Α，這種瘦肉精新品種的出現(xiàn)，再次敲響了我國食品安全警
鐘。 苯乙醇胺Α，又稱“克倫巴胺”，可被非法添加于豬和牛的飼料中，有刺激動物生長，加強(qiáng)蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)沉積，提高基礎(chǔ)代謝水平，使體脂趨于分解等作用，也可促進(jìn)豬生長速度加快、使其皮紅毛亮、瘦肉率提高。人食用含這種瘦肉精的肉后，會出現(xiàn)惡心、頭暈、四肢無力、手顫等中毒癥狀，甚至誘發(fā)高血壓、心臟病等。因此，近期被農(nóng)業(yè)部第1519號公告列為“禁止在飼料和動物飲水中使用的物質(zhì)”。現(xiàn)有技術(shù)對于苯乙醇胺A的檢測主要是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法等檢測方法，但這些技術(shù)的缺陷明顯設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、難以推廣。所以，建立一種簡單、有效、適合基層使用的測定方法是極其必要的。本發(fā)明的目的是研制一種更適合企業(yè)進(jìn)行現(xiàn)場檢測且快捷簡便、成本低廉的定性檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上情況，本發(fā)明的目的就是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，可有效解決能快速、簡便地檢測出β -腎上腺素受體激動劑苯乙醇胺A的問題。本發(fā)明的苯乙醇胺A膠體金檢測卡，包括包被了單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金結(jié)合墊、包被了苯乙醇胺A-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板和塑料模具組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。本發(fā)明的苯乙醇胺A膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實現(xiàn)
(1)膠體金溶液制備取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL，繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時，維持5 min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)抗體的預(yù)處理將要標(biāo)記的苯乙醇胺A抗體在1000r/min, 4°C條件下，離心20min,取上清，用 O. 01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/mL ;或者用 O. 01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/mL,過O. 22 Mm濾膜；
(3)膠體金標(biāo)記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應(yīng)10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min ;金標(biāo)抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C,12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至I mL,制備成苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；
(4)膠體金膜的制備將步驟(3)苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用劃膜儀以5PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜；
(5)包被膜制備將羊抗鼠IgG抗體、苯乙醇胺A蛋白質(zhì)偶聯(lián)物稀釋成Img/mL，用劃膜儀依次以I KL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干； (6)樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測卡的組裝PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。所述步驟(5)中所包被的檢測線T設(shè)在質(zhì)控線C的下方；
所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和O. 8 g氯化鈉(NaCl),用含有 O. 5%TRIT0N-100 的 O. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL ；
本發(fā)明可有效用于測定β -腎上腺素受體激動劑苯乙醇胺Α，方法簡單，方便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確。


圖I為本發(fā)明苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡的結(jié)構(gòu)圖圖中I.加樣孔 2.檢測線3.質(zhì)控線4.檢測孔5.試紙條6.檢測卡外殼；
圖2為本發(fā)明苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡內(nèi)的試紙條的剖視結(jié)構(gòu)圖，圖中7.樣品墊8.膠體金結(jié)合墊9. PVC膠板10.硝酸纖維素膜11.吸水墊。
具體實施例方式實施例I
圖I為本發(fā)明苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡的結(jié)構(gòu)圖、圖2為本發(fā)明苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡內(nèi)的試紙條的剖視結(jié)構(gòu)圖圖中9為PVC膠板；7為樣品墊；8為膠體金結(jié)合墊，該膠體金結(jié)合墊上包被了單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；10為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了苯乙醇胺A-BSA和羊抗鼠IgG ;11為吸水墊，由吸水材料如濾紙制成。在PVC膠板9的一端上(樣品端)粘附樣品墊7、膠體金結(jié)合墊8，樣品墊7和膠體金結(jié)合墊8為并排結(jié)構(gòu)。在PVC膠板9的中間粘附硝酸纖維素膜10。在硝酸纖維素膜10上設(shè)置有羊抗鼠IgG質(zhì)控線3和苯乙醇胺A-BSA檢測線2。在PVC膠板9的另一端粘附吸水墊11。硝酸纖維素膜10的一端與結(jié)合墊8略交叉，另一端與吸水墊11略交叉。該試紙條5可裝入有塑料模具制成的檢測卡外殼6中，在檢測卡外殼6的上蓋上設(shè)有加樣孔I和檢測孔4，樣品墊7正對加樣孔1，硝酸纖維素膜10正對檢測孔4。實施例2
苯乙醇胺A膠體金檢測卡制備，是由以下步驟具體實現(xiàn)
(1)膠體金溶液制備取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL，繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時，維持5 min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)抗體的預(yù)處理將要標(biāo)記的苯乙醇胺A抗體在1000r/min, 4°C條件下，離心20min,取上清,用 O. 01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/mL ;或者用 O. 01 mol/L PBS 稀釋成 I mg/mL, 過O. 22 Mm濾膜；
(3)膠體金標(biāo)記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應(yīng)10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min ;金標(biāo)抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C,12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至I mL,制備成苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；
(4)膠體金膜的制備將步驟(3)苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用劃膜儀以5PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜；
(5)包被膜制備將羊抗鼠IgG抗體、苯乙醇胺A蛋白質(zhì)偶聯(lián)物稀釋成Img/mL，用劃膜儀依次以I KL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
(6)樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測卡的組裝PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。實施例3 最低檢出限量試驗
苯乙醇胺A最低檢出限量試驗
準(zhǔn)確稱量O. 500 g苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品溶于超純水并定容至100 mL,標(biāo)為A1溶液，取A1溶液I mL于容量瓶加超純水并定容至1000 mL，形成A2溶液，取A2溶液I mL于容量瓶加超純水并定容至1000 mL,形成A3溶液，則A3溶液的濃度為5 ng/mL (5ppb)。取A3溶液ImL于4支試管中，并分別標(biāo)號廣4，往試管中分別加入往9 mL、4 mL、l mL、0 mL超純水，配成苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別是0. 5 ng/mL、l ng/mL、2. 5 ng/mL>5 ng/mL ;另取一支空試管，加入5 mL超純水,標(biāo)為5號試管。取上述I、號試管中液體作為樣品滴加到苯乙醇胺A檢測卡上，加樣后5 min觀察結(jié)果，檢測線2和質(zhì)控線3的顯色結(jié)果見表I。表I苯乙醇胺A最低檢出限量試驗
權(quán)利要求
1.苯乙醇胺A膠體金檢測卡，其特征在于按照下述步驟制備得到 膠體金溶液制備取I L三角燒瓶I個，加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4 · 3H20 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉Na3C6H5O7 · 2H20溶液5_7 mL,繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時，維持5 min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆茫? 抗體的預(yù)處理將要標(biāo)記的苯乙醇胺A抗體在1000 r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清，用O. 01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用O. 01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL,過O. 22 Mm 濾膜； 膠體金標(biāo)記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40 mL，用O. 25 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應(yīng)10 min ;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min ;金標(biāo)抗體溶液常溫1500 r/min離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4 , 12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至I mL,制備成苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標(biāo)記物； 膠體金膜的制備將步驟(3)苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含苯乙醇胺A單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜； 包被膜制備將羊抗鼠IgG抗體、苯乙醇胺A蛋白質(zhì)偶聯(lián)物稀釋成I mg/mL，用劃膜儀依次以I KL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干； 樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干； 檢測卡的組裝PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的苯乙醇胺A膠體金檢測卡，其特征在于所述步驟(5)中所包被的檢測線T設(shè)在質(zhì)控線C的下方； 所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白和O. 8 g氯化鈉，用含有O. 5%TRIT0N-100 的 O. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
全文摘要
本發(fā)明苯乙醇胺A的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，涉及β-腎上腺素受體激動劑檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的檢測卡外殼中的試紙條，由PVC膠板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成；膠體金膜為含苯乙醇胺A單克隆抗體的玻璃纖維素膜，包被膜是硝酸纖維素膜，其上設(shè)有T線和C線，T線包被有苯乙醇胺A蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，C線包被有羊抗鼠IgG抗體。本發(fā)明有效用于快速檢測苯乙醇胺A，方便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確。
文檔編號G01N33/577GK102901819SQ201210366789
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者杜道林, 洪霞, 張禎, 薛永來 申請人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司