專利名稱：除草劑2,4-d-殺蟲劑chi二聯檢測卡及其制備方法
技術領域：
本發明涉及環境激素檢測技術領域，特別是涉及一種除草劑2，4-D-殺蟲劑CHI 二聯檢測卡及其制備方法。
背景技術：
近些年來，科學家們接連發現一些存在于生物機體之外，具有與人和生物內分泌激素作用類似的物質，這些物質能夠模擬內分泌激素功能從而引起生物體內分泌系統紊舌L就將之稱為環境激素或環境荷爾蒙。環境激素已成為繼臭氧層、地球氣候變暖之后全球的第三大環境問題，成為環境科學研究領域中的熱門課題。環境激素是指外因性干擾生物體內分泌的化學物質。由于人類活動而釋放到環境中的化學物質，在動物和人體內發揮類似雌激素的作用。它能通過與激素受體結合，干擾生物體正常的生理代謝、內分泌和生殖機能，引起種種負面的生物學效應。環境激素通過環境介質和食物鏈進入人或動物體內，干擾其內分泌系統和生殖功能系統，甚至有引發惡性腫瘤與生物絕種的危害。現代工農業生產在不斷滿足人類的生活需要的同時也給環境帶來了沉重的負擔，并且已經威脅到人類的生殖健康，甚至物種的繁衍。我國是世界上的農藥生產與使用大國，資料顯示2011年我國農藥原藥產量為264. 87萬噸，其中殺蟲劑原藥產量為70. 9萬噸，占總產量的44. 35% ;除草劑產量為117. 5萬噸，占總產量的26. 77% ;殺菌劑原藥產量為15萬噸，占總產量的5.67%。此類農藥除部分出口外，大部分在國內銷售和使用。據相關數據估算我國每年約有5(Γ60萬噸有機氯農藥直接排放至環境中，如除草劑2，4-滴(2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid, 2, 4-D)、殺蟲劑毒死蝶(Chlorpyrifos, CHI)及真菌劑五氯苯酹(Pentachlorophenol,PCP)。而多數有機氯農藥具有較強的內分泌干擾作用。此類農藥一旦進入環境就會通 過多種暴露途徑進入生物體內，富集于生物體的脂肪組織內進而危害人和動物的生殖健康。目前，環境激素污染物的分析方法主要分為以GC-MS、HPLC與LC-MS技術為代表的儀器分析方法以及基于抗原抗體反應的免疫分析方法，這些常規的殘留分析方法通常操作程序復雜，效率較低，分析成本較高，不利于推廣使用，難以適應大量樣本和現場檢測的要求。基于環境激素污染物的危害性、代表性及目前的研究熱點，本發明涉及一種除草劑2，4-D和殺蟲劑CHI 二聯檢測卡及其制備方法。本發明的檢測卡具有簡便快捷、易于操作、成本低廉等優點，并且能同時檢測水樣中這兩種環境激素污染物質，產生了良好的社會效益和經濟效益。

發明內容
本發明的目的在于提供一種能同時檢測水樣中除草劑2，4-D和殺蟲劑CHI的檢測卡，適合進行現場檢測且選擇性好、穩定性強、簡單方便、成本低廉的優點。本發明的除草劑2，4-D和殺蟲劑CHI 二聯膠體金檢測卡，由包被了 2，4_D單克隆抗體、CHI單克隆抗體的膠體金標記物的膠體金結合墊、包被了 2，4-D蛋白質偶聯物、CHI蛋白質偶聯物和兔抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC背襯及塑料模具等組成，在PVC背襯的一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。本發明的除草劑2，4-D和殺蟲劑CHI 二聯膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實現
(1)膠體金溶液制備取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL,繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用；
(2)抗體的預處理將要標記的2，4-D或CHI單克隆抗體在1000r/min, 4°C條件下，離心20 min,取上清,用O. 01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用O. 01 mol/L PBS將要標記的2，4-D或CHI單克隆抗體稀釋成I mg/mL,過O. 22 Mm濾膜；
(3)膠體金標記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3調節膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg 2，4_D或CHI單克隆抗體的蛋白溶液，反應10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，繼續攪拌反應10 min ；金標抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心20 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成2，4-D單克隆抗體或CHI單克隆抗體的膠體金標記物；
(4)膠體金膜的制備將步驟(3)2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體的膠體金標記物依次用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體的膠體金膜；
(5)包被膜制備將兔抗鼠Ig G抗體稀釋成Img/mL、2, 4-D抗原稀釋成O. 3 mg/mL和CHI抗原稀釋成O. 5 mg/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37 °C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
(6)樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測卡的組裝PVC背襯自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。所述步驟(3)中的金標抗體稀釋液由5 g小牛血清蛋白(BSA) ,10 g鹿糖,加100mL 0.01 mol/L PBS溶液溶解配制而成，過O. 22 濾膜，現配現用；金標抗體洗滌緩沖液是由 10 g 小牛血清蛋白(BSA)和 I g PEG-20000，用 0.01 mol/L PBS ρΗ7· 4 定容至 100 mL所得；
所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和0. 8 g氯化鈉(NaCl),用含有 0. 5%TRIT0N-100 的 0. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL ；
本發明可有效用于同時測定水樣中除草劑2，4-D和殺蟲劑CHI 二種環境激素污染物質，方法簡單，方便、快捷，結果準確。


圖1為本發明除草劑2，4-D-殺蟲劑CHI 二聯檢測卡的結構圖圖中1.加樣孔2.2，4-D檢測線3. CHI檢測線4.質控線5.檢測孔6.試紙條；
圖2為本發明除草劑2，4-D-殺蟲劑CHI 二聯檢測卡的試紙條的剖視結構圖，圖中7.檢測卡外殼8.樣品墊9.膠體金結合墊10. PVC背襯11.硝酸纖維素膜。
具體實施例方式實施例1
圖1為本發明除草劑2，4-D-殺蟲劑CHI 二聯檢測卡的結構圖、圖2為本發明除草劑2，4-D-殺蟲劑CHI 二聯檢測卡的試紙條的剖視結構圖，圖中10為PVC背襯；8為樣品墊；9為膠體金結合墊，該膠體金結合墊上包被了 2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體膠體金標記物；11為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了 2，4-D蛋白質偶聯物、CHI蛋白質偶聯物和兔抗鼠IgG。在PVC背襯10的一端上(樣品加樣端)粘附樣品墊8、膠體金結合墊9，樣品墊8搭接在膠體金結合墊9上。在PVC背襯10的中間粘附硝酸纖維素膜11。在硝酸纖維素膜11上設置有2，4_D蛋白質偶聯物檢測線2、CHI蛋白質偶聯物檢測線3和兔抗鼠IgG質控線4。在PVC背襯10的另一端粘附吸水墊12。硝酸纖維素膜11的一端與膠體金結合墊9略交叉，另一端與吸水墊12略交叉。該試紙條6可裝入有塑料模具制成的檢測卡外殼7中，在檢測卡外殼7的上蓋上設有加樣孔I和檢測孔5，樣品墊8正對加樣孔I，硝酸纖維素膜11正對檢測孔5。實施例2
除草劑2，4-D和殺蟲劑CHI 二聯膠體金檢測卡制備，是由以下步驟具體實現
(1)膠體金溶液制備取IL三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL,繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用；
(2)抗體的預處理將要標記的2，4-D或CHI單克隆抗體在1000r/min, 4°C條件下，離心20 min,取上清,用O. 01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用O. 01 mol/L PBS將要標記的2，4-D或CHI單克隆抗體稀釋成I mg/mL,過O. 22 Mm濾膜；
(3)膠體金標記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3調節膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg 2，4_D或CHI單克隆抗體的蛋白溶液，反應10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，繼續攪拌反應10 min ；金標抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心20 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成2，4-D單克隆抗體或CHI單克隆抗體的膠體金標記物；
(4)膠體金膜的制備將步驟(3)2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體的膠體金標記物依次用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體的膠體金膜；
(5)包被膜制備將兔抗鼠IgG抗體稀釋成Img/mL、2, 4-D抗原稀釋成O. 3 mg/mL和CHI抗原稀釋成O. 5 mg/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37 °C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
(6)樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測卡的組裝PVC背襯自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。實施例3 最低檢出限量試驗。分別配制標準的除草劑2，4-D和殺蟲劑CHI標準品溶液濃度是0、5 ng/mLUOng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL ;滴加2滴樣品到檢測卡加樣孔上,5 min后觀察檢測線T和質控線C的顯色結果。經多次檢驗，2，4-D和CHI的檢出率達99%以上，最低檢出限量少于15ng/mLο
權利要求
1.除草劑2，4-D和殺蟲劑CHIニ聯膠體金檢測卡，其特征在于按照下述步驟制備得到 膠體金溶液制備取I L三角燒瓶I個，加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4 3H20 5 mL，配制成500 mL 0. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉Na3C6H5O7 2H20溶液5_7 mL,繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存備用； 抗體的預處理將要標記的2，4-D或CHI單克隆抗體在1000 r/min, 4°C條件下,離心20 min，取上清，用0. 01 mo I/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用0. 01 mo I/L PBS將要標記的2，4-D或CHI單克隆抗體稀釋成I mg/mL，過0. 22 Mm濾膜； 膠體金標記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40 mL，用0. 25 mo I/L K2CO3調節膠體金溶液PH至8. 5，電磁攪拌器250 r/min攪拌，逐滴加入4 mL含0. 3 mg 2，4-D或CHI單克隆抗體的蛋白溶液，反應10 min ;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫1500 r/min離心20 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成2，4-D單克隆抗體或CHI單克隆抗體的膠體金標記物； 膠體金膜的制備將步驟(3) 2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體的膠體金標記物依次用劃膜儀以5 ML/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3h，制成含2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體的膠體金膜； 包被膜制備將兔抗鼠IgG抗體稀釋成I mg/mL、2，4-D抗原稀釋成0. 3 mg/mL和CHI抗原稀釋成0.5 mg/mL，用劃膜儀依次以I ML/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干； 樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干； 檢測卡的組裝PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
2.根據權利要求1所述的除草劑2，4-D和殺蟲劑CHIニ聯膠體金檢測卡，其特征在于所述步驟(3)中的金標抗體稀釋液由5 g小牛血清蛋白，10 g鹿糖,加100 mL 0. 01 mol/LPBS溶液溶解配制而成，過0.22 Mffl濾膜，現配現用；金標抗體洗滌緩沖液是由10 g小牛血清蛋白和 I g PEG-20000,M 0. 01 mol/L PBS pH7. 4 定容至 100 mL 所得； 所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白和0.8 g氯化鈉，用含有·0.5%TRIT0N-100 的 0. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
全文摘要
本發明除草劑2,4-D-殺蟲劑CHI二聯檢測卡及其制備方法，涉及環境激素檢測技術領域。本發明的檢測卡外殼中有試紙條，由PVC膠板、樣品墊、膠體金結合墊、包被膜和吸水墊組成；膠體金膜為含2,4-D單克隆抗體、CHI單克隆抗體膠體金標記物的玻璃纖維素膜，包被膜是硝酸纖維素膜，其上設有二條檢測線T線和一條質控線C線，檢測線T線依次包被有2,4-D蛋白質偶聯物、CHI蛋白質偶聯物，質控線C線包被有兔抗鼠IgG抗體。本發明可同時檢測出水樣中除草劑2,4-D和殺蟲劑CHI，方法簡單、方便、快捷，結果準確。
文檔編號G01N33/577GK103048455SQ20121036676
公開日2013年4月17日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者杜道林, 洪霞, 張禎, 薛永來 申請人:江蘇維賽科技生物發展有限公司