一種生物電極及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種生物電極及其制備方法。所述生物電極包括絕緣外殼和電極線，所述電極線包括多個工作電極線、一個或多個參比電極線和對電極線，所述電極線側表面包覆有絕緣蠟，樹脂封裝于絕緣外殼中，所述外殼尖端開口，其尖端開口口徑在0.4mm至2mm之間，所述電極線的檢測端通過所述開口與待測生物樣本接觸。其制備方法包括以下步驟：(1)將絕緣蠟溶解于易揮發的有機溶劑中得到絕緣液，均勻涂覆在電極線側表面，待有機溶劑揮發；(2)將電極線同時插入絕緣外殼中，將樹脂灌入外殼，固化后，將外殼尖端打磨光滑。本發明提供的生物電極，能同時同點載體檢測多種信號，具有良好的機械性能，適用于活體檢測，所述方法適應性強。
【專利說明】一種生物電極及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測領域，更具體地，涉及一種生物電極及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 傳感檢測技術在生物分析領域中發揮了重要的作用。目前，利用電化學傳感器 進行生物分子的離體檢測與分析已較為成熟，將其用于生物活性物質的在體檢測也引起 了越來越多的研究者關注。目前已經有很多研究用電化學的方法檢測生物體中的活性分 子，例如用碳纖維電極檢測植物在水脅迫下的過氧化氫含量變化[Ren Qiong-qiong, et al. Biosensors and bioelectronics, 2013, 50:318-324]，利用鉬微電極檢測老鼠腎 臟中的 NO 含量[Youngmi Lee, et al. Analytical chemistry, 2007,79:7665-7675]， 利用硼摻雜金剛石微電極檢測胃部pH變化[St6phane Fierro, et al. Scientific r印orts，2013, 3:3257]等。對研究生物體的生理、病理機制具有很重要的意義。
[0003] 目前，活體檢測電極，不能在微型化的前體下，保證機械強度，因此檢測多種物質 時，要么先后檢測，要么采取不同的檢測位點，尤其是在植物中，難以做到同時同點檢測。


【發明內容】

[0004] 針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種生物電極，其目的在于 通過將多個工作電極線和參比電極線、對電極線集成在小尺寸生物電極上，由此解決現有 技術不能實現同時同點多種生物信號同時在體檢測的技術問題。
[0005] 為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種生物電極，包括絕緣外殼和 電極線，所述電極線包括多個工作電極線、一個或多個參比電極線和對電極線，所述電極 線側表面包覆有絕緣蠟，樹脂封裝于絕緣外殼中，所述外殼尖端開口，其尖端開口 口徑在 0. 4mm至2mm之間，所述電極線的檢測端通過所述開口與待測生物樣本接觸。
[0006] 優選地，所述生物電極，其包括三個工作電極線。
[0007] 優選地，所述生物電極，其三個工作電極線分別為第一工作電極線、第二工作電極 線和第三工作電極線；其中：
[0008] 第一工作電極線，用于電流測量，獲得過氧化氫濃度；
[0009] 第二工作電極線，用于電流測量，獲得一氧化氮濃度；
[0010] 第三工作電極線，用于電位測量，獲得pH值。
[0011] 優選地，所述生物電極，其第一工作電極線為鉬絲；所述第二工作電極線為鉬絲， 其檢測端表面電化學沉積有鉬顆粒；所述第三工作電極線為金絲，其檢測端表面電化學沉 積有氧化銥顆粒。
[0012] 優選地，所述生物電極，其包括兩個參比電極線。
[0013] 優選地，所述生物電極，其兩個參比電極線分別為第一參比電極線、第二參比電極 線；其中：
[0014] 第一參比電極線，用作電流測量參比電極；
[0015] 第二參比電極線，用作電位測量參比電極。
[0016] 優選地，所述生物電極，其兩個參比電極線為銀絲，其檢測端表面電化學沉積有氯 化銀顆粒。
[0017] 優選地，所述生物電極，其電極線檢測端表面覆蓋有抗干擾層，所述抗干擾層優選 為Nafion膜、纖維素膜或聚四氟乙烯膜。
[0018] 按照本發明的另一方面，提供了一種所述的生物電極的制備方法，包括以下步 驟：
[0019] (1)電極線絕緣：將絕緣蠟溶解于易揮發的有機溶劑中，得到絕緣液，將絕緣液均 勻涂覆在電極線側表面，待有機溶劑揮發，制得側表面絕緣的電極線；
[0020] (2)電極線集成固定：將步驟（1)中獲得的側表面絕緣的電極線同時插入絕緣外 殼中，將樹脂灌入外殼，固化后，將外殼尖端打磨光滑，即獲得所述生物電極；
[0021] 優選地，所述制備方法，還包括以下步驟：
[0022] (3)電極線檢測端修飾：將步驟⑵中獲得的生物電極通過電化學的方法，將電極 線表面分別進行電化學修飾。
[0023] 總體而言，通過本發明所構思的以上技術方案與現有技術相比，能夠取得下列有 益效果：
[0024] (1)本發明通過將多個工作電極集成到一個電極上，可同時檢測多種不同的信號， 由于檢測是同時完成，并且是在同一位置做出的檢測，因此多個信號之間不會出現時間和 空間差異，檢測結果為同時同點，可靠性高；
[0025] (2)本發明提供的生物電極，檢測端尺寸小、機械強度高，可用于生物體活體檢 測；
[0026] (3)本發明提供的生物電極的制備方法，可根據不同的檢測需要，制備用于檢測多 種生物信號的集成電極，適應性強。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1是實施例1中制備的生物電極結構示意圖；
[0028] 圖2是實施例2中制備的生物電極尖端掃描電鏡圖；
[0029] 圖3是實施例2中利用循環伏安法在微電極上電沉積鉬微粒的伏安圖；
[0030] 圖4是實施例2中電位階躍法電鍍氧化銥顆粒的電位圖；
[0031] 圖5是實施例2中計時電流法電沉積氯化銀顆粒，電位為0. 5V，溶液為0. 5M氯化 鉀溶液；
[0032] 圖6是實施例3中30 μ Μ的H202和N0分別在第一工作電極線上不同電位下的響 應電流；
[0033] 圖7是實施例3中30 μ Μ的H202和N0分別在第二工作電極線上不同電位下的響 應電流；
[0034] 圖8是實施例3第三工作電極線在pH為2?10的不同標準緩沖液中的電勢響 應；
[0035] 圖9是實施例3中第一工作電極對不同的活性物質的抗干擾能力；
[0036] 圖10是實施例3中第二工作電極對不同的活性物質的抗干擾能力；
[0037] 圖11是實施例3中油菜受旱脅迫和未受旱脅迫時的H202、NO和pH變化。
[0038] 在所有附圖中，相同的附圖標記用來表示相同的元件或結構，其中：1為第一工作 電極線，2為第二工作電極線，3為第三工作電極線，4為導電膠，5為絕緣外殼，6為對電極 線，7為第一參比電極線，8為第二參比電極線，9為絕緣蠟，10為樹脂，11為銅線。

【具體實施方式】
[0039] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并 不用于限定本發明。此外，下面所描述的本發明各個實施方式中所涉及到的技術特征只要 彼此之間未構成沖突就可以相互組合。
[0040] 本發明提供的生物電極，包括絕緣外殼和電極線，所述電極線包括多個工作電極 線、一個或多個參比電極線和對電極線，所述電極線側表面包覆有絕緣蠟，樹脂封裝于絕緣 外殼中，所述外殼尖端開口，其尖端開口 口徑在0. 4mm至2mm之間，所述電極線的檢測端通 過所述開口與待測生物樣本接觸。絕緣外殼優選采用聚丙烯材料，在微型化的前提下，保證 機械強度。樹脂封裝優選環氧樹脂，保證絕緣性能和機械強度。絕緣外殼尖端開口 口徑太 小，則電極線過細導致信號不穩定；絕緣外殼尖端開口過大，則檢測位點差異較大，并且不 適合做較小的生物組織樣本檢測。
[0041] 所述生物電極包括三個工作電極線，分別為第一工作電極線、第二工作電極線和 第三工作電極線；其中：
[0042] 第一工作電極線（WE1)，用于電流測量，獲得過氧化氫濃度，優選為鉬絲；
[0043] 第二工作電極線（WE2)，用于電流測量，獲得一氧化氮濃度，優選為鉬絲，其檢測端 表面電化學沉積有鉬顆粒；
[0044] 第三工作電極線（WE3)，用于電位測量，獲得pH值，優選為金絲，其檢測端表面電 化學沉積有氧化銥顆粒。
[0045] 所述生物電極包括兩個參比電極線分別為第一參比電極線、第二參比電極線，優 選為銀絲，其檢測端表面電化學沉積有氯化銀顆粒；其中：
[0046] 第一參比電極線（RE1)，用作電流測量參比電極；
[0047] 第二參比電極線（RE2)，用作電位測量參比電極。
[0048] 所述對電極線（CE)為鉬絲。
[0049] 所述電極線檢測端表面覆蓋有抗干擾層，常用抗干擾層為Nafion膜、纖維素膜或 聚四氟乙烯膜，優選為Nafion膜。
[0050] 本發明提供的生物電極的制備方法，包括以下步驟：
[0051] (1)電極線絕緣：將絕緣蠟溶解于易揮發的有機溶劑中，得到絕緣液，將絕緣液均 勻涂覆在電極線側表面，待有機溶劑揮發，制得側表面絕緣的電極線；優選的絕緣液為阿皮 松蠟與有機溶劑二氯甲烷以l:l(w/ v)混合的溶液，阿皮松蠟絕緣性能良好，且分布均勻， 不會聚集成團，能保證結構緊湊，適用于本發明提供的生物電極。
[0052] (2)電極線集成固定：將步驟（1)中獲得的側表面絕緣的電極線同時插入絕緣外 殼中，將樹脂灌入外殼，固化后，將外殼尖端打磨光滑，即獲得所述生物電極。
[0053] 優選地，采用環氧樹脂進行電極線集成，其操作步驟為：環氧樹脂與乙二胺以質量 比100:6. 5的比例混合，并進行超聲除泡；將除泡處理的環氧樹脂溶液灌入絕緣外殼中； 30°C干燥過夜。
[0054] 優選地，外殼尖端打磨操作如下：將固化后的生物電極尖端分別在1 μ m，0. 3 μ m， 0. 05 μ m的氧化鋁漿中打磨，并分別在水、稀硝酸、水中超聲5分鐘。
[0055] (3)電極線檢測端修飾：將步驟⑵中獲得的生物電極通過電化學的方法，將電極 線表面分別進行電化學修飾，修飾后的電極尖端包覆抗干擾膜，常用如Nafion膜、纖維素膜 或聚四氟乙烯膜，優選為Nafion膜。
[0056] 對集生物電極進行修飾，制成針對不同物質的同時檢測三種活性物質的生物電 極，用于生物的在體檢測。例如利用鄰苯二胺修飾電鍍有鉬微粒的鉬盤電極，制成過氧化 氫傳感器，檢測植物體內受到致病因子侵染后產生的過氧化氫；利用依次利用導電聚合物 (poly-TTCA)和細胞色素 C修飾鉬電極，能在體檢測小鼠腦內的N0含量等。
[0057] 以下為實施例：
[0058] 實施例1
[0059] -種生物電極，如圖1所示，包括絕緣外殼和電極線，所述電極線包括三個工作電 極線、兩個參比電極線和對電極線，所述電極線側表面包覆有阿皮松蠟，環氧樹脂封裝于絕 緣外殼中，所述外殼尖端開口，其尖端開口 口徑為1mm，所述電極線的檢測端通過所述開口 與待測生物樣本接觸，絕緣外殼采用聚丙烯材料。
[0060] 所述生物電極三個工作電極線，分別為第一工作電極線、第二工作電極線和第三 工作電極線；其中：
[0061] 第一工作電極線，用于電流測量，為鉬絲，直徑50 μ m，長度4cm ;
[0062] 第二工作電極線，用于電流測量，為鉬絲，直徑50 μ m，長度4cm ;
[0063] 第三工作電極線，用于電位測量，為金絲，直徑50 μ m，長度4cm。
[0064] 所述兩個參比電極線分別為第一參比電極線、第二參比電極線，為銀絲，直徑 100 μ m，長度4cm ;其中：
[0065] 第一參比電極線，用作電流測量參比電極；
[0066] 第二參比電極線，用作電位測量參比電極。
[0067] 所述對電極線為鉬絲，直徑100 μ m，長度4cm。
[0068] 所述生物電極的制備方法，包括以下步驟：
[0069] (1)電極線絕緣：將阿皮松蠟與有機溶劑二氯甲烷以l:l(w/v)混合，得到絕緣液， 將絕緣液均勻涂覆在所有六根電極線表面，待有機溶劑揮發，制得側表面絕緣的電極線。阿 皮松蠟與有機溶劑二氯甲烷以l:l(w/v)混合溶液，掛漿性能良好，涂布均勻，推薦為優選 絕緣液。
[0070] (2)電極線集成固定：將步驟（1)中獲得的側表面絕緣的電極線同時插入絕緣外 殼中，將樹脂灌入外殼，固化后，將外殼尖端打磨光滑，即獲得所述生物電極。
[0071] 采用環氧樹脂進行電極線集成，其操作步驟為：環氧樹脂與乙二胺以質量比 100:6. 5的比例混合，并進行超聲除泡；將除泡處理的環氧樹脂溶液灌入絕緣外殼中；30°C 干燥過夜。
[0072] 外殼尖端打磨操作如下：將固化后的生物電極尖端分別在1 μ m，0.3 μ m，0.05 μ m 的氧化鋁漿中打磨，并分別在水、稀硝酸、水中超聲5分鐘，得到的生物電極干凈尖端表面 干凈平整。
[0073] 實施例2
[0074] -種生物電極，如圖2所示，包括絕緣外殼和電極線，所述電極線包括三個工作電 極線、兩個參比電極線和對電極線，所述電極線側表面包覆有阿皮松蠟，環氧樹脂封裝于絕 緣外殼中，所述外殼尖端開口，其尖端開口 口徑為1mm，所述電極線的檢測端通過所述開口 與待測生物樣本接觸，絕緣外殼采用聚丙烯材料。
[0075] 所述生物電極三個工作電極線，分別為第一工作電極線、第二工作電極線和第三 工作電極線；其中：
[0076] 第一工作電極線，用于電流測量，獲得過氧化氫濃度，為鉬絲，直徑50 μ m，長度 4cm ；
[0077] 第二工作電極線，用于電流測量，獲得一氧化氮濃度，為鉬絲，其檢測端表面電化 學沉積有鉬顆粒，直徑50 μ m，長度4cm ;
[0078] 第三工作電極線，用于電位測量，獲得pH值，為金絲，其檢測端表面電化學沉積有 氧化銥顆粒，直徑50 μ m，長度4cm。
[0079] 所述兩個參比電極線分別為第一參比電極線、第二參比電極線，為銀絲，直徑 ΙΟΟμπι，長度4cm，其檢測端表面電化學沉積有氯化銀顆粒；其中：
[0080] 第一參比電極線，用作電流測量參比電極；
[0081] 第二參比電極線，用作電位測量參比電極。
[0082] 所述對電極線為鉬絲，直徑100 μ m，長度4cm。
[0083] 所述電極線檢測端表面覆蓋有Nafion膜抗干擾層。
[0084] 利用實施例1中制備的本實施例中修飾生物電極，方法如下：
[0085] (3)電極線檢測端修飾：將步驟實施例1中獲得的生物電極通過電化學的方法，將 電極線表面分別進行電化學修飾，修飾后的電極尖端包覆Nafion膜抗干擾膜。具體操作步 驟如下：
[0086] 1)將所述生物電極在含有2mmol/L氯鉬酸鉀（K2PtCl6)0.5mol/L硫酸（H 2S04)的 溶液中利用循環伏安法在WE2中的敏感區域第二工作電極線檢測端上電沉積鉬微顆粒，用 儀器CHI660A記錄到電化學方法電沉積鉬微粒，如圖3所示。可見隨著循環掃描次數的增 力口，氧化還原電流不斷增大，說明了由于鉬微粒在第二工作電極檢測端上的不斷沉積，工作 電極的有效表面積逐漸增大。該電極可以作為一氧化氮檢測電極。
[0087] 2)將所述生物電極在制備好的氧化銥溶液中，利用0. 6V到0. 7V的電位階躍的方 法在WE3中的敏感區域第三工作電極線檢測端上電沉積氧化銥顆粒。用儀器CHI660A記錄 到電化學方法電沉積氧化銥微粒，如圖4所示。可見隨著脈沖次數的增加，電流不斷增大， 說明了由于氧化銥微粒在第三工作電極線檢測端上的不斷沉積，工作電極的有效表面積逐 漸增大。該電極可以作為pH檢測電極。
[0088] 3)將所述生物電極在0. 5M的KC1溶液中，利用計時電流法法，分別在第一、第二 參比電極檢測端電沉積AgCl，制成Ag/AgCl參比電極。用儀器CHI660A記錄到電沉積AgCl 的過程，如圖5,可以看出隨著時間增加電流逐漸減小，說明AgCl顆粒逐漸沉積在第一、第 二參比電極檢測端。
[0089] 4)上述經電化學修飾的生物電極浸入5%的Nafion溶液中10秒后拿出，空氣中干 燥。得到能同時檢測過氧化氫、一氧化氮和pH的微陣列。其中WE1用來檢測過氧化氫，WE2 用來檢測一氧化氮，WE3用來檢測pH ;WE1和WE2共用CE和RE1，WE3單獨使用RE2。
[0090] 這種電化學傳感微陣列經過掃描顯微鏡100倍放大后，對其進行觀察，如圖2所 示。可以清晰的看到密封在聚丙烯外殼中的3個50 μ m，3個100 μ m的電極檢測端，先分別 密封在絕緣蠟中后密封在環氧樹脂中。其中3個50 μ m電極線檢測端分別是WE1，WE2, WE3， 3個100 μ m電極線檢測端分別是RE1，RE2, CE。
[0091] 所述生物電極，通過導電膠與電化學檢測裝置的導電銅線相連，即組成生物傳感 器，可用于同時在體檢測過氧化氫濃度、一氧化氮濃度和pH值。
[0092] 實施例3
[0093] 利用實施例2中制備的生物電極同時實時的在體檢測植物受到旱脅迫后所產生 的過氧化氫、一氧化氮和pH變化
[0094] A、實施例2中制備的生物電極對H202、N0和pH的電化學響應。
[0095] 為確定WE1和WE2上的最佳工作電壓，我們記錄了在一系列不同的電位下這兩個 電極線對30 uM的H202和N0的響應電流。如圖6,在0?0. 8V范圍內，WE1對H202的響應 電流在0. 6V時達到最大值。但是當電位小于等于0. 4V時，WE1對N0沒有響應。考慮到WE1 的靈敏度和選擇性，〇. 4V被用來做WE1的工作電壓。如圖7,對于WE2,在0?0. 8V范圍內， 響應電流隨著電位的增加而增大；然而WE2在0. 4V時對H202有最大響應電流。因此0. 8V 被選擇最為WE2的工作電壓。
[0096] 我們發現WE1對N0是沒有響應的，所以WE1上的電流只由H202的電化學氧化提 供，可以與H 202的濃度直接對應。WE1測得的電流可以用方程1表達如下：
[0097]

【權利要求】
1. 一種生物電極，其特征在于，包括絕緣外殼和電極線，所述電極線包括多個工作電極 線、一個或多個參比電極線和對電極線，所述電極線側表面包覆有絕緣蠟，樹脂封裝于絕緣 外殼中，所述外殼尖端開口，其尖端開口 口徑在0. 4mm至2mm之間，所述電極線的檢測端通 過所述開口與待測生物樣本接觸。
2. 如權利要求1所述的生物電極，其特征在于，所述生物電極包括三個工作電極線。
3. 如權利要求2所述的生物電極，其特征在于，所述三個工作電極線分別為第一工作 電極線、第二工作電極線和第三工作電極線；其中： 第一工作電極線，用于電流測量，獲得過氧化氫濃度； 第二工作電極線，用于電流測量，獲得一氧化氮濃度； 第三工作電極線，用于電位測量，獲得pH值。
4. 如權利要求3所述的生物電極，其特征在于，所述第一工作電極線為鉬絲；所述第二 工作電極線為鉬絲，其檢測端表面電化學沉積有鉬顆粒；所述第三工作電極線為金絲，其檢 測端表面電化學沉積有氧化銥顆粒。
5. 如權利要求2至4任意一項所述的生物電極，其特征在于，包括兩個參比電極線。
6. 如權利要求5所述的生物電極，其特征在于，所述兩個參比電極線分別為第一參比 電極線、第二參比電極線；其中： 第一參比電極線，用作電流測量參比電極； 第二參比電極線，用作電位測量參比電極。
7. 如權利要求6所述的生物電極，其特征在于，所述兩個參比電極線為銀絲，其檢測端 表面電化學沉積有氯化銀顆粒。
8. 如權利要求1至7任意一項所述的生物電極，其特征在于，所述電極線檢測端表面覆 蓋有抗干擾層，所述抗干擾層優選為Nafion膜、纖維素膜或聚四氟乙烯膜。
9. 如權利要求1至8任意一項所述的生物電極的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 電極線絕緣：將絕緣蠟溶解于易揮發的有機溶劑中，得到絕緣液，將絕緣液均勻涂 覆在電極線側表面，待有機溶劑揮發，制得側表面絕緣的電極線； (2) 電極線集成固定：將步驟（1)中獲得的側表面絕緣的電極線同時插入絕緣外殼中， 將樹脂灌入外殼，固化后，將外殼尖端打磨光滑，即獲得所述生物電極。
10. 如權利要求9所述的制備方法，其特征在于，還包括以下步驟： (3) 電極線檢測端修飾：將步驟（2)中獲得的生物電極通過電化學的方法，將電極線表 面分別進行電化學修飾。
【文檔編號】G01N27/327GK104122312SQ201410366940
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】趙元弟, 陳威, 任瓊瓊 申請人:華中科技大學