本發(fā)明屬于食品、藥品質(zhì)量控制方法領(lǐng)域，具體涉及一種蜂膠和楊樹膠的鑒別方法。

背景技術(shù)：

蜂膠因其具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗癌，抗氧化，抗炎，抗菌和抗真菌活性，受到了人們廣泛的關(guān)注，在醫(yī)療保健等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，然而，蜂膠的生產(chǎn)受到蜂種、采膠方式以及膠源情況的影響，產(chǎn)量相對較低，一直處于供不應(yīng)求狀況。因楊樹芽提取物與楊樹型蜂膠提取物在成分、顏色、氣味上極其相似，近年來用楊樹膠(楊樹芽提取物)冒充蜂膠的現(xiàn)象屢屢發(fā)生。現(xiàn)行蜂膠質(zhì)量控制主要針對類黃酮和多酚兩大類成分，而這兩類成分楊樹芽提取物與楊樹型蜂膠同時存在，這使得區(qū)分蜂膠和楊樹膠變得相當(dāng)因難。因此，建立一種有效區(qū)分蜂膠與楊樹膠的分析方法是控制蜂膠質(zhì)量的關(guān)鍵。

中國發(fā)明專利CN101620208B公開了《一種蜂膠與楊樹膠的鑒別方法》，通過反相高效液相色譜儀分別測定了蜂膠、楊樹膠和摻入不同比例的蜂膠的指紋圖譜，通過指紋圖譜對比，判斷蜂膠的真假，以控制蜂膠質(zhì)量。但是該方法由于受儀器、實驗條件等條件限制，在不同條件下指紋圖譜的重現(xiàn)性很差，給鑒別帶來難度，方法很難普及。

為了克服這一缺陷，中國發(fā)明專利CN101871919B公開了一種《蜂膠與楊樹膠的鑒別方法》，楊樹膠中含有水楊苷，而蜂膠中不含水楊苷，用高效液相色譜測定水楊苷來判斷蜂膠的真假，以此來控制蜂膠質(zhì)量。該方法采用明確的標(biāo)準(zhǔn)品(水楊苷)，即使在不同條件下操作，根據(jù)水楊苷的出峰時間及紫外吸收，也可以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。但是水楊苷易被水解，若不法商販用化學(xué)手段將其破壞，則該方法即失去了原有的作用。

蜂膠中的眾多活性組分都具有抗氧化性，目前尚未有將蜂膠中的抗氧化活性組分作為對照品來鑒別蜂膠和楊樹膠的報道。專利CN102507772A公開了《一種檢測混合物中抗氧化活性化合物的方法》，采用高效液相色譜-自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的在線檢測抗氧化組分的方法，該方法相當(dāng)于在高效液相色譜已有的可見紫外檢測器的基礎(chǔ)上再加上抗氧化活性檢測器，一次色譜分析即可得到混合物中各個化合物的抗氧化活性數(shù)據(jù)，相較于離線抗氧化檢測法簡捷快速，且能避免活性組分的降解。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，提供一種重復(fù)性好，檢測準(zhǔn)確的蜂膠和楊樹膠的鑒別方法。該鑒別方法采用高效液相色譜-自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的在線檢測方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種蜂膠和楊樹膠的鑒別方法，包括如下步驟：

(1)將蜂膠用乙醇在20℃～27℃超聲溶解，隨后離心，過濾后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，得蜂膠提取物；將楊樹膠用乙醇在20℃～27℃超聲溶解，隨后離心，過濾后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，得楊樹膠提取物。

(2)將步驟(1)的蜂膠提取物和楊樹膠提取物分別用有機溶劑配制成濃度為1mg/mL～3mg/mL的蜂膠提取物分析液和1mg/mL～3mg/mL的楊樹膠提取物分析液。

(3)將步驟(2)獲得的蜂膠提取物分析液和楊樹膠提取物分析液分別進(jìn)樣到高效液相色譜-自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的在線檢測系統(tǒng)中：高效液相色譜的檢測條件設(shè)定：流動相A為含乙酸的甲醇，B為含乙酸的水，流速為0.6mL/min～0.9mL/min，柱溫30℃～40℃；沖洗梯度為：0～20min，30％～60％A；20～25min，60％～50％A；25～35min，50％A；34～37min，50％～55％A；37～45min，55％A；45～80min，55％～85％A；80～85min，85％A，檢測波長為280nm，選用shimp-pack VP-ODS色譜柱；加入自由基溶液的流速為0.10mL/min～0.40mL/min，加入該溶液后在特定波長處掃描。

該高效液相色譜-自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的在線檢測系統(tǒng)的工作過程如下：蜂膠提取物分析液或楊樹膠提取物分析液經(jīng)高效液相色譜柱分離后，進(jìn)入UV檢測器在280nm處檢測酚類組分的正峰吸收，然后進(jìn)入一個三通混合器的一個入口，自由基溶液用一個恒流泵輸送進(jìn)入另一個入口，二者在其中混合后，進(jìn)入一個PEEK盤管組成的柱后反應(yīng)系統(tǒng)反應(yīng)一定時間，然后進(jìn)入另一臺UV檢測器，在特定波長處檢測，記錄由于抗氧化活性組分對自由基的清除造成的其在該波長處吸收的降低值(負(fù)峰)。

(4)將蜂膠的色譜圖與楊樹膠的色譜圖進(jìn)行對比，以鑒別蜂膠和楊樹膠。蜂膠的色譜圖具有山奈酚，咖啡酸，高良姜素，短葉松素-3-乙酸酯，咖啡酸苯乙酯和咖啡酸肉桂酯這幾個負(fù)峰，楊樹膠的色譜圖負(fù)峰強度較大的只有高良姜素。

若色譜圖具有咖啡酸、山奈酚、短葉松素-3-乙酸酯、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、咖啡酸肉桂酯這幾個負(fù)峰，則為蜂膠的色譜圖；若色譜圖僅具有高良姜素這個強度較大的負(fù)峰，則為楊樹膠的色譜圖。

作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述步驟(1)中超聲溫度為25℃。

作為優(yōu)選，所述步驟(2)中蜂膠提取物分析液和楊樹膠提取物分析液的濃度均為1.60mg/mL。

作為優(yōu)選，所述步驟(2)中有機溶劑為甲醇或乙醇。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中流動相A中乙酸體積分?jǐn)?shù)為0.05％～0.2％，流動相B中乙酸體積分?jǐn)?shù)為0.05％～0.2％。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中流動相A中乙酸體積分?jǐn)?shù)為0.1％，流動相B中乙酸體積分?jǐn)?shù)為0.1％。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中流動相的流速為0.80mL/min。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中高效液相色譜柱的柱溫為35℃。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中加入自由基溶液的流速為0.20mL/min。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中自由基為ABTS自由基或DPPH自由基。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點：本發(fā)明采用高效液相色譜-自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的在線檢測方法對蜂膠與楊樹膠進(jìn)行鑒別，既可以抗氧化活性組分為對照品，克服指紋圖譜的重現(xiàn)性差的缺陷，又可避免活性組分降解，活性損失，從而導(dǎo)致對照品不穩(wěn)定的缺陷；且該檢測方法高效、直觀，操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好。

附圖說明

圖1為高效液相色譜-自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的在線檢測系統(tǒng)的工作過程示意圖；

圖2為實施例2蜂膠的色譜圖；

圖3為實施例2楊樹膠的色譜圖；

圖4為實施例4蜂膠的色譜圖；

圖5為實施例4楊樹膠的色譜圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

本發(fā)明提供了一種蜂膠和楊樹膠的鑒別方法，該鑒別方法采用高效液相色譜-自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的在線檢測方法，在本發(fā)明的實施例中，自由基溶液優(yōu)選為ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)溶液。

其中ABTS溶液的配制方法為將ABTS和過硫酸鉀分別用水溶解，混合后避光放置一定時間，即得ABTS溶液。

如圖1所示，該高效液相色譜-自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的在線檢測系統(tǒng)的工作過程如下：蜂膠提取物分析液或楊樹膠提取物分析液分別經(jīng)高效液相色譜柱分離后，進(jìn)入UV檢測器在280nm處檢測酚類組分的正峰吸收，然后進(jìn)入一個三通混合器的一個入口，ABTS溶液用一個恒流泵輸送進(jìn)入另一個入口，二者在其中混合后，進(jìn)入一個PEEK盤管組成的柱后反應(yīng)系統(tǒng)反應(yīng)一定時間，然后進(jìn)入另一臺UV檢測器，在734nm處檢測，記錄由于抗氧化活性組分對自由基的清除造成的其在該波長處吸收的降低值(負(fù)峰)。

實施例1-3的蜂膠和楊樹膠均來自山東臨沂，以楊樹為主要膠源植物。

實施例1

蜂膠和楊樹膠的鑒別方法，包括如下步驟：

(1)將0.2g蜂膠用乙醇在20℃超聲溶解，隨后離心，過濾后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，得蜂膠提取物；將0.2g楊樹膠用乙醇在20℃超聲溶解，隨后離心，過濾后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，得楊樹膠提取物。

(2)將步驟(1)的蜂膠提取物和楊樹膠提取物分別用甲醇配制成濃度為1mg/mL的蜂膠提取物分析液和1mg/mL的楊樹膠提取物分析液。

(3)將步驟(2)獲得的蜂膠提取物分析液和楊樹膠提取物分析液分別進(jìn)樣20uL到高效液相色譜-自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的在線檢測系統(tǒng)中，高效液相色譜的檢測條件設(shè)定：流動相A為含0.05％乙酸的甲醇，B為含0.05％乙酸的水，流速為0.6mL/min，柱溫30℃；沖洗梯度為：0～20min，30％～60％A；20～25min，60％～50％A；25～35min，50％A；34～37min，50％～55％A；37～45min，55％A；45～80min，55％～85％A；80～85min，85％A；檢測波長為280nm，選用shimp-pack VP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)色譜柱；加入ABTS溶液的流速為0.10mL/min，加入該溶液后的檢測波長為734nm。

(4)將蜂膠的色譜圖與楊樹膠的色譜圖進(jìn)行對比，以鑒別蜂膠和楊樹膠。化學(xué)組分被色譜柱分離后在280nm處被檢測得到正峰，具有抗氧化活性的組分在柱后與引入的ABTS自由基溶液反應(yīng)，在734nm處被檢測得到負(fù)峰。蜂膠的色譜圖具有咖啡酸、山奈酚、短葉松素-3-乙酸酯、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、咖啡酸肉桂酯這幾個負(fù)峰；楊樹膠的色譜圖僅具有高良姜素這個強度較大的負(fù)峰，以此來鑒別蜂膠和楊樹膠。

實施例2

鑒別蜂膠和楊樹膠的方法，包括如下步驟：

(1)將0.2g蜂膠用乙醇在25℃超聲溶解，隨后離心，過濾后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，得蜂膠提取物；將0.2g楊樹膠用乙醇在25℃超聲溶解，隨后離心，過濾后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，得楊樹膠提取物。

(2)將步驟(1)的蜂膠提取物和楊樹膠提取物分別用甲醇配制成濃度為1.6mg/mL的蜂膠提取物分析液和1.6mg/mL的楊樹膠提取物分析液。

(3)將步驟(2)獲得的蜂膠提取物分析液和楊樹膠提取物分析液分別進(jìn)樣20uL到高效液相色譜-自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的在線檢測系統(tǒng)中，其中HPLC的檢測條件設(shè)定：流動相A為含0.1％乙酸的甲醇，B為含0.1％乙酸的水，流速為0.8mL/min，柱溫35℃；沖洗梯度為：0～20min，30％～60％A；20～25min，60％～50％A；25～35min，50％A；34～37min，50％～55％A；37～45min，55％A；45～80min，55％～85％A；80～85min，85％A，檢測波長為280nm，選用shimp-pack VP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)色譜柱；加入ABTS溶液的流速為0.20mL/min，加入該溶液后的檢測波長為734nm。

(4)將蜂膠的色譜圖與楊樹膠的色譜圖進(jìn)行對比，以鑒別蜂膠和楊樹膠。如圖2所示，色譜圖具有咖啡酸(1’)、山奈酚(9’)、短葉松素-3-乙酸酯(10’)、咖啡酸苯乙酯(13’)、高良姜素(14’)、咖啡酸肉桂酯(17’)這幾個負(fù)峰，為蜂膠的色譜圖；如圖3所示，色譜圖僅具有高良姜素(14’)這個強度較大的負(fù)峰，為楊樹膠的色譜圖，以此來鑒別蜂膠和楊樹膠。

實施例3

蜂膠和楊樹膠的鑒別方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將0.2g蜂膠用乙醇在27℃超聲溶解，隨后離心，過濾后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，得蜂膠提取物；將0.2g楊樹膠用乙醇在27℃超聲溶解，隨后離心，過濾后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，得楊樹膠提取物。

(2)將步驟(1)的蜂膠提取物和楊樹膠提取物分別用甲醇配制成濃度為3mg/mL的蜂膠提取物分析液和3mg/mL的楊樹膠提取物分析液。

(3)將步驟(2)獲得的蜂膠提取物分析液和楊樹膠提取物分析液分別進(jìn)樣20uL到高效液相色譜-自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的在線檢測系統(tǒng)中：高效液相色譜的檢測條件設(shè)定：流動相A為含0.2％乙酸的甲醇，B為含0.2％乙酸的水，流速為0.9mL/min，柱溫40℃；沖洗梯度為：0～20min，30％～60％A；20～25min，60％～50％A；25～35min，50％A；34～37min，50％～55％A；37～45min，55％A；45～80min，55％～85％A；80～85min，85％A；檢測波長為280nm，選用shimp-pack VP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)色譜柱；加入ABTS溶液的流速為0.40mL/min，加入該溶液后的檢測波長為734nm。

(4)將蜂膠的色譜圖與楊樹膠的色譜圖進(jìn)行對比，以鑒別蜂膠和楊樹膠。蜂膠的色譜圖具有咖啡酸、山奈酚、短葉松素-3-乙酸酯、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、咖啡酸肉桂酯這幾個負(fù)峰；楊樹膠的色譜圖僅具有高良姜素這個強度較大的負(fù)峰，以此來鑒別蜂膠和楊樹膠。

由實施例1-3的檢測結(jié)果得到，實施例2的實驗參數(shù)最優(yōu)。因此以實施例2的實驗條件對以楊樹為主要膠源植物，選自湖南衡陽的蜂膠和楊樹膠進(jìn)行了測試。

實施例4

鑒別蜂膠和楊樹膠的方法，包括如下步驟：

(1)將0.2g蜂膠用乙醇在25℃超聲溶解，隨后離心，過濾后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，得蜂膠提取物；將0.2g楊樹膠用乙醇在25℃超聲溶解，隨后離心，過濾后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，得楊樹膠提取物。

(2)將步驟(1)的蜂膠提取物和楊樹膠提取物分別用甲醇配制成濃度為1.6mg/mL的蜂膠提取物分析液和1.6mg/mL的楊樹膠提取物分析液。

(3)將步驟(2)獲得的蜂膠提取物分析液和楊樹膠提取物分析液分別進(jìn)樣20uL到高效液相色譜-自由基檢測系統(tǒng)聯(lián)用的在線檢測系統(tǒng)中，其中HPLC的檢測條件設(shè)定：流動相A為含0.1％乙酸的甲醇，B為含0.1％乙酸的水，流速為0.8mL/min，柱溫35℃；沖洗梯度為：0～20min，30％～60％A；20～25min，60％～50％A；25～35min，50％A；34～37min，50％～55％A；37～45min，55％A；45～80min，55％～85％A；80～85min，85％A，檢測波長為280nm，選用shimp-pack VP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)色譜柱；加入ABTS溶液的流速為0.20mL/min，加入該溶液后的檢測波長為734nm。

(4)將蜂膠的色譜圖與楊樹膠的色譜圖進(jìn)行對比，以鑒別蜂膠和楊樹膠。如圖4所示，色譜圖具有咖啡酸(1’)、山奈酚(9’)、短葉松素-3-乙酸酯(10’)、咖啡酸苯乙酯(13’)、高良姜素(14’)、咖啡酸肉桂酯(17’)這幾個負(fù)峰，為蜂膠的色譜圖；如圖5所示，色譜圖僅具有高良姜素(14’)這個強度較大的負(fù)峰，為楊樹膠的色譜圖，以此來鑒別蜂膠和楊樹膠。