一種對葡萄糖和膽固醇同步檢測的納米生物傳感器的制造方法
【專利摘要】本發明提供一種納米生物傳感器，由已標記碳量子點的伴刀豆蛋白和膽固醇傳感器通過自組裝而成，所述的膽固醇傳感器是由環糊精修飾的納米金與羅丹明6G共孵育后除去多余反應物而得。并進一步提供了這種納米生物傳感器的制備方法以及應用。本發明的納米生物傳感器是基于熒光共振能量轉移理論構建而成，可以同時檢測葡萄糖和膽固醇，并且在檢測過程中不會出現相互干擾，是一種新型、簡便、低成本、快速、高靈敏度的雙重物質定量檢測傳感器。
【專利說明】—種對葡萄糖和膽固醇同步檢測的納米生物傳感器

【技術領域】
[0001]本發明屬于生化分析領域，更具體地，涉及一種對葡萄糖和膽固醇同步檢測的納米生物傳感器及其制備方法和應用。

【背景技術】
[0002]FRET即熒光共振能量轉移是較早發展起來的一門技術，隨著綠色熒光蛋白應用技術的發展，FRET已經成為檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、細胞生理研究、免疫分析等方面有著廣泛的應用。熒光共振能量轉移是距離很近的兩個熒光分子間產生的一種能量轉移現象。當供體熒光分子的發射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10 nm范圍以內時，就會發生一種非放射性的能量轉移，即FRET現象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多(熒光猝滅)，而受體發射的熒光卻大大增強(敏化熒光)。基于FRET理論構建的納米生物傳感器，在本領域的研究中一直占據著舉足輕重的地位。
[0003]葡萄糖是最顯著的能量源，在人體代謝過程中，血液中的葡萄糖的濃度被認為是對人體健康狀況醫療診斷中的一項重要指標。截至目前，血糖測定主要是基于熒光和電化學方法。電化學方法是簡單的和快速的，并已被廣泛用于在葡萄糖傳感器設計中，但該信號容易受血清中或者尿液中的還原性基質如抗壞血酸和尿素的影響，在實際測量中仍存在誤差。作為一項高靈敏度和無損壞性的技術，熒光已被廣泛應用于各種原理葡萄糖傳感器的設計。雖然目前檢測葡萄糖的報道層出不窮，但是基于復雜生物樣品基質如血清里的生物分子(葡萄糖)的檢測，仍有探索新技術的意義。迄今為止，現有技術中基于FRET原理的葡萄糖傳感器尚不多見。
[0004]膽固醇是動物細胞膜的一個重要組成部分和合成不同生物分子如膽酸類、類固醇激素、維他命D的主要前體。但血清中過量的膽固醇會在血管通道中形成斑塊，從而阻礙血液的循環和導致心血管疾病。現有技術中用于膽固醇檢測的方法主要有熒光分析、電化學分析、分子印跡技術等，但是這些檢測方法中的選擇性大多依賴于對膽固醇特異性識別的酶或抗體，并具有損壞性和成本相當昂貴。因此，針對血清或者食物樣品，設計出簡單、高選擇性、低成本、快速和高靈敏的膽固醇方法仍然極具臨床意義。
[0005]構建低成本、多功能的生物傳感檢測技術以解決日常生活及臨床診斷中出現的問題是當前的熱點。由于糖尿病、心腦血管疾病這兩類疾病的居高不下，使得開發葡萄糖和膽固醇同步檢測的、低成本、快速和高靈敏的生物傳感檢測技術尤為重要。因此，本發明公開一種基于FRET原理的納米生物傳感器，用于血清中的葡萄糖和膽固醇的同步檢測。
[0006]


【發明內容】

本發明的目的在于提供一種用于同步檢測血清樣品中葡萄糖和膽固醇的簡易、低成本、高靈敏度的熒光納米生物傳感器。
[0007]為了實現這一發明目的，本發明首先提供一種納米生物傳感器，由已標記碳量子點的伴刀豆蛋白和膽固醇傳感器通過自組裝構建而成， 所述的膽固醇的傳感器是由環糊精修飾的納米金與羅丹明6G共孵育后除去多余反應物而得。
[0008]所述的已標記碳量子點的伴刀豆蛋白是通過碳量子點表面的大量羧基與伴刀豆球蛋白上的氨基形成酰胺鍵連接而成。
[0009]所述的環糊精修飾的納米金呈酒紅色。
[0010]本發明更進一步提供一種上述的納米生物傳感器的制備方法，包括以下步驟
51.已標記碳量子點的伴刀豆蛋白的合成:所述的碳量子點是表面帶大量羧基，通過將伴刀豆球蛋白的氨基進行活化，碳量子點以酰胺鍵的方式標記到伴刀豆球蛋白上；
52.環糊精修飾的納米金的合成:所述的環糊精修飾的納米金，通過氯金酸鹽與巰基-β -環糊精混合溶液在激烈磁性攪拌中加入氫氧化鈉一步法合成；
53.膽固醇傳感器的合成:將步驟S2所得的環糊精修飾的納米金與羅丹明6G混合，在搖床上共孵育；
S4將步驟SI所得的已標記碳量子點的伴刀豆蛋白與步驟S3所得的膽固醇傳感器在搖床上共孵育，即得。
[0011]步驟S3的共孵育的時間為1(Γ20分鐘；步驟S4所述的共孵育的時間為30飛0分鐘。
[0012]步驟S4所述的已標記碳量子點的伴刀豆蛋白與膽固醇傳感器的重量比約為f 5:
1
[0013]步驟S3所述的環糊精修飾的納米金與羅丹明6G的重量比約為1:100(Γ2000。
[0014]為了進一步說明本發明，發明人對本發明進行如下解釋，但是不能理解為對本發明的限定。
[0015]本發明提供的是一種基于FRET熒光共振能量轉移理論構建的生物傳感器，是由碳量子點標記的伴刀豆球蛋白ConA與羅丹明6G共孵育后的環糊精修飾的納米金自組裝形成。巰基_β -環糊精修飾的納米金作為所構建的生物傳感器的熒光猝滅基團即能量受體，碳量子點標記的ConA和羅丹明6G作為能量的供體。羅丹明6G通過疏水作用進入環糊精的疏水空腔，而合成的碳量子點標記的ConA通過ConA上的糖的特異結合位點與環糊精上的D-吡喃葡萄糖單元自組裝，簡易高效得到目標納米傳感器。由于納米金與ConA上的以及環糊精疏水空腔內的熒光基團距離很小，形成有效的熒光共振能量轉移，使得碳量子點和羅丹明6G的熒光同時被納米金猝滅。而當加入含葡萄糖的樣本時，由于葡萄糖與ConA的結合力遠大于環糊精與ConA的結合力，從而將納米金從標記碳量子點的ConA上取代下來，伴隨著納米金與ConA距離的增加，FRET現象消失，碳量子點的熒光得以恢復。樣本中葡萄糖含量與熒光的恢復情況呈線性關系，通過測定熒光發射強度從而可定量檢測出樣本的葡萄糖含量。而當加入含膽固醇的樣本時，由于膽固醇與環糊精的疏水空腔的結合能力遠強于羅丹明6G，從而取代出羅丹明6G，伴隨著納米金與羅丹明6G距離增加，FRET現象消失，使得其熒光恢復，熒光恢復情況與待測樣本中的膽固醇含量有線性關系，通過測定熒光發射強度可定量檢測出樣本的膽固醇含量。由于選取的碳量子點與羅丹明6G這兩種熒光染料具有不同波長的熒光發射，檢測中不會發生相互干擾，從而實現多功能納米生物傳感器的構建。
[0016]本發明所述的納米生物傳感器的構建是將環糊精修飾的納米金先與羅丹明6G共孵育后除去多余產物先構成檢測膽固醇的傳感器，再和已標記碳量子點的伴刀豆蛋白ConA通過自組裝的簡單過程來實現。
[0017]本發明中所述的碳量子點標記的伴刀豆球蛋白ConA，是碳量子點這種國際上公認的新型熒光染料在生物上的創新應用，碳量子點具有高量子產率、低成本、低毒性、低光漂白、高生物相容性等諸多優點，本發明公開的技術首次將碳量子點標記上伴刀豆球蛋白加以應用到生物傳感器中，以提高檢測的靈敏度及生物傳感平臺的穩定性。
[0018]所述的碳量子點是表面帶大量羧基，通過將伴刀豆球蛋白ConA上的氨基進行活化，碳量子點以酰胺鍵的方式標記到ConA上，標記過程確保碳量子點的熒光特性及伴刀豆球蛋白ConA的蛋白特性不發生明顯改變。
[0019]所述的ConA的標記以及涉及到具體樣本中葡萄糖的檢測環節需要用到含有Ca2+和Mn2+的pH為7.4的PBS緩沖溶液，ConA上的糖識別位點需要Ca2+和Mn2+的活化，并且pH為7.4的PBS溶液是生物醫學上常用的緩沖溶液。
[0020]所述的環糊精修飾的納米金采用新型的有別于傳統檸檬酸鈉法的一步合成方法進行制備，產物均一，分散性好，呈酒紅色。
[0021]所述的納米生物傳感器核心步驟是碳量子點對ConA的成功修飾，以及納米金表面充分修飾環糊精并且產物分散性很好。
[0022]本發明涉及的碳量子點、羅丹明6G染料的熒光激發和發射性質不同，檢測所使用的熒光發射波形不發生重疊互相干擾，從而借助熒光分析手段可以實現簡易、低成本、快速、高靈敏度的雙重物質定量檢測。
[0023]本發明中構建出新型雙重檢測的納米生物傳感器能同時檢測血清中的葡萄糖與膽固醇，實現生物醫學檢測領域上的突破。所設計的傳感器的構建過程只需45分鐘，檢測時間只需30分鐘，成功研發后并無技術上的難度，從而對于發展中及不發達國家地區的推廣應用具有很大的應用研發前景。
[0024]

【專利附圖】

【附圖說明】
圖1基于FRET理論構建的新型納米生物傳感器的原理示意圖。
[0025]

【具體實施方式】
下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。除非特別說明，本發明采用的試齊U、設備和方法為本【技術領域】常規市購的試劑、設備和常規使用的方法。
[0026]實施例1 一種納米生物傳感器的制備，以及對葡萄糖和膽固醇的檢測
(I)材料準備
Mil1-Q超純水，伴刀豆球蛋白ConA，1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，氯金酸(HAuCl4.3H20)，巰基-β -環糊精(SH-β-CDs)，C量子點(CQDs，參考已有文獻自行制備)，檸檬酸鈉，PBS緩沖液(10 mM, pH=7.4，含Ca2+和Mn2+各I mM)，六水合氯化鎂，二水合氯化鈣，羅丹明6G，葡萄糖，膽固醇，無水乙醇，牛/人血清，截留分子量為1000，3000、14000的透析袋，96孔酶標板，2、5、15、50mL離心管，錫紙。
[0027](2)環糊精修飾的納米金的制備:
室溫下，首先取 47.0 mL 的 Mil1-Q 超純水，取 10.0 mg 的 SH-β-CDs 和 2.0 mL 1.0%(w/w)HAuCl4加入100 mL圓底燒瓶中，超聲溶解混合均勻，然后在激烈攪拌中將1.0 mL 1.0 M的NaOH溶液快速加入其中使得pH達到11，避光攪拌16小時后反應質得近酒紅色的納米金溶液，用截留分子量3500的透析袋純化處理，做透射電鏡、紫外吸收光譜(紫外最大吸收峰在520 nm)、粒徑、和表面電位的各項性質檢測后，待用。
[0028](3)碳量子點的制備:
參考國際上已經發表的制備方法，一步簡易合成制備出表面富含羧基的碳量子點水溶液，完成紅外，高分辨電鏡的各項測試后待用。
[0029](4)碳量子點標記伴刀豆球蛋白ConA的制備:
室溫下，ConA 溶解在 PBS 緩沖溶液(10 mM, ρΗ7.4)含 CaCl2 (1.0 mM)和 MnCl2 (1.0mM)濃度為1.0 mg mL—1，存儲在4°C冰箱中；取制備待用的碳量子點溶液1.00 mL，適量PBS緩沖液(10 mM, pH7.4)溶解0.5 mg EDC和0.25 mg NHS，在室溫下搖床中共孵育30分鐘；隨后活化后的富含羧基的碳量子點溶液和0.5 mL的活化過后富含活化氨基的ConA溶液混合，于搖床中共孵育2小時，并在4°C冰箱中存儲過夜；之后用YM-30K的超濾離心管，在12000 rpm下離心5分鐘,重復純化幾次,得到碳量子點標記的ConA待用。
[0030](5)羅丹明6G-環糊精修飾的納米金的處理:
通過將0.01 mM羅丹明6G溶液與制備好的環糊精修飾的納米金溶液做熒光猝滅實驗，在得出的猝滅曲線上找到其最佳組裝比例，最佳反應時間15分鐘；將0.01 mM羅丹明6G水溶液與制備的納米金按比例混合混合，于搖床共孵育15分鐘后，用截留分子量3500的透析袋進行純化透析出多余的羅丹明6G，待用。
[0031](6)這種新型生物傳感器的組裝:
將制備好的羅丹明6G-環糊精修飾的納米金溶液與碳量子點標記的ConA溶液做關于碳量子點的熒光猝滅實驗，通過獲得的熒光猝滅曲線找到兩者組裝的最佳比例和最佳猝滅時間。將制備好的羅丹明6G-環糊精修飾的納米金溶液與碳量子點修飾的ConA溶液按2:1比例進行混勻并于室溫下，在搖床上共孵育45分鐘后，待用。
[0032](7)膽固醇的檢測:
先將膽固醇標準品配置成不同濃度待測的乙醇溶液作為待測樣本，分別取800 μ L的(6)中溶液，向其中分別加入100 μ L不同濃度的待測樣本，然后都用超純水稀釋至I mL，于搖床上室溫下，搖勻反應30分鐘,然后各樣本在設置為激發波長525 nm,發射波長565nm的多功能酶標儀中進行熒光值的測定，找到膽固醇含量與體系熒光值的標準曲線，從而進行實際樣本中的膽固醇含量的精確檢測。
[0033](8)葡萄糖的檢測:
先將葡萄糖標準品配置成不同濃度的待測的水溶液作為待測樣本，分別取800 μ L的
(6)中的溶液，向其中分別加入100 μ L不同濃度的待測樣本，然后都用超純水稀釋至I mL，于搖床上室溫下，搖勻反應45分鐘，然后各樣本在設置為激發波長370 nm,發射波長480nm的多功能酶標儀中進行熒光值的測定，找到樣本中的葡萄糖含量與體系熒光值的標準曲線，從而進行實際樣本中的葡萄糖含量的檢測。
[0034](9)血清中的膽固醇和葡萄糖的檢測:
取100 μ L胎牛/人血清，適量乙醇，適量PBS緩沖溶液，適量的葡萄糖、膽固醇，600μ L組裝完成的傳感器溶液，稀釋至I mL配置成不同濃度的葡萄糖、膽固醇溶液樣本，室溫下于搖床上混勻，反應45分鐘后，分別用設置為激發波長525 nm發射波長565 nm，和激發波長370 nm發射波長480 nm的多功能酶標儀進行熒光值測量，分別做出相關含量與熒光值的線性曲線圖，從而獲得適用于普遍樣本的葡萄糖、膽固醇的定量測量。用本發明所述納米生物傳感器與國標法(WS/T350-2011血清葡萄糖測定參考方法；WS/T120-1999血清總膽固醇的酶法測定)測定同一血清樣本中的膽固醇和葡萄糖，結果顯示本發明所述的納米生物傳感器達到與國標法相同的準確度和精密度。
【權利要求】
1.一種納米生物傳感器，其特征在于，由已標記碳量子點的伴刀豆蛋白和膽固醇傳感器通過自組裝構建而成， 所述的膽固醇傳感器是由環糊精修飾的納米金與羅丹明6G共孵育后除去多余反應物而得。
2.根據權利要求1所述的納米生物傳感器，其特征在于，所述的已標記碳量子點的伴刀豆蛋白是通過碳量子點表面的大量羧基與伴刀豆球蛋白上的氨基形成酰胺鍵連接而成。
3.—種權利要求1所述的納米生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.已標記碳量子點的伴刀豆蛋白的合成:所述的碳量子點是表面帶大量羧基，通過將伴刀豆球蛋白的氨基進行活化，碳量子點以酰胺鍵的方式標記到伴刀豆球蛋白上； 52.環糊精修飾的納米金的合成:所述的環糊精修飾的納米金，通過氯金酸鹽與巰基-β -環糊精混合溶液在激烈攪拌中加入氫氧化鈉一步法合成； 53.膽固醇傳感器的合成:將步驟S2所得的環糊精修飾的納米金與羅丹明6G混合，在搖床上共孵育， S4將步驟SI所得的已標記碳量子點的伴刀豆蛋白與步驟S3所得的膽固醇傳感器在搖床上共孵育，即得。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟S3的共孵育時間為1(Γ20分鐘；步驟S4所述的共孵育時間為3(Γ60分鐘。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟S4所述的已標記碳量子點的伴刀豆蛋白與膽固醇傳感器的重量比約為廣5:1。
6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟S3所述的環糊精修飾的納米金與羅丹明6G的重量比約為1: 1000?2000。
7.一種根據權利要求1所述的納米生物傳感器在檢測葡萄糖和/或膽固醇含量中的應用。
【文檔編號】G01N33/92GK104198740SQ201410365885
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】易長青, 張肇敏, 陳俊英, 張璐璐, 時宇鵬, 潘益, 張恒 申請人:中山大學