熱休克蛋白47膠質(zhì)瘤相關(guān)腫瘤抗原及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及熱休克蛋白47膠質(zhì)瘤相關(guān)腫瘤抗原，具體涉及熱休克蛋白47作為與預(yù)后相關(guān)的惡性膠質(zhì)瘤特異性腫瘤抗原以及所述抗原的兩個(gè)CTL表位及其九肽氨基酸序列，和所述CTL表位誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)用于臨床預(yù)后判定，及其在制備惡性膠質(zhì)瘤免疫治療疫苗中的用途。本發(fā)明通過(guò)qPCR和蛋白免疫印跡的方法，證實(shí)熱休克蛋白47在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤上高表達(dá)；同時(shí)驗(yàn)證了CTL表位與臨床預(yù)后的相關(guān)性，本發(fā)明的熱休克蛋白47膠質(zhì)瘤相關(guān)腫瘤抗原可進(jìn)一步制備包含該抗原的組合物和化合物及制備免疫治療的制劑，用于判定惡性膠質(zhì)瘤預(yù)后和免疫治療。
【專(zhuān)利說(shuō)明】熱休克蛋白47膠質(zhì)瘤相關(guān)腫瘤抗原及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及熱休克蛋白47膠質(zhì)瘤相關(guān)腫瘤抗原，更具體地， 涉及熱休克蛋白47作為與預(yù)后相關(guān)的惡性膠質(zhì)瘤特異性腫瘤抗原以及所述抗原的兩個(gè) CTL表位及其九肽氨基酸序列，及其所述CTL表位誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)用以臨床預(yù)后判定，及其 在制備惡性膠質(zhì)瘤免疫治療疫苗中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了膠質(zhì)瘤（glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，其中惡性膠質(zhì) 瘤（WHO III、IV級(jí)）治愈率低，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后極差，尤其是對(duì)于IV級(jí)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (glioblastoma，GBM)患者。臨床實(shí)踐顯示，由于大多數(shù)膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與正常組織無(wú) 明顯分界，所以單靠手術(shù)無(wú)法根治。目前，對(duì)于GBM推薦標(biāo)準(zhǔn)治療方案，即手術(shù)后同步放化 療加6個(gè)療程的替莫唑胺（TMZ)化療，其平均生存期僅為12-15個(gè)月。因此，對(duì)于惡性膠質(zhì) 瘤，尋找更有效的治療方法是目前臨床急需解決的難題。目前免疫治療，尤其是利用自身T 細(xì)胞殺傷顯微手術(shù)后殘留的腫瘤細(xì)胞，得到了業(yè)內(nèi)極大的關(guān)注。
[0003] 熱休克蛋白（heat shock protein, HSP)是進(jìn)化上高度保守的蛋白，其功能涉及細(xì) 胞生物學(xué)的各個(gè)方面。HSP目前分成如下六類(lèi)：HsplOO, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40和小分 子HSP。就免疫的角度而言，HSP本身可以作為抗原，或者作為抗原呈遞的輔佐分子。研究 顯示，HSP可以綁定抗原肽從而呈遞給抗原呈遞細(xì)胞（antigen presentation cell, APC)。 癌癥細(xì)胞上的HSP肽復(fù)合物能夠激發(fā)自身的適應(yīng)性和固有免疫系統(tǒng)。國(guó)際專(zhuān)利公布號(hào) W02009/117116EN熱休克蛋白GP96的疫苗接種及其使用方法中，公開(kāi)了被基因修飾以 表達(dá)編碼分泌形式的熱休克蛋白（hsp) gp96多肽的核酸的腫瘤細(xì)胞。該HSP-96肽疫苗已經(jīng) 安全地用于GBM患者的臨床治療（Crane CA, etal. Clin Cancer Res, 2013; 19:205-214.)。
[0004] HSP47,亦稱(chēng)SERPINH1或者colligin2,作為膠原特定的分子伴侶，其參與各種膠 原前蛋白成熟的各個(gè)過(guò)程。對(duì)于膠質(zhì)瘤而言，目前有關(guān)HSP47的文獻(xiàn)報(bào)道中，涉及HSP47在 膠質(zhì)瘤血管上的表達(dá)（Mustafa D，et al.fcain Pathol, 2010;20:50-65. );HSP47 參與了膠 質(zhì)瘤新生血管的發(fā)生發(fā)展（Mustafa DA, et al.Molecular&cellular proteomics:MCP, 200 7;6:1147-1157.)。迄今，尚未見(jiàn)HSP47作為惡性膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原或者其他腫瘤的相關(guān)抗原 的報(bào)道。
[0005] 表位是抗原分子中可與CTUTh和B細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫和體 液免疫，進(jìn)而產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的一段氨基酸序列。有研究提出，通過(guò)篩選富含多個(gè)CTL、 Th和B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位的氨基酸序列為抗原，可達(dá)到既能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答又可減少免疫病理反 應(yīng)的目的；能夠有效增強(qiáng)表位提呈的效率，解決表位疫苗的免疫原性弱目的。膠質(zhì)瘤相關(guān)抗 原的T細(xì)胞表位能誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)從而殺傷腫瘤細(xì)胞，在已報(bào)道的膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原中，涉及 1'細(xì)胞表位的有下列基因 ：3六町-1，5六1?1'-3，11-13代(3印如四2(*3111，1^41，6六1^3，頂-2，￡ phA2, EGFRvIII, HER-2, gplOO, MAGE-1, gBK, TRP-2, Sox2, Soxll, Sox6, HSD3B7 等。其相應(yīng)的 T細(xì)胞表位如表1所示。
[0006] 表1膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原的表位肽
[0007] Author Year Gene name HLA classification Amino Acid position Sequence
[0008]

【權(quán)利要求】
1. 熱休克蛋白47 (HSP47)在制備判定惡性膠質(zhì)瘤預(yù)后與免疫治療的制劑中的用途。
2. 按權(quán)利要求1所述的用途，其中用于惡性膠質(zhì)瘤預(yù)后判定的是檢測(cè)HSP47特異性T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，T細(xì)胞免疫應(yīng)答陽(yáng)性者預(yù)后好、陰性者預(yù)后差。
3. 按權(quán)利要求2所述的用途，其中檢測(cè)T細(xì)胞免疫應(yīng)答為針對(duì)HSP47的部分序列，包括 但不限于： (a) HSP47 上第 184-192 位氨基酸序列 KLPEVTKDV ; (b) HSP47上第3-11位氨基酸序列LLLLSAFCL。
4. 按權(quán)利要求2或3所述的用途，其中用于檢測(cè)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法為基于 IFN-ga_a的ELISPOT法、基于流式技術(shù)的IFN-ga_a細(xì)胞內(nèi)染色法、Tetramer流式檢測(cè)法 以及其他T細(xì)胞免疫應(yīng)答的定量方法；按所述的每種方法的特定要求判定T細(xì)胞免疫應(yīng)答 的陽(yáng)性與陰性。
5. 按權(quán)利要求1的用途，其中所述的免疫治療的制劑是免疫治療惡性膠質(zhì)瘤的治療性 疫苗。
6. 按權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的治療性疫苗為DNA、病毒載體、細(xì)菌載體或蛋 白亞單位疫苗。
7. 按權(quán)利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述的治療性疫苗包括但不限于下述序 列： (a) HSP47 上第 184-192 位氨基酸序列 KLPEVTKDV ; (b) HSP47上第3-11位氨基酸序列LLLLSAFCL。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104374918SQ201310362324
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月17日
【發(fā)明者】吳哲褒, 徐建青, 周良輔, 仇超, 蔡霖, 林紹堅(jiān) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)