ELISA檢測融合蛋白rMBP-NAP的方法
【專利摘要】本發明公開了一種ELISA檢測融合蛋白rMBP-NAP的方法，包括包被、封閉、加樣、加鼠MBP單抗、加酶標二抗、加入底物顯色。本發明使用兔NAP多克隆抗體包被，尤其是經NAP-GST親和層析純化抗體，通過使用商品化的酶標二抗的夾心間接ELISA法，避免了制備酶標抗體的麻煩，增加了靈敏度，在測定時也無需經過特殊處理，簡便快捷、靈敏、特異性好。另外，在本發明的工作濃度下，還可很好地對rMBP-NAP進行定量分析：批內變異系數小于10%，批間變異系數均小于15%；加入結構類似的干擾物NAP-GST后，OD值并沒有升高，T檢驗證明沒有發生顯著差異；回收率也在85-115%之間。
【專利說明】ELISA檢測融合蛋白rMBP-NAP的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種融合蛋白rMBP-NAP，尤其涉及一種ELISA檢測融合蛋白rMBP-NAP的方法。
【背景技術】
[0002]幽門螺桿菌{Helicobacter pylori, Hp)是定植于人胃粘膜的革蘭氏陰性螺桿菌，世界上約有50%的人感染幽門螺桿菌。幽門螺桿菌產生一系列獨特的毒力因子，其中包括中性粒細胞激活蛋白(Hp-NAP)。Hp菌體培養條件苛刻，難以進行大規模培養。細菌抗原組分復雜，且含量較低，直接從全菌中分離純化出保護性抗原的難度較大，方法繁瑣。本實驗室在中國第一個提交了 HP-NAP的編碼基因序列，Gnebank登錄號AY366361，并構建了由大腸桿菌萬.coli TBl表達重組蛋白rMBP-NAP的方法，rMBP-NAP蛋白的分子量約為59KD，為大分子蛋白抗原，該蛋白由MBP (麥芽糖結合蛋白)和NAP (幽門螺桿菌中性粒細胞激活蛋白)兩種蛋白融合而成，具體制備方法見專利CN201010177875.0。
[0003]Enzyme-1inkedimmunoassay,簡稱ELISA,是利用抗原抗體之間專一性鍵結之特性，對檢體進行檢測，主要以夾心法(sandwich)、間接法(indirect)、以及競爭法(Competitive)三種為主。
[0004]其中雙抗體夾心法基本工作原理是:利用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結合，形成固相抗體抗原酶標抗體免疫復合物。由于反應系統中固相抗體和酶標抗體的量相對于待測抗原是過量的，因此復合物的形成量與待測抗原的含量成正比(在方法可檢測范圍內)。測定復合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質量(0D值)，即可確定待測抗原含量。若固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個不同的抗原決定簇結合，則屬于雙位點夾心法。
[0005]雙抗體夾心法中，傳統的雙多抗夾心法(A法)所需檢測抗體和固相載體包被抗體都是多抗，制備簡單，在一定范圍內檢測靈敏度高，信號顯示強，很難避免鉤狀效應，其主要問題在于:固相載體上的抗體和檢測抗體都為針對完整抗原所有抗原結合位點多克隆抗體，抗原濃度比較低的時候，固相支持物上的抗體幾乎跟抗原上所有位點結合，結合力強，空余位點少，檢測抗體與抗原位點少，結合力弱，只要固相支持物上的抗體未與抗原結合飽和，抗原量與最后信號顯示部呈線性關系；隨著抗原量的增加，固相支持物上的抗體與抗原結合飽和，空余位點越來越多，檢測抗體與抗原的空余位點結合，信號顯示與實際抗原增長呈幾何倍數增長，同樣不呈線性關系；隨著抗原量的增加，固相載體上的抗體與每個抗原的結合位點很少，結合力很弱，而過量的檢測抗體與其結合位點增多，結合力增強，因為抗原抗體結合本來就是一個動態可逆的反應過程，一旦從固相載體上抗體與抗原解離下來的時候，位點立即被檢測抗體結合，形成抗原抗體復合物沉淀，在洗滌過程中被洗掉，隨著抗原量的增加，而信號反而降低，就是所謂的鉤狀效應。此時反應后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低于實際的含量，因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。
[0006]而用高親和力的單克隆抗體對(B法)即檢測抗體和固相載體包被抗體都用單克隆抗體，生產此類試劑盒可削弱鉤狀效應，由于固相載體上的抗體和檢測抗體結合的不是相同的位點，所以不形成競爭關系，一般情況下不會形成鉤狀效應，但是單克隆抗體制備周期長，成本高，特別是高親和力的配對抗體更是不容易得到，同時，由于固相載體上抗體和檢測抗體都是單位點與抗原結合，所以結合力弱，信號顯示值低，敏感性差，穩定性也不好。

【發明內容】

[0007]本發明克服了現有技術的不足，提供了一種ELISA檢測融合蛋白rMBP-NAP的方法，制備方法簡單、成本低、周期短，且精密度、特異性好。
[0008]為達到上述目的，本發明采用的技術方案為:
一種ELISA檢測融合蛋白rMBP-NAP的方法，包括以下步驟:
1)包被:將IOOul被包被緩沖液稀釋至500ng/mL的兔抗幽門螺桿菌NAP多抗，包被至固體載體如酶標板，用洗滌緩沖液洗滌；
2)封閉:再加封閉液以封閉，孵育后洗滌
3)加樣:分別加入IOOul工作濃度(15.625-1000ng/mL、2倍倍比稀釋的梯度)的rMBP-NAP抗原標準品和待測樣品，孵育后洗滌
4)分別加入稀釋至50ng/mL的小鼠MBP單抗IOOul，孵育后洗滌
5)分別加入IOOul辣根過氧化物酶HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體，孵育后洗滌 6)加入底物顯色，并于450nm波長處測定吸光值OD
7)以步驟3中一系列不同稀釋度的rMBP-NAP標準品，制標準曲線，計算樣品中rMBP-NAP的含量。
[0009]使用本法ELISA檢測時，通常另設空白對照/陰性對照。顯色步驟可用商業化的TMB (四甲基聯苯胺)底物，顯色液可由A液和B液(TMB)按1:1比例配制，先加A液，再加B液,避光顯色5-10 min,用濃硫酸終止反應。
[0010]所述兔抗幽門螺桿菌NAP多抗可由含NAP特異片段的抗原免疫兔制得，如用rMBP-NAP免疫，然后再用親和層析純化，親和配體可使用加標簽的NAP抗原，如NAP-GST融合蛋白，該蛋白是在NAP上加了 GST標簽，一種構建方法可參見論文:Long M, Luo J, LiY, et al.Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activatingprotein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer[J].Worldjournal of gastroenterology: WJG, 2009, 15(19): 2381.。以 NAP-GST 融合蛋白為配體的親和層析，層析介質的基質可為常用的S印harose 4B，層析上樣前，可使用磷酸鹽PBS緩沖液(緩沖對為Η2Ρ04_-ΗΡ042_)平衡層析柱，PBS濃度可為10 mM，該緩沖液中NaCl濃度可為137mM，pH可為7.4 ;上完樣，在洗脫前，優選使用PBS緩沖液(緩沖對為Η2Ρ04_-ΗΡ042-)平衡層析柱，PBS濃度可為10 mM，該緩沖液中NaCl濃度較高，可為500mM，pH可為7.4 ;優選使用甘氨酸-HCl緩沖液將兔抗幽門螺桿菌NAP多抗洗脫，該緩沖液的pH可為2.5，濃度可為 0.1 mol/L。
[0011]所述步驟1-5的洗滌，優選使用常用的含吐溫20的PBST緩沖液，其磷酸鹽(緩沖對為H2PO4--HPO42-)濃度可為0.15 mol/L,吐溫20的質量分數可為0.05%, pH可調至7.4 ；所述步驟4或5的稀釋液亦可用如前所述的PBST緩沖液。所述封閉液優選在所述PBST緩沖液中另加入牛血清白蛋白BSA，BSA質量體積分數可為2-5%。[0012]所述步驟2、3、4或5中孵育的條件優選為37 °C，優選孵育Ih。
[0013]所述包被緩沖液可為碳酸鹽緩沖液(緩沖對為HC03_-C032_)，碳酸鹽濃度可為
0.05mol/L，pH可為9.6 ;包被過程可采用在4 °C放置24h或過夜。
[0014]所述樣品或標準品可預先用PBS或PBST緩沖液稀釋。
[0015]本發明的積極效果為:
本發明的鼠MBP單克隆抗體可與rMBP-NAP蛋白中MBP上的表位(印itope)結合，兔NAP多克隆抗體可以與rMBP-NAP蛋白中NAP上的表位(印itope)結合，尤其是經NAP-GST親和層析純化抗體，純度超過90%、效價達到1:12800，可高特異地結合rMBP-NAP抗原，這樣，通過I個單抗、I個多抗即可實現“夾心”；比傳統雙多抗夾心法(A法)線性好，無標準曲線的鉤狀效應；與雙單抗的夾心法(B法)相比制備方法簡單、成本低、周期短。
[0016]通過使用商品化的酶標二抗的夾心間接ELISA法，避免了制備酶標抗體的麻煩，增加了靈敏度，在測定時也無需經過特殊處理，簡便快捷、靈敏、特異性好。
[0017]另外，在本發明的工作濃度下，還可很好地對rMBP-NAP進行定量分析:批內變異系數小于10%，批間變異系數均小于15% ;加入結構類似的干擾物NAP-GST后，OD值并沒有升高，T檢驗證明沒有發生顯著差異；回收率也在85-115%之間。
【具體實施方式】
[0018]部分下文所用試劑(其他試劑或儀器均為市售或本領域常用):
(I)、PBS緩沖液:
在 800 mL 雙蒸水中溶解 NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4.12H20 3.63 g 和 KH2PO4 0.24g，攪拌均勻后，調節pH值至7.4，再加水定容至1000 mL，高壓蒸氣滅菌，4°C保存。
[0019]除非另有指明，以下文中PBS緩沖液均指此磷酸鹽濃度10mM、NaCl濃度137mM的溶液。
[0020](2)、包被緩沖液:稱取Na2CO3 1.59克，NaHCO3 2.94克，加入蒸餾水，調整pH值到9.6，充分溶解后，定容至1L。然后用0.22 μπι微孔濾器除菌，4°C保存。
[0021](3)、洗滌緩沖液:稱取 KH2PO4 0.2 克，Na2HPO4.12H20 2.9 克，NaCl 8.0 克，KCl
0.2克，Tween-20 0.5mL，加入蒸餾水，調整pH值到7.4，充分溶解后，定容至1L，室溫保存。
[0022](4)、PBST緩沖液:將吐溫20加入到(I)所制PBS緩沖液中，吐溫20的體積分數為 0.05%
(5)封閉液(含5%BSA的PBST緩沖液):稱取0.25g BSA，溶解在5 mL (4)所制PBST緩沖液中。存放于4°C，放至室溫后使用，現用現配。
[0023](6)顯色液:顯色液由A液和B液按1:1比例配制，4°C保存，現用現配。
[0024]A液配方:稱取檸檬酸鈉(含I分子水，分子量210.14)約3.15 g溶于150 mL雙蒸水中，即0.1 mol檸檬酸；再稱取稱醋酸鈉(含3個結晶水)11.56 g或者無水醋酸鈉6.9725 g加雙蒸水至850 mL即0.1 mol醋酸鈉；混合以上兩種溶液pH =5.0 ;稱取非那西汀0.08 g加少許(約30 mL)雙蒸水加熱至完全溶解，加入前兩種溶液的混合液中；再加入
0.5 g過氧化脲，混勻即可。[0025]B液配方:稱取TMB (四甲基聯苯胺)1.27 g加入到500 mL甲醇中，加熱溶解，再加入500 mL丙三醇即可。
[0026](7)終止液:蒸餾水178.3 mL，逐滴加入濃硫酸(98%) 21.7 mL，室溫保存
(8)洗脫液:0.1 mol/L 甘氨酸-HCl，pH 2.5
(9)弗式完全佐劑(CFA)、弗式不完全佐劑(IFA)購自Sigma公司
(10)融合蛋白NAP-GST本實驗室制備 兔抗NAP多克隆抗體的制備及驗證:
一、主要動物和免疫原 動物:成年健康雄性新西蘭大白兔，購于河南省實驗動物中心 免疫原:融合蛋白rMBP-NAP
二、免疫、兔抗NAP多克隆抗血清的制備
免疫方式為后頸部皮下注射，每次免疫原用量為0.5 mg/只，0.5 mg免疫原(rMBP-NAP)溶解在500 μ? PBS (10mM、pH 7.4、含137mM NaCl ;具體配制方法及配方見前面描述)緩沖液中。首次免疫時與0.5 mL弗氏完全佐劑CFA混合(1:1, v/v);免疫后第2周和第6周用不完全弗氏佐劑(IFA)進行加強免疫，免疫劑量相同。最后一次免疫2周后收集血,然后收集血清。
[0027]三、純化
1、制備 NAP-GST-Sepharose 4B 親和介質
將NAP-GST蛋白與CNBr激活的S^harose 4B的交聯，經檢測偶聯效果良好，基本上90%以上的蛋白交聯到了載體柱上。
[0028]2、NAP-GST-Sepharose 4B 親和層析
1)將前述收集到的抗血清37°C放置I個小時，再經過4 1:過夜處理，然后按40mL血清加5M的NaCl 4 mL, 8000 rpm離心IOmin,取上清準備過柱
2)預先用10mM的PBS緩沖液(pH 7.4、含137mM NaCl ;具體配制方法及配方見前面描述)平衡 NAP-GST-Sepharose 4B 柱子
3)血清過柱,流速ImL/min
4)用10mM的PBS緩沖液(pH 7.4、含500mM NaCl)洗滌柱子，流速lmL/min，洗20個柱體積
5)洗脫，用0.1 mol/L、pH 2.5的甘氨酸-HCl洗脫靶抗體，控制流出速度為I mL/min。每管收集洗脫液I mL，用100 uL IM Tris堿中和。
[0029]3、純化產物進行SDS-PAGE電泳，檢測抗體的純度
SDS-PAGE電泳結果表明，經過純化的抗體只在50KD附近有一個條帶，沒有其他雜帶，抗體的純度超過90%。
[0030]四、效價驗證
采用間接ELISA方法檢測多克隆抗體效價，具體操作如下
a用包被緩沖液(pH9.6,0.05M碳酸鹽緩沖液)稀釋rMBP-NAP至濃度為10ng/ml，另設空白對照，陰性血清對照，包被酶標板，每孔lOOul。4 °C過夜，棄去液體，甩干，每孔加滿PBST洗滌液，震蕩3min，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復3次，拍干；b用另加有5%BSA的PBST溶液封閉酶標板，37°C孵育lh，洗滌3次； C 在包被孔中依次分別加入 1:1600、1:3200,1:6400、1:12800、1:25600、1 =51200,1:102400稀釋的多克隆抗體樣品，每孔IOOul，37°C孵育lh，洗滌3次；
d在每一包被孔中加入HRP標記羊抗兔IgG抗體(PBST緩沖液稀釋至lmg/mL)，37°C孵育lh，洗滌3次；
e每孔先加A號顯色劑50uL，再加入B號顯色劑50uL，輕輕震蕩混勻，37°C顯色5min，用2mol/L H2SO4終止反應(此時藍色立轉黃色)，酶標儀450nm讀取吸光度(OD)值；測定應在加完終止液15分鐘內進行。
[0031]結果顯示稀釋度在1:12800時，P/N (陽性血清/陰性血清)比值最接近2.1，可知在抗原10ng/mL時,抗體效價達到1: 12800。
[0032]ELISA檢測融合蛋白rMBP-NAP的方法 實施例1:1)包被:用包被緩沖液(PH9.6,0.05M碳酸鹽緩沖液)將兔抗幽門螺桿菌NAP多抗稀釋至500ng/mL,以IOOul每孔加入到酶標板,另設空白對照,4 °C過夜,棄去液體,甩干,每孔加滿PBST洗滌液，震蕩5分鐘，甩去洗滌液，如此重復3次，用吸水紙拍干。另設空白對照、陰性血清對照。
[0033]2)封閉:用封閉液封閉酶標板，37°C孵育lh，洗滌3次，拍干
3)加樣:分別加入IOOul工作濃度(15.625-1000ng/mL、2倍倍比稀釋的梯度)的rMBP-NAP抗原標準品和待測樣品，每個樣品做復孔，37 °C孵育lh，洗滌3次，拍干
4)用0.15mol/L.pH 7.4 PBST緩沖液將小鼠MBP單抗稀釋至50ng/mL，每孔分別加入IOOul,
5)在每一包被孔中加入HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體100uL,
6)每孔先加A號顯色液50uL，再加入B號顯色劑50 uL，震蕩混勻后，37 1:避光顯色5-10 min，用2 mol/L H2SO4終止反應(終止后藍色立轉黃色)，酶標儀450 nm讀取吸光度(OD)值；測定應在加完終止液15分鐘內進行。
[0034]7 )制標準曲線，計算樣品中rMBP-NAP的含量。
[0035]實施例2:
操作步驟如上，封閉液改用含2%BSA的PBST緩沖液，其他操作、條件如上。
[0036]ELISA檢測融合蛋白rMBP-NAP的方法的考核(以實施例1的方法為例)
(I)精密度
精密度通常用批內和批間的變異系數(CV%)來表示，rMBP-NAP的含量在標準曲線范圍內選擇了 250ng/mL、62.5ng/mL和15.625ng/mL三個濃度,來驗證建立的ELISA方法的批內和批間精密度，結果如表1-4和表1-5顯示:批內變異系數均在5.9% — 7.73%范圍內，均小于10%，批間變異系數在6.2%-7.85%范圍內，均小于15%，說明建立的方法重現性良好。
[0037]表1-4批內精密度測定結果
【權利要求】
1.ELISA檢測融合蛋白rMBP-NAP的方法，包括以下步驟: 1)包被:將IOOul被包被緩沖液稀釋至500ng/mL的兔抗幽門螺桿菌NAP多抗，包被至固體載體，用洗滌緩沖液洗滌 2)封閉:再加封閉液以封閉，孵育后洗滌 3)加樣:分別加入IOOul工作濃度的rMBP-NAP抗原標準品和待測樣品，孵育后洗滌 4)分別加入稀釋至50ng/mL的小鼠MBP單抗IOOul，孵育后洗滌 5)分別加入稀釋至lmg/mL的、辣根過氧化物酶HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體IOOul,孵育后洗滌 6)加入底物顯色，并于450nm波長處測定吸光值OD。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于: 所述兔抗幽門螺桿菌NAP多抗的制備方法為:以rMBP-NAP免疫兔得到多抗血清，再經以NAP-GST融合蛋白為配體的親和層析純化制得。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述親和層析包括:上樣前，用磷酸鹽濃度IOmM, pH為7.4的PBS緩沖液平衡層析柱，該緩沖液中NaCl濃度為137mM。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述親和層析包括:在洗脫前，用磷酸鹽濃度10mM、pH為7.4的PBS緩沖液洗滌，該緩沖液中NaCl濃度為500mM。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述親和層析包括:使用0.1 mol/L、pH2.5的甘氨酸-HCl緩沖液將兔抗幽門螺桿菌NAP多抗洗脫。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述封閉液為磷酸鹽濃度為0.15 mol/L、吐溫20的體積分數為0.05%,pH 7.4的PBST緩沖液，其中還含有質量體積分數為2_5%的牛血清白蛋白。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述包被緩沖液為0.05mol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟1-5的洗滌條件獨立地選自:使用0.15 mol/L、pH 7.4 PBST緩沖液進行洗滌。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟4或5所用稀釋液為磷酸鹽濃度為0.15 mol/L、吐溫20的質量分數為0.05%、pH 7.4的PBST緩沖液。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟2、3、4或5中孵育的條件為:37°C孵育Ih。
【文檔編號】G01N33/531GK103558386SQ201310368917
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年8月22日 優先權日:2013年8月22日
【發明者】康巧珍, 汲振余, 劉鑫, 李國棟, 王婷, 陳嬌, 傅國 申請人:鄭州大學