本發(fā)明涉及一種可實(shí)現(xiàn)牛β-酪蛋白鑒定及絕對(duì)定量的檢測(cè)試劑盒及測(cè)定方法，屬于檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

β-酪蛋白(β-casein)是酪蛋白中含量?jī)H次于α-酪蛋白的重要組分，它占酪蛋白的22％以上，占奶中總蛋白量25％以上。具有防治骨質(zhì)疏松與佝僂病，促進(jìn)動(dòng)物體外受精，調(diào)節(jié)血壓，治療缺鐵性貧血、缺鎂性神經(jīng)炎等多種生理功效，尤其是其促進(jìn)常量元素(Ca、Mg)與微量元素(Fe、Zn、Cu、Cr、Ni、Co、Mn、Se)高效吸收的功能特性使其具有“礦物質(zhì)載體”的美譽(yù)，它可以和金屬離子，特別是鈣離子結(jié)合形成可溶性復(fù)合物，一方面有效避免了鈣在小腸中性或微堿性環(huán)境中形成沉淀，另一方面還可在沒(méi)有V_D參與的條件下使鈣被腸壁細(xì)胞吸收，是最有效的促鈣吸收因子之一。

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)牛β-酪蛋白的主要方法有ELISA法、凱氏定氮法、雙縮尿法、Folin-酚試劑法、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法、熒光光度法、共振光散射法、電化學(xué)法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法。其中ELISA試劑盒具有檢測(cè)特異性高的優(yōu)點(diǎn)，但由于檢測(cè)方法易污染、背景值高的缺點(diǎn)，常使檢測(cè)靈敏度降低。凱氏定氮法、雙縮尿法、Folin-酚試劑法和考馬斯亮藍(lán)法均是采用分光光度法測(cè)定，與紫外吸收法、熒光光度法、共振光散射法、電化學(xué)法相同，均具有檢測(cè)專屬性、靈敏度和準(zhǔn)確度低的缺點(diǎn)。高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法雖有較高準(zhǔn)確度，但常易受到分子量大小接近的蛋白干擾，使檢測(cè)特異性、靈敏度降低，并且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不適合痕/微量牛β-酪蛋白的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明的目的是提供一種牛β-酪蛋白檢測(cè)試劑盒，給出一種采用本試劑盒可以克服現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的牛β-酪蛋白的鑒定和含量測(cè)定的方法。該試劑盒給出了檢測(cè)牛β-酪蛋白的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和對(duì)含β-酪蛋白樣品進(jìn)行酶解反應(yīng)的反應(yīng)試劑。可將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和/或酶解反應(yīng)產(chǎn)物(或含內(nèi)標(biāo)物質(zhì))注入(超)高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀中進(jìn)行牛β-酪蛋白含量測(cè)定。本發(fā)明提供了一種專屬性強(qiáng)、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便，可用于樣品中牛β-酪蛋白含量測(cè)定的一種檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

技術(shù)方案：

一種可實(shí)現(xiàn)牛β-酪蛋白鑒定及絕對(duì)定量的試劑盒，其特征在于：包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段，肽段序列為：

使用方式如下：

(1)、所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征肽段單獨(dú)使用或者與其他特征肽段配成兩種混合特征肽段使用；

(2)、所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的內(nèi)標(biāo)肽段單獨(dú)使用或者與其他特征肽段配成兩種混合內(nèi)標(biāo)肽段使用；

(3)、所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段配成的混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，單獨(dú)使用或與另外一種混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)同時(shí)使用；

(4)、內(nèi)標(biāo)肽段與其他內(nèi)標(biāo)肽段混合使用。

該試劑盒還包括反應(yīng)試劑：

反應(yīng)試劑，由以下成分組成：

所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配成單劑或雙劑。

所述胰蛋白酶為序列級(jí)胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一種。

所述反應(yīng)試劑配成單劑。

1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

①用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是標(biāo)準(zhǔn)特征肽段，是單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或配成雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用其中的一種或多種；

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 EMPFPK

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

特征肽段1 EMPFPK

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

②用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的內(nèi)標(biāo)肽段是單一內(nèi)標(biāo)肽段，或配成多混合內(nèi)標(biāo)肽段，使用其中的一種或多種；

單一內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

單一內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

③將上述特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段聯(lián)合使用，更有利于牛β-酪蛋白的定量檢測(cè)，是單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，或配成多混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，使用其中的一種或多種；

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 EMPFPK

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III

特征肽段1 EMPFPK

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)IV

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

特征肽段1 EMPFPK

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)

④標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是單劑、或是雙劑，根據(jù)上述方法自由組合或選擇其中的一種或多種。

利用上述的可實(shí)現(xiàn)牛β-酪蛋白鑒定及絕對(duì)定量的試劑盒所實(shí)施的牛β-酪蛋白含量測(cè)定方法，其特征在于：該方法步驟如下：

(1)將待測(cè)樣品加入碳酸氫銨，渦旋，加入二硫蘇糖醇，溫育振蕩，再加入碘乙酰胺，溫育振蕩，放置至室溫后，再加入胰蛋白酶，溫育振蕩，最后加入甲酸終止反應(yīng)；

(2)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和(1)步驟中最終酶解產(chǎn)物分別注入高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀中檢測(cè)或?qū)⒒旌蟽?nèi)標(biāo)物質(zhì)和(1)步驟中含內(nèi)標(biāo)肽段的最終酶解產(chǎn)物分別注入高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀中檢測(cè)，檢測(cè)后通過(guò)m/z和tR進(jìn)行定性，色譜峰峰面積變化測(cè)算出牛β-酪蛋白的絕對(duì)含量；

溫度控制在25～60℃范圍，溫育時(shí)間控制在0.5～12h，振蕩頻率控制在800～2500rmp，渦旋時(shí)間控制在2～10min，室溫控制在18-22℃范圍；

胰蛋白酶與被測(cè)樣品總蛋白量比例控制在1/1到1/100。

所述步驟(2)為：將一種或兩種特征肽段和(1)步驟中最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，或?qū)⒁环N或兩種混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和(1)步驟中含一種或兩種內(nèi)標(biāo)肽段的最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀中檢測(cè)，通過(guò)m/z和t_R進(jìn)行定性，色譜峰峰面積變化測(cè)算出牛β-酪蛋白的含量。

有益效果：本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法能對(duì)樣品中牛β-酪蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確靈敏的定性和絕對(duì)定量，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(由特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段組成)和酶解反應(yīng)試劑；采用(超)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，能快速、精確、靈敏的對(duì)微/痕量的牛β-酪蛋白進(jìn)行絕對(duì)定量。該方法具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度和準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)間在7min之內(nèi)完成。

目前，尚未開(kāi)發(fā)出測(cè)定牛β-酪蛋白含量的特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段和酶解反應(yīng)試劑的試劑盒。本發(fā)明成功的彌補(bǔ)了生物/化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的不足，能準(zhǔn)確地對(duì)含微/痕量牛β-酪蛋白的樣品進(jìn)行定性鑒別和絕對(duì)定量，具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、靈敏度和準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為特征肽段1的二級(jí)質(zhì)譜圖(m/z＝374.6)；

圖2為特征肽段2的二級(jí)質(zhì)譜圖(m/z＝1093.5)；

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的權(quán)利要求不僅限于實(shí)施例。

本發(fā)明包括牛β-酪蛋白檢測(cè)試劑盒和含量測(cè)定方法兩部分。

牛β-酪蛋白檢測(cè)試劑盒由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和反應(yīng)試劑兩部分組成：

1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

①用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是標(biāo)準(zhǔn)特征肽段，可以是單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或配成雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可使用其中的一種或多種。

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 EMPFPK

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

特征肽段1 EMPFPK

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

②用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的內(nèi)標(biāo)肽段(任一或多個(gè)氨基酸上的C、H、O或/和N被同位素標(biāo)記)，可以是單一內(nèi)標(biāo)肽段，或配成多混合內(nèi)標(biāo)肽段，可使用其中的一種或多種。

單一內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

單一內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

③將上述特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段聯(lián)合使用，以下簡(jiǎn)稱“內(nèi)標(biāo)物質(zhì)”，更有利于牛β-酪蛋白的定量檢測(cè)?？梢允菃我粌?nèi)標(biāo)物質(zhì)，或配成多混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，可使用其中的一種或多種。

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 EMPFPK

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III

特征肽段1 EMPFPK

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)IV

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

特征肽段1 EMPFPK

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)

④用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的牛β-酪蛋白檢測(cè)試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以是單劑、也可以是雙劑，可根據(jù)上述方法自由組合或選擇其中的一種或多種。

2)反應(yīng)試劑，用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的反應(yīng)試劑是單劑，包括：

本發(fā)明測(cè)定牛β-酪蛋白含量的步驟如下：

(1)將樣品加入碳酸氫銨，振蕩混勻，加入二硫蘇糖醇，溫育振蕩，再加入碘乙酰胺，溫育振蕩，放置至室溫后，再加入胰蛋白酶，溫育振蕩，最后加入甲酸終止反應(yīng)。

(2)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(或內(nèi)標(biāo)物質(zhì))和最終酶解產(chǎn)物(或含內(nèi)標(biāo)肽段)分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，通過(guò)m/z和t_R進(jìn)行定性鑒別，色譜峰峰面積變化測(cè)算出樣品中牛β-酪蛋白的含量。

通常步驟(1)溫度控制在25～60℃范圍，溫育時(shí)間控制在0.5～12h，振蕩頻率控制在800～2500rmp。胰蛋白酶與被測(cè)樣品總蛋白量比例控制在1/1到1/100，渦旋時(shí)間控制在2～10min。

所述步驟(2)將特征肽段(一種或兩種)和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串三重四極桿質(zhì)譜儀中檢測(cè)，或?qū)⒒旌蟽?nèi)標(biāo)物質(zhì)(一種或兩種)和最終酶解產(chǎn)物(含一種或兩種內(nèi)標(biāo)肽段)分別注入(超)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀中檢測(cè)，通過(guò)m/z和t_R進(jìn)行定性鑒別，色譜峰峰面積變化，采用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法測(cè)算出樣品中牛β-酪蛋白的含量。

實(shí)施例1：

樣品：牛奶

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

(1)樣品的制備：取牛奶0.5ml，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲提取5min，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤腚p混合內(nèi)標(biāo)肽段，加150mmol/L碳酸氫銨溶液900μL，渦旋(800rmp)5min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液400μL，60℃溫育振蕩(1000rmp)50min，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)40min，加入1mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，50℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫后，加入10％甲酸水溶液900μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

(2)將雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀中檢測(cè)。特征肽段1的檢出限為2ng，特征肽段2的檢出限為10ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.13％，回收率為95.3％～99.1％(n＝6)。

實(shí)施例2：

樣品：牛奶酪

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

單一內(nèi)標(biāo)肽段II：

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

(1)樣品的制備：取牛奶酪100mg，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤雰?nèi)標(biāo)肽段2，加入100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(1000rmp)2min，加入150mmol/L二硫蘇糖醇溶液300μL，65℃溫育振蕩(1200rmp)30min，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(1200rmp)40min，加入200μg/ml胰蛋白酶溶液800μL，55℃振蕩(1500rmp)溫育50min，放置至室溫后，加入15％甲酸水溶液300μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

(2)將單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀中檢測(cè)，檢出限為8ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.04％，回收率為95.8％～101.0％(n＝6)。

實(shí)施例3：

樣品：牛奶粉

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

1)樣品的制備：取牛奶粉50mg，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲提取5min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤?00mmol/L碳酸氫銨溶液850μL，渦旋(1000rmp)5min，加入250mmol/L二硫蘇糖醇溶液100μL，60℃溫育振蕩(1200rmp)60min后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)40min，加入500μg/ml胰蛋白酶溶液600μL，35℃溫育振蕩(1500rmp)12h，放置至室溫后，加入10％甲酸水溶液400μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀中檢測(cè)，檢出限為10ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.54％，回收率為96.3％～99.8％(n＝6)。

實(shí)施例4：

樣品：酸牛奶

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 EMPFPK

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

1)樣品的制備：取酸牛奶0.5ml，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲提取5min，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤雰?nèi)標(biāo)肽段1，加入100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(800rmp)10min，加入1000mmol/L二硫蘇糖醇溶液30μL，70℃溫育振蕩(2000rmp)3h，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，25℃溫育振蕩(2000rmp)30min，加入1mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，25℃振蕩(1500rmp)過(guò)夜，加入5％甲酸水溶液500μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀中檢測(cè)，特征肽段1的檢出限為2ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.11％，回收率為96.1％～98.1％(n＝6)。

實(shí)施例5：

樣品：市售牛奶片

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III

特征肽段1 EMPFPK

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

內(nèi)標(biāo)肽段1 EMPFPK

1)樣品的制備：取牛奶片500mg，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲處理1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤?00mmol/L碳酸氫銨溶液900μL，渦旋(1000rmp)6min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液400μL，60℃溫育振蕩(1200rmp)60min溫后，加入1000mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)50min，加入1mg/ml胰蛋白酶溶液400μL，45℃溫育振蕩(1800rmp)3h，放置至室溫后，加入5％甲酸水溶液500μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀中檢測(cè)，特征肽段1的檢出限為2ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.11％，回收率為95.6％～97.9％(n＝6)，特征肽段2作為佐證肽段。

實(shí)施例6：

樣品：牛奶

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)IV

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

特征肽段1 EMPFPK

單一內(nèi)標(biāo)肽段II：

內(nèi)標(biāo)肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

1)樣品的制備：取牛奶0.5ml，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲處理5min，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤雴我粌?nèi)標(biāo)肽段II，加100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(800rmp)5min，加入90mmol/L二硫蘇糖醇溶液400μL，60℃溫育振蕩(1000rmp)50min，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)40min，加入1mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，50℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫后，加入10％甲酸水溶液800μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)IV和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀中檢測(cè)，特征肽段2的檢出限為2ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.11％，回收率為95.6％～97.9％(n＝6)，特征肽段1作為佐證肽段。

以上實(shí)施例中：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征肽段可以單獨(dú)使用也可以與其他特征肽段配成兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用，具體實(shí)施方式不再一一贅述。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段配成的混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，單獨(dú)使用或與另外一種混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)同時(shí)使用，具體實(shí)施方式不再一一贅述。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配成單劑或雙劑，具體不再一一贅述。

所述胰蛋白酶為序列級(jí)胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一種。

總之，上述替換的實(shí)施例在這里不做贅述。

總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒完全可以對(duì)樣品中牛β-酪蛋白進(jìn)行鑒定，并得出所需的絕對(duì)含量測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、特異性好、精密度高、不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。

本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法具有專屬性強(qiáng)、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于樣品中牛β-酪蛋白含量測(cè)定。

蛋白序列

β-酪蛋白

MKVLILACLVALALARELEELNVPGEIVESLSSSEESITRINKKIEKFQSEEQQQTEDELQDKIHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSKVKEAMAPKHKEMPFPKYPVEPFTESQSLTLTDVENLHLPLPLLQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVLSLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVLGPVRGPFPIIV

β-酪蛋白

MKVLILACLVALALARELEELNVPGEIVESLSSSEESITRINKKIEKFQSEEQQQTEDELQDKIHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSKVKEAMAPKHKEMPFPKYPVEPFTESQSLTLTDVENLHLPLPLLQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVLSLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVLGPVRGPFPIIV