兩種scFv抗體、其編碼基因及其在制備治療或預防雞傳染性法氏囊病制劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公布了兩種scFv抗體、其編碼基因及其在制備治療或預防雞傳染性法氏囊病制劑中的應用。發明提供了兩種單鏈抗體（即scFv抗體），scFv抗體具有與IBDV結構蛋白2（VP2）蛋白及多種IBDV毒株特異性結合的能力，可阻斷IBDV對雞胚成纖維細胞產生細胞病變（CPE），可保護IBDV感染的青年雞。免疫血清和卵黃抗體在使用過程中存在制備繁瑣、生產成本高、效果不穩定以，工業化生產質量難以控制及引發水平傳播疾病等弊端。本發明提供的scFv抗體可以克服上述弊端，具有特異性強、治療效果好，工業化生產質量可控，避免了卵黃抗體引起的水平傳播疾病等優點，將在IBDV的防制史上，乃至整個動物病毒病的防治史上開辟了一個新的局面。
【專利說明】兩種scFv抗體、其編碼基因及其在制備治療或預防雞傳染性法氏囊病制劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及兩種SCFv抗體、其編碼基因及其在制備治療或預防雞傳染性法氏囊病制劑中的應用。
【背景技術】
[0002]雞傳染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease, IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一種急性、高度接觸性雞傳染病,具有傳播速度快、傳染性強、感染率及死亡率均高的特點。該病給養禽業造成重大經濟損失。
[0003]IBDV可在雛雞法氏囊中的淋巴細胞，尤其是B淋巴細胞中迅速繁殖，促使B淋巴細胞凋亡，法氏囊極度萎縮，最終導致免疫缺陷和免疫抑制。因此極易造成細菌(大腸桿菌和沙門氏菌）的繼發感染，同時可還造成其他疫苗的免疫失敗。多克隆抗體(高免血清和卵黃抗體）是目前有效的治療手段，在發病早期治療效果良好，但是由于工業化生產可控性差和存在水平傳播疾病(雞白痢、霉形體、減蛋綜合癥和禽白血病）以及由一些非特異性抗體引起的過敏性反應等原因而受到限制。
[0004]基因工程抗體即將抗體的基因按不同需要進行加工、改造和重新裝配，然后導入適當的受體細胞中進行表達的抗體分子。在原核細胞中表達基因工程抗體目前技術已經相對成熟，可實現工業化的生產，產品質量可控均一。同時原核表達系統不存在水平傳播傳染性疾病的危險。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供兩種單鏈抗體（scFv抗體)、其編碼基因及其在制備治療或預防雞傳染性法氏囊病制劑中的應用。
[0006]本發明提供了兩種單鏈抗體，命名為IBDV-VP2 scFv29抗體和IBDV-VP2 scFv30抗體，包括由重鏈可變區、輕鏈可變區以及它們之間的連接區組成；
所述IBDV-VP2 scFv29抗體的重鏈可變區為如下（a)或（b): (a)由序列表中序列I自N末端第1-129位氨基酸殘基組成的蛋白質；（b)將（a)經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質；
所述IBDV-VP2 scFv29抗體輕鏈可變區為如下（c)或（d) :(c)由序列表中序列I自N末端第145-250位氨基酸殘基組成的蛋白質；（d)將（c)經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質。
[0007]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv29具體可為如下（e)或（f) : (e)由序列表中序列I所示的蛋白質；（f)將（e)經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質。
[0008]編碼所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv29的基因也屬于本發明的保護范圍。
[0009]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv29基因中，編碼所述重鏈可變區的DNA分子為如下(I)或（2)或（3) :(1)序列表的序列2自5’末端第1-387位核苷酸所示的DNA分子；（2)在嚴格條件下與（I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3)與(O限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0010]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv29基因中，編碼所述輕鏈可變區的DNA分子為如下
(4)或（5)或（6): (4)序列表的序列2自5’末端第433-753位核苷酸所示的DNA分子；（5)在嚴格條件下與（4)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)與
(4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0011]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv29基因具體可為如下（7)或（8)或（9)或（10): (7)序列表的序列2自5’末端第1-753位核苷酸所示的DNA分子；（8)序列表的序列2所示的DNA分子；（9)在嚴格條件下與（7)或（8)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10)與（7)或（8)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0012]所述IBDV-VP2 scFv30抗體的重鏈可變區為如下（a’）或（b’）：（a’）由序列表中序列3自N末端第1-135位氨基酸殘基組成的蛋白質；（b’）將（a’）經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質；
所述IBDV-VP2 scFv30抗體輕鏈可變區為如下（c’）或（d’）：（c’）由序列表中序列3自N末端第151-255位氨基酸殘基組成的蛋白質；（d’）將（c’）經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質。
[0013]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv30具體可為如下（e’）或（f ’）：（e’）由序列表中序列3所示的蛋白質；（f ’）將（e’）經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質。
[0014]編碼所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv30的基因也屬于本發明的保護范圍。
[0015]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv30基因中，編碼所述重鏈可變區的DNA分子為如下(I’）或（2’）或（3’）：（ I’）序列表的序列4自5’末端第1-405位核苷酸所示的DNA分子；(2’）在嚴格條件下與（1' )限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3’）與（1')限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0016]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv30基因中，編碼所述輕鏈可變區的DNA分子為如下(4’ )或（5’ )或（6’ ) ： (4’ )序列表的序列4自5’末端第451-768位核苷酸所不的DNA分子；（5’）在嚴格條件下與（4’ )限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6’）與（4’）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0017]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv30基因具體可為如下（7，）或（8，）或（9，）或（10’）：(7’）序列表的序列4自5’末端第1-768位核苷酸所示的DNA分子；（8’）序列表的序列2所示的DNA分子；（9’）在嚴格條件下與（7’）或（8’）限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10’）與（7’）或（8’）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0018]上述嚴格條件可為在6 X SSC，O. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC、
O.1% SDS 和 I X SSC,O. 1% SDS 各洗膜一次。[0019]含有以上任一所述基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。
[0020]基于所述兩種單鏈抗體的其它形式的抗體也屬于本發明的保護范圍。所述其它形式的抗體可為Fab形式的抗體、IgG形式的抗體等。
[0021]本發明還保護所述單鏈抗體或所述其它形式的抗體在制備產品中的應用；所述產品的功能為如下（I )、（II)或(III)或(IV) :( I )檢測雞傳染性法氏囊病病毒；（II)輔助鑒定雞傳染性法氏囊病病毒；（III)預防和/或治療雞傳染性法氏囊病；（IV)預防和/或治療由雞傳染性法氏囊病病毒誘發的其它疾病。
[0022]含有所述單鏈抗體或所述其它形式的抗體的產品也屬于本發明的保護范圍；所述產品的功能為如下（I )、（II)或(III)或(IV) :( I )檢測傳染性法氏囊病病毒；（II)輔助鑒定傳染性法氏囊病病毒；（III)預防和/或治療傳染性法氏囊病病毒引起的疾病；（IV)預防和/或治療傳染性法氏囊病。
[0023]本發明還保護所述單鏈抗體或所述其它形式的抗體在輔助鑒定傳染性法氏囊病病毒中的應用。所述應用為非疾病診斷方法。
[0024]本發明提供了兩種單鏈抗體（即scFv抗體)，scFv抗體具有與IBDV結構蛋白2(VP2)蛋白及多種IBDV毒株特異性結合的能力，可阻斷IBDV對雞胚成纖維細胞產生細胞病變（CPE)，可保護IBDV感染的青年雞。免疫血清和卵黃抗體在使用過程中存在制備繁瑣、生產成本高、效果不穩定以，工業化生產質量難以控制及引發水平傳播疾病等弊端。本發明提供的scFv抗體可以克服上述弊端，具有特異性強、治療效果好，工業化生產質量可控，避免了卵黃抗體引起的水平傳播疾病等優點，將在IBDV的防制史上，乃至整個動物病毒病的防治史上開辟了一個新的局面。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖I 為 IBDV-VP2 scFv29 和 IBDV-VP2 scFv30 抗體溶液的 SDS-PAGE 圖譜。
[0026]圖2為兩種scFv抗體溶液的SEC-HPLC圖譜。
[0027]圖3為ELISA檢測兩種scFv抗體對VP2蛋白的特異性和親和力的結果。
[0028]圖4為ELISA檢測兩種scFv抗體對不同IBDV病毒的特異性和親和力結果。
【具體實施方式】
[0029]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0030]pET_27b (+)載體：購自 Novagen 公司，Cat. No. 69337-3。大腸桿菌 Rosetta :購自Novagen公司，Cat. No. 71403-4。DFl細胞(雞成纖維細胞）：購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，Cat. No. 3131C0001000400030。SPF雛雞：購自哈爾濱獸醫研究所。雞新城疫滅活疫苗（La Sota株)，購買自哈獸研維科生物公司，編號080012008。
[0031]雞傳染性法氏囊病活疫苗（Gt株):哈獸研維科生物公司，編號080012122。雞傳染性法氏囊病中等毒力活疫苗（NF8株）：揚州威克生物工程有限公司，編號101042056。雞傳染性法氏囊病活疫苗（1-65株):Shafit InterGumboro，編號S20651010A。雞傳染性法氏囊病活疫苗（BJ836株）：上海海利生物藥品有限公司，編號090202026。雞傳染性法氏囊病活疫苗（MB株）：ABIC，編號20621150B。雞傳染性法氏囊病活疫苗（B87株）：湖南省中岸生物藥業有限公司，編號180022026。
[0032]質粒pHisSUMO:參考文獻：姜媛媛，尹成凱，李晉南，任桂萍，張薇，李德山.利用SUMO融合系統高效表達可溶性重組蛋白的研究.東北農業大學學報，2008，39(10) : 57-62;李璐，尹成凱，李德山.高效表達可溶性重組蛋白表達載體——pHisSUMO.生物技術，2009，19(3) : 11-14·。
[0033]包被液（pH9.6) -M Na2CO3 O. 15g、NaHCO3 O. 293g，溶于水并用水定容至 100mL。
[0034]PBS 緩沖液：取 NaCl 8g、KCl 0. 2g、Na2HPO4. 12H20 3. 58g、KH2PO4 0. 24g，溶于 IL水。
[0035]實施例I :SCFv抗體(單鏈抗體）及其編碼基因的發現
1、抗體庫的構建
取IBDV免疫后的雞脾臟，提取RNA后反轉錄成cDNA。根據GenBank上的抗體序列，設計出克隆抗體可變區的基因引物，以cDNA為模板，使用PCR的方法克隆抗體可變區。將VH與VL片段分別插入到pTlinker載體的Linker的上游和下游,構建出scFv抗體庫。將scFv抗體庫進行酶切并與細菌展示載體PBSD進行連接，構建抗IBDV抗體的細菌表面展示文庫。VH 約 380bp、VL 約 320bp, VH-Tlinker-VL 約 740bp ；
2、抗體庫的篩選
收集轉化后全部克隆，經IPTG (0. 25mmol/ml)誘導4h，經EDTA-MgCl2處理，與FITC標記的VP2蛋白孵育lh，PBS洗滌后利用流式細胞儀對其進行篩選；
經三輪篩選后，得到兩個與FITC標記的VP2蛋白具有結合能力的單鏈抗體，將其命名為 IBDV-VP2 scFv29 抗體和 IBDV-VP2 scFv30 抗體；
IBDV-VP2 scFv29抗體（為單鏈抗體，又稱scFv蛋白）如序列表的序列I所示，其編碼基因如序列表的序列2所不；
IBDV-VP2 scFv30抗體(為單鏈抗體，又稱scFv蛋白）如序列表的序列3所示，其編碼基因如序列表的序列4所不。
[0036]實施例2、scFv抗體的制備
1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子；
2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用Fl和Rl組成的引物以流式篩選陽性菌所提取質粒為模板進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；
Fl :5’ - CATGCCATGGGCCGTGACGTTGGACGAG-3’ ；
Rl : 5，- CCCAAGCTTTTAACCTAGGACGGTCAGGG-3 ；
3、用限制性內切酶AfcoI和Λ?/^ΙΙΙ雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物；
4、用限制性內切酶AfcoI和歷/^111雙酶切pET-27b(+)載體，回收約5367bp的載體骨
架；
5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒。根據測序結果，對重組質粒進行結構描述如下：在pET-27b(+)載體的AfcoI和Λ?/^ΙΙΙ酶切位點之間插入了序列表的序列2所不的雙鏈DNA分子；6、將步驟5得到的重組質粒導入大腸桿菌Rosetta，得到重組菌；
7、將步驟6得到的重組菌接種至含50μ g/ml卡那霉素的LB液體培養基，37°C、IOOr/min振蕩培養至OD6tltlnm=O. 35 ;加入IPTG并使其濃度為O. 25mmol/L, 37°C U00r/min振蕩培養4h ；
8、取25L完成步驟7的培養體系，4°C、4000r/min離心30min并收集菌體沉淀；
9、取步驟8得到的菌體沉淀，用PBS緩沖液重懸，加入溶菌酶溶液(購自Amresco)并使溶菌酶的濃度為lmg/ml，4°C放置lh，然后進行超聲破碎（25瓦的功率，3min)，4°C、1000Og離心30min,收集沉淀；
10、使用AKTAPurifier 100蛋白層析系統（購自GE公司）純化目的蛋白
取步驟9得到的沉淀，用100毫升溶解緩沖液（8mol/L尿素水溶液，pH8. O)充分溶解，然后上樣于HiLoad 16/60 Superdex75 pg柱子（購自GE公司），然后用500毫升復性緩沖液（2mol/L尿素水溶液，pH8. O)洗脫并收集過柱后的洗脫液，然后在PBS緩沖液中透析過夜，得到溶液即為scFv抗體溶液。所有步驟均在4°C環境下。scFv抗體溶液的SDS-PAGE圖譜見圖1，顯示約為28KD的條帶，與預期相符；
11、取步驟10得到的scFv抗體溶液，進行SEC-HPLC分析
硅膠填充物，型號為G-3000sWXl ;將scFv抗體溶液上樣后，用流速為O. 5ml/min的洗脫液（PH8. 0，溶劑為水，含50mM Na3POjP 150mM NaCl)進行洗脫。SEC-HPLC圖譜見圖2，目的蛋白的純度可達90%。
[0037]實施例3、VP2蛋白的制備 一、重組質粒的構建`
1、合成序列表的序列6所示的IBDVvp2雙鏈DNA分子；
2、以步驟合成的雙鏈DNA分子為模板，用F2和R2組成的引物對vp2進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；
F2 :5， -GAAGACTTAGGT ACAAACCTGCAAGATCAA-3，；
R2 :5’ -GGATCCTTATGCTCCTGCAATCTTCAG-3，；
3、用限制性內切酶助I取BamHl雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物；
4、用限制性內切酶助SI取BamHl雙酶切質粒pHisSUMO，回收約5700bp的載體骨架；
5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒。重組質粒中，VP2蛋白的編碼基因和載體骨架上的分子伴侶SUMO的編碼序列、以及載體骨架上的His標簽的編碼序列(位于SUMO的編碼序列的上游，由6個組氨酸殘基組成)融合，形成融合基因，表達融合蛋白（融合蛋白自N端至C端依次為His標簽、分子伴侶SUMO和VP2蛋白）。
[0038]二、VP2蛋白的制備和純化
1、將步驟一得到的重組質粒導入大腸桿菌Rosetta，得到重組菌；
2、將步驟I得到的重組菌接種至含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基，37°C、100r/min 振蕩培養至 OD6citlnm=O. 35 ;加入 IPTG 并使其濃度為 0. 4mmol/L, 25°C、65r/min 振蕩培養IOh ；
3、取完成步驟2的培養體系，4°C、4000r/min離心30min，并收集菌體沉淀；
4、取步驟3得到的菌體沉淀,用Bindingbuffer重懸,加入溶菌酶溶液(購自Amresco)并使溶菌酶的濃度為lmg/ml，4°C放置lh，然后進行超聲破碎（25瓦的功率，3min)，4°C、1000Og離心30min,收集上清液；
5、取步驟4得到的上清液,進行HisTrapTMFF crude colum親和層析；
柱子型號為：柱長O. 7cm,柱高2. 5cm ；
上樣量為IOml ；
洗脫過程：先用5倍柱體積的雜蛋白洗脫液(溶劑為水，含有如下濃度的各個溶質：40mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl 和 SOmmoI/T, Na3PO4 ；pH7. 4)洗脫以去除雜蛋白，流速為lml/min ;然后用3倍柱體積的目的蛋白洗脫液(溶劑為水,含有如下濃度的各個溶質：500mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl 和 SOmmoI /T, Na3PO4 ；pH7. 4)洗脫,流速為 lml/min, 280nm波長監測，收集目標峰(即峰值高于SOmAU的峰)，即為融合蛋白溶液；
6、采用HiPr印TM26/10 Desalting將步驟5得到的融合蛋白溶液進行脫鹽；
7、取步驟6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I(SUMO蛋白酶I與融合蛋白的摩爾比為1:50 )和終濃度為2mmol/L的DTT 4°C切割過夜；
8、取步驟7得到的溶液,進行HisTrapTMFF crude colum親和層析。
[0039]柱子型號為：柱長O. 7cm,柱高2. 5cm ；
上樣量為15ml，280nm波長監測，收集目標峰（即峰值高于30mAU的峰)，即為VP2蛋白溶液。將VP2蛋白溶液進行聚丙烯凝膠電泳，顯示分子量約為42KDa的單一蛋白條帶，回收蛋白條帶并測序，N端前15個氨基酸殘基如序列表的序列5自N末端第I至15位氨基酸殘基所示。
[0040]實施例4、ELISA檢測scFv抗體的親和力和特異性
一、ELISA檢測IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗體對VP2蛋白的特異性和親和力；
1、分別用蛋白濃度為300μg/ml>60 μ g/ml>12 μ g/ml、2. 4 μ g/ml的scFv抗體溶液(即實施例2制備的scFv抗體溶液，用包被液調整蛋白濃度)包被酶標板，4°C過夜，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
2、每孔加入100μ I蛋白濃度為40 μ g/ml的VP2蛋白溶液（即實施例3制備的VP2蛋白溶液，用PBS緩沖液調整蛋白濃度)，37°C孵育lh，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
3、加入卵黃抗體（B87株免疫蛋雞得到的，工作濃度為1:200倍稀釋)，371：孵育lh，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
4、加入HRP標記的兔抗雞抗體（Cat.No. 11-7018購自eBioscience公司，工作濃度為1:7500倍稀釋)，37°C孵育lh，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
5、加入TMB底物顯色液，37°C避光顯色5min；
6、每孔加入50μ 12mol/L的H2SO4水溶液，用酶標儀于波長450nm下檢測OD值；
設置用等體積的PBS緩沖液代替步驟I中的scFv抗體溶液、步驟2中的VP2蛋白溶液和步驟3中的卵黃抗體的PBS組。步驟I中用蛋白濃度為300 μ g/ml的scFv抗體溶液包被酶標板時：設置步驟2中不加入VP2蛋白溶液的對照組1，步驟3中不加入卵黃抗體的對照組2，步驟2中不加入VP2蛋白溶液且步驟3中不加入卵黃抗體的對照組3，用等體積且等蛋白濃度的BSA溶液代替VP2蛋白溶液的對照組4 ；
每個處理設置3個復孔；
結果見圖3。ELISA結果表明，IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗體可以與VP2蛋白特異性結合。
[0041]二、ELISA 檢測 sIBDV-VP2 scFv29 和 IBDV-VP2 scFv30 抗體對不同 IBDV 病毒的特異性和親和力
，1、用蛋白濃度為300μ g/ml的scFv抗體溶液(即實施例2制備的scFv抗體溶液，用包被液調整蛋白濃度）包被酶標板，4°C過夜，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
，2、每孔加入100 μ I IBDV 病毒液(病毒滴度為 IOOTCId50, TCID50=IO^ 8/0. lml)，37。。孵育lh，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
，3、加入卵黃抗體（B87株免疫蛋雞得到的，工作濃度為1:200倍稀釋)，371：孵育lh，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
4、加入HRP標記的兔抗雞抗體（Cat.No. 11-7018購自eBioscience公司，工作濃度為1:7500倍稀釋)，37°C孵育lh，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
5、加入TMB底物顯色液，37°C避光顯色5min；
6、每孔加入50μ I 2mol/L的H2SO4水溶液，用酶標儀于波長450nm下檢測OD值； 分別采用如下IBDV的毒株進行上述實驗：Gt株、NF8株、1_65株、BJ836株、MB株、B87
株;
設置用等體積的PBS緩沖液代替步驟I中的scFv抗體溶液、步驟2中的IBDV病毒液和步驟3中的卵黃抗體的PBS組。設置步驟2中不加入IBDV病毒液的對照組1，步驟3中不加入卵黃抗體的對照組2，步驟2中 不加入IBDV病毒液且步驟3中不加入卵黃抗體的對照組3，用等體積等滴度的新城疫病毒液代替IBDV病毒液的對照組4 ;
每個處理設置3個復孔；
結果見圖4。ELISA結果表明，IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗體可以與不同IBDV毒株特異性結合，對不同的IBDV毒株具有不同的親和力。
[0042]實施例5、IBDV-VP2 scFv29 和 IBDV-VP2 scFv30 抗體的中和活性 一、IBDV滴度的測定
將處于對數生長期的DFl細胞接種于96孔細胞培養板，將用DMEM培養基IO1至IO11梯度稀釋的IBDV病毒液（B87株）接種到單層細胞中（每孔100 μ I)，每一稀釋度接種8個細胞孔；設置不加入IBDV病毒液的對照組。將細胞培養板放到細胞培養箱中，37°C、5% CO2培養，連續觀察7天，每天記錄細胞生長狀態。計算病毒滴度，第7天結果見表1。
[0043]表1 IBDV滴度的測定的結果
【權利要求】
1.兩種單鏈抗體，包括由重鏈可變區、輕鏈可變區以及它們之間的連接區組成； 所述IBDV-VP2 scFv29抗體重鏈可變區為如下（a)或（b) ： Ca)由序列表中序列I自N末端第1-129位氨基酸殘基組成的蛋白質；（b)將（a)經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質； 所述IBDV-VP2 scFv29抗體輕鏈可變區為如下（c)或（d) :(c)由序列表中序列I自N末端第145-250位氨基酸殘基組成的蛋白質；（d)將（c)經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質； 所述IBDV-VP2 scFv30抗體重鏈可變區為如下（a’）或（b’）：（a’）由序列表中序列I自N末端第1-135位氨基酸殘基組成的蛋白質；（b’）將（a’）經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質； 所述IBDV-VP2 scFv30抗體輕鏈可變區為如下（c’）或（d’）：（c’）由序列表中序列I自N末端第151-255位氨基酸殘基組成的蛋白質；（d’）將（c’）經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質。
2.如權利要求1所述的兩種單鏈抗體，其特征在于： 所述IBDV-VP2 scFv29單鏈抗體為如下（e)或（f ): (e)由序列表中序列I所示的蛋白質；（f)將（e)經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質； 所述IBDV-VP2 scFv30單鏈抗體為如下（e’）或（f’）：（e’ )由序列表中序列3所示的蛋白質；（f ’）將（e’）經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質。
3.編碼權利要求1或2所述單鏈抗體的基因。
4.如權利要求3所述的基因，其特征在于： 所述IBDV-VP2 scFv29單鏈抗體基因中，編碼所述重鏈可變區的DNA分子為如下（I)或(2)或（3) : (I)序列表的序列2自5’末端第1-387位核苷酸所示的DNA分子；（2)在嚴格條件下與（I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3)與（I)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子； 所述IBDV-VP2 scFv29單鏈抗體基因中，編碼所述輕鏈可變區的DNA分子為如下（4)或（5)或（6): (4)序列表的序列2自5’末端第433-753位核苷酸所示的DNA分子；（5)在嚴格條件下與（4)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)與（4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子； 所述IBDV-VP2 scFv30單鏈抗體基因中，編碼所述重鏈可變區的DNA分子為如下（I’）或（2’）或（3’）：（ I’）序列表的序列4自5’末端第1-405位核苷酸所示的DNA分子；（2’）在嚴格條件下與（I’）限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3’）與0-)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；所述IBDV-VP2 scFv30單鏈抗體基因中，編碼所述輕鏈可變區的DNA分子為如下（4)或（5)或（6): (4)序列表的序列2自5’末端第451-768位核苷酸所不的DNA分子；（5)在嚴格條件下與（4)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)與（4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
5.如權利要求4所述的基因，其特征在于：所述IBDV-VP2 scFv29單鏈抗體基因為如下（7)或（8)或（9)或（10): (7)序列表的序列2自5’末端第1-753位核苷酸所示的DNA分子；（8)序列表的序列2所示的DNA分子；(9)在嚴格條件下與（7)或（8)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10)與（7)或（8)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子； 所述IBDV-VP2 scFv30單鏈抗體基因為如下（7’）或（8’）或（9’）或（10’）：（7’）序列表的序列4自5’末端第1-768位核苷酸所不的DNA分子；（8’）序列表的序列2所不的DNA分子；（9’）在嚴格條件下與（7’）或（8’）限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10’）與（7)或（8’）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
6.含有權利要求3至5中任一所述基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組菌。
7.基于權利要求1或2所述單鏈抗體的其它形式的抗體。
8.權利要求1所述單鏈抗體、權利要求2所述單鏈抗體或權利要求7所述抗體在制備產品中的應用；所述產品的功能為如下（I )、（11)或(ΠΙ)或(IV):( I )檢測傳染性法氏囊病病毒；（II)輔助鑒定傳染性法氏囊病病毒；（III)預防和/或治療傳染性法氏囊病病毒引起的疾病；（IV)預防和/或治療傳染性法氏囊病。
9.含有權利要求1所述單鏈抗體、權利要求2所述單鏈抗體或權利要求7所述抗體的產品；所述產品的功能為如下（I )、（II)或(III)或(IV) : (I )檢測傳染性法氏囊病病毒；(II)輔助鑒定傳染性法氏囊病病毒；(III)預防和/或治療傳染性法氏囊病病毒引起的疾病；(IV)預防和/或治療傳染性法氏 囊病。
10.權利要求1所述單鏈抗體、權利要求2所述單鏈抗體或權利要求7所述抗體在輔助鑒定傳染性法氏囊病病毒中的應用。
【文檔編號】G01N33/569GK103483449SQ201310362878
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月20日 優先權日:2013年8月20日
【發明者】尹杰超, 周兵, 李天鶴, 李德山, 張瑛杰, 張立夏 申請人:東北農業大學