專利名稱：一種基于量子點—多肽復合物的熒光毛細管電泳檢測酶活性的方法
技術領域：
本發明涉及生物分析和納米技術領域，特別涉及一種基于量子點一多肽復合物的熒光毛細管電泳檢測酶活性的方法。
背景技術：
蛋白水解酶(protease, proteinase)是催化多肽或蛋白質水解的酶的統稱,簡稱蛋白酶。廣泛分部于動物、植物以及細菌當中，種類繁多，在動物的消化道以及體內各種細胞的溶酶體內含量尤為豐富。蛋白酶對機體的新陳代謝以及生物調控起重要作用。近年來，實驗室直接或間接檢測酶的方法有較大的發展，特別是直接檢測酶活性更是實驗醫學的研究熱點。血漿酶濃度的檢測對臨床疾病的診斷，病程發展、預后以及療效 的監測和評估等都具有較重要的意義。酶的直接檢測方法主要有發色底物法和熒光適配體法等。但發色底物法成本高、熒光適配體法底物易水解、操作復雜，故適用范圍有限。最近，Medintz提出了一種基于量子點的熒光光譜法，可實現凝血酶活性的檢測，為酶活性的檢測提供了一種新的思路(Medintz I. L. , Clapp A. R. , Brunei F. M. , et al. Nat. Mater. 2006, 5, 581 - 588)。毛細管電泳(CE)具有高效、高速、微量、低消耗、操作模式多，分離方法開發容易等優點，由于具備如此多的優點以及分離生物大分子的能力，CE成為近年來發展最迅速的分離分析方法之一。尤其是將熒光檢測與毛細管電泳相結合，大大提高了檢測限，拓展了毛細管電泳的應用。本試驗建立的酶活性分析檢測方法，克服了已有方法存在的缺陷，可滿足大批量檢測需要，適用范圍較廣，有較高的精確性及較好的穩定性。

發明內容
本發明要解決的技術問題是為了克服現有技術對酶活性檢測的不足，本發明提供一種基于量子點一多肽復合物的熒光毛細管電泳檢測酶活性的方法。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是一種基于量子點一多肽復合物的熒光毛細管電泳檢測酶活性的方法，首先制備一種量子點一多肽復合物，多肽用熒光標記，量子點與熒光分子之間可以產生熒光共振能量轉移(FRET)。將量子點與多肽混合后，分別加入不同濃度的酶；然后進行毛細管電泳檢測，同時檢測量子點和熒光分子標記的多肽通道的熒光強度，將量子點和熒光分子標記的多肽熒光強度的變化換算成酶每分鐘切割的多肽濃度作為Y軸，以酶濃度為X軸，曲線擬合得到酶活性檢測的參數；其中多肽為含有待測酶識別位點的多肽，其中C端為組氨酸標簽序列或半胱氨酸，N端是帶負電的氨基酸并用染料分子標記。本發明方法中所述的毛細管電泳檢測中，電泳緩沖液優選為25 mM硼酸緩沖液，PH9. 3。所述硼酸緩沖液經O. 22 μ m濾膜過濾。本發明中所述的染料分子為量子點、TAMRA、羅丹明、Texas Red、Cy3或Cy5，且滿足標記生物分子的染料分子與量子點之間可以發生熒光共振能量轉移。本發明方法可用于檢測各種水解酶活性，根據不同的酶，多肽為含有相應酶識別位點的多肽。例如檢測凝血酶時，所述的多肽為含有凝血酶切序列LVPRGS的多肽。將酶與量子點一多肽復合物混合后，可根據FRET信號的變化檢測酶活性。實驗證明，該方法操作簡單，檢測靈敏度高，所需時間短。該方法是對傳統酶活性檢測技術進行改進，結合多波長熒光檢測靈敏度高等優點，建立的一種新的高靈敏酶活性檢測技術。本發明的有益效果是，本發明提供一種基于量子點一多肽復合物的熒光毛細管電泳檢測酶活性的方法，操作容易，檢測靈敏度高，可實現酶活性檢測；熒光光譜儀可同時檢測多個熒光波長，從而減少了誤差，提高了檢測的準確性。


下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
圖I是本發明所用的量子點一多肽復合物發生熒光共振能量轉移示意圖。圖2是用量子點一多肽復合物QD H6-Cy5檢測凝血酶酶活性的毛細管電泳圖。不同濃度的凝血酶(a, O μΜ; b, O. 034 MM; c, O. 068 MM; d, 0. 135 μΜ; e, 0. 27 MM; f,0.54 μΜ; g, 1.35 μΜ)與QD H6_Cy5在37 °C混合10分鐘后用毛細管電泳熒光檢測，檢測波長分別為612 nm (檢測量子點)和661 nm (檢測Cy5)。H6-Cy5:QD=32, [QD]=0. 5 μΜ.
圖3是凝血酶酶活性檢測的動力學曲線。
具體實施例方式現在結合附圖對本發明作進一步詳細的說明。本發明一種基于量子點一多肽復合物的熒光毛細管電泳檢測酶活性的方法的操作流程如下
I.首先制備一種量子點一多肽復合物，多肽用熒光標記，量子點與熒光分子之間可以產生FRET。將量子點與多肽混合后，分別加入不同濃度的酶。2電泳緩沖液本方法中所用的電泳緩沖液為25mM硼酸緩沖液(pH9. 3)。3毛細管本方法中所用的毛細管為未涂層毛細管(內徑75 μ m,長度60 cm,有效長度35 cm)ο4電泳檢測進樣電壓12 KV，進樣10 S，然后停止加壓。分離電壓18 KV，分離10 min,同時檢測供體(量子點)和受體(熒光分子標記的多肽)通道的熒光強度，收集、分析得到相應的檢測結果。5將供體和受體熒光強度的變化換算成酶每分鐘切割的多肽濃度作為Y軸，以酶濃度為X軸，曲線擬合得到酶活性檢測的參數。實施例I凝血酶活性檢測 實例中使用的儀器及操作條件如下
所用毛細管電泳為基于熒光顯微鏡自搭毛細管電泳系統，高壓電源為上海核物理研究所生產；熒光光譜儀為海洋光學QE65000 ;自制顯微鏡接口，將顯微鏡標準口的熒光通過光纖導入光譜儀。采用電壓進樣，進樣電壓12 KV，進樣時間為10 S，電泳電壓為18 KV，電泳10 min。
圖I為檢測凝血酶活性過程中，量子點一多肽復合物發生熒光共振能量轉移示意圖。圖2為用量子點一多肽復合物QD H6_Cy5檢測凝血酶酶活性的毛細管電泳圖。設置光譜儀的檢測波長分別為612 nm (檢測QDs)和661nm (檢測Cy5)。實驗結果表明，凝血酶的濃度增加，FRET信號逐漸減弱，因此該方法可以用來檢測酶活性。并且可根據不同凝血酶濃度的熒光強度變化進行曲線擬合，計算酶活性的參數(圖3)。
權利要求
1.一種基于量子點一多肽復合物的熒光毛細管電泳檢測酶活性的方法，其特征在于首先制備量子點一多肽復合物，多肽用熒光標記，量子點與熒光分子之間可以產生熒光共振能量轉移；將量子點與多肽混合后，分別加入不同濃度的酶；然后進行毛細管電泳檢測，同時檢測量子點和熒光分子標記的多肽通道的熒光強度，將量子點和熒光分子標記的多肽熒光強度的變化換算成酶每分鐘切割的多肽濃度作為Y軸，以酶濃度為X軸，曲線擬合得到酶活性檢測的參數；其中多肽為含有待測酶識別位點的多肽，其中C端為組氨酸標簽序列或半胱氨酸，N端是帶負電的氨基酸并用染料分子標記。
2.如權利要求I所述的基于量子點一多肽復合物的熒光毛細管電泳檢測酶活性的方法，其特征在于所述的毛細管電泳檢測中，電泳緩沖液為25mM硼酸緩沖液，pH9. 3。
3.如權利要求2所述的基于量子點一多肽復合物的熒光毛細管電泳檢測酶活性的方法，其特征在于所述硼酸緩沖液經O. 22 μ m濾膜過濾。
4.如權利要求I所述的基于量子點一多肽復合物的熒光毛細管電泳檢測酶活性的方法，其特征在于所述的酶為凝血酶；所述的多肽為含有凝血酶切序列LVPRGS的多肽，其中C端為組氨酸標簽序列或半胱氨酸，N端是帶負電的氨基酸并用染料分子標記。
5.如權利要求I所述的基于量子點一多肽復合物的熒光毛細管電泳檢測酶活性的方法，其特征在于所述染料分子為量子點、TAMRA、羅丹明、Texas Red、Cy3或Cy5，且滿足標記生物分子的染料分子與量子點之間可以發生突光共振能量轉移。
全文摘要
本發明涉及一種基于量子點—多肽復合物的熒光毛細管電泳檢測酶活性的方法，屬于生物分析、納米技術領域。首先制備一種量子點—多肽復合物，多肽用熒光標記，量子點與熒光分子之間可以產生熒光共振能量轉移(FRET)。將酶與量子點—多肽復合物混合后，可根據FRET信號的變化檢測酶活性。實驗證明，該方法操作簡單，檢測靈敏度高，所需時間短。該方法是對傳統酶活性檢測技術進行改進，結合多波長熒光檢測靈敏度高等優點，建立的一種新的高靈敏酶活性檢測技術。
文檔編號G01N21/64GK102879454SQ201210367070
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者王建浩, 邱琳, 蔣鵬舉, 王車禮 申請人:常州大學