技術領域

本發明涉及醫學檢驗領域，具體是涉及一種比色熒光雙信號納米球的制備及其在免疫層析定量檢測中的應用。

背景技術：

免疫層析法快速檢測因簡單、快速引起人們的廣泛關注。免疫層析法在免疫分析、食品安全、環境監測等領域得到了廣泛的應用。它通常是以硝酸纖維素膜作為層析膜，在毛細作用下使樣品溶液在層析膜上流動，樣品中的目標物會與層析膜上檢測區域的待測物的受體（抗體或者抗原）發生特異性的免疫反應。傳統的免疫層析法利用膠體金作為標記物，可使檢測區域聚集納米金從而顯色，通過判斷膠體金的比色信號來進行定性或者半定量檢測。當檢測低濃度的目標物時，膠體金的信號較弱導致誤判結果，因此傳統的膠體金層析法靈敏度較低。而且檢測時基于納米金的顏色進行定性分析，存在不能定量的缺點，限制了免疫層析的應用范圍。

近年來，出現了很多替代膠體金的熒光標記材料，如染料、上轉換材料、量子點等熒光材料。熒光材料因具有更高的信噪比，而且熒光強度在一定范圍內與材料的濃度呈線性，被廣泛用于生物檢測領域。它們很好的解決了金標免疫層析系統中靈敏度低、無法定量檢測的問題。然而基于熒光信號的檢測需要紫外光激發，對于醫療條件差的地區或者是家庭使用則十分不方便，從而應用范圍在很大程度上受到了限制。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種比色熒光雙信號納米球的制備方法，以及該比色熒光雙信號納米球在免疫層析檢測中的應用。使用本發明的比色熒光雙信號納米球能夠在實現待檢目標物可視化檢測的同時實現定量檢測。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種比色熒光雙信號納米球的制備方法，包括如下步驟：

（1）以表面富含羧基官能團的納米球為主體，通過超聲溶脹的方法將疏水的熒光量子點包埋到納米球的內部構建表面富含羧基的熒光納米球；

或者通過層層組裝法將聚乙烯亞胺和疏水的熒光量子點依次組裝到納米球的表面，然后在表面包裹硅殼得到氨基的熒光納米球，最后通過與丁二酸酐反應得到表面富含羧基的熒光納米球。

所述的熒光納米球的粒徑為100～500 nm。

（2）用組裝法將納米金組裝到熒光納米球表面得到同時具備比色信號和熒光信號的比色熒光雙信號納米球。

步驟（1）中所述的納米球包括聚合物納米球、硅球，如聚苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米球；所述的量子點包括CdSe、CdS、CdTe等各種可見波段量子產率較高的量子點。

步驟（2）中所述的納米金的粒徑優選為13～40 nm；熒光納米球與納米金的摩爾比優選為1:20。

一種比色熒光雙信號納米球，通過上述方法制備得到。

所述的比色熒光雙信號納米球標記抗體、抗原或者其他特異性結合物質后，可用于免疫層析檢測。

一種基于比色熒光雙信號納米球的免疫層析試紙條，其組裝示意圖如圖1所示，包括樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水紙和底板，底板上順次搭接樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙。所述的硝酸纖維素膜上設定有定量線和質控線，定量線固定有能與待檢目標物結合的抗體、抗原或者其他特異性結合物質；質控線固定有比色熒光雙信號納米球上所標記的物質（抗體、抗原或者其他特異性結合物質）的抗體。

一種使用比色熒光雙信號納米球的免疫層析檢測方法，包括如下步驟：

（1）用化學交聯劑將待檢目標物對應的抗體或者識別分子偶聯至比色熒光雙信號納米球表面，得到免疫雙信號納米球。

（2）將待檢樣品、免疫雙信號納米球和層析液混勻，混合液體滴加到上述免疫層析試紙條的樣品墊上，靜置15～20分鐘。

（3）對檢測結果進行定性或定量判斷。

步驟（1）中偶聯的方法優選為EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽）/NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）活化法，偶聯后得到的免疫雙信號納米球再用BSA（牛血清白蛋白）進行封閉。

步驟（2）中所述的層析液優選為包含1%（質量百分比濃度）牛血清白蛋白和1%（質量百分比濃度）吐溫-20的pH 7.4的PBS。

步驟（3）中定性判斷的方法為：層析結束后，通過目視觀察納米金的比色信號，或者在紫外燈下觀察納米球的熒光信號進行定性檢測；定量判斷的方法為：層析結束后，通過熒光顯微鏡對試紙條進行檢測，獲取定量線的熒光信號強度，并根據標準曲線實現對待檢目標物的定量檢測。

本發明充分利用量子點的超強的熒光信號及納米金優異的比色信號制備比色熒光雙信號納米球，將其結合免疫層析技術，實現目標物同時目視定性和熒光定量檢測。該雙信號納米球具有信號放大作用，通過將大量量子點包埋于共聚納米球的內部放大了量子點的熒光信號；同時，一顆納米球表面組裝有多顆納米金，實現了納米金比色信號的放大。本發明的主要優點如下：

（1）本發明以苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米球為主體，通過包埋法將量子點包埋到其內部，然后將納米金組裝到其表面，從而構建比色熒光雙信號納米球。同時具備比色信號和熒光信號。

（2）本發明采用量子點作為熒光信號放大的指示物質包埋于共聚納米球的內部，相較于有機熒光染料，具有發光強度高、激發光譜寬、發射光譜窄等優勢。而且熒光納米球放大了量子點的熒光信號。

（3）本發明只需改變量子點的粒徑或者種類，即可得到不同發射波長的熒光，得到不同類型的比色熒光雙信號納米球，可通過熒光信號實現多組分的定性、定量檢測。方法簡單快速，靈敏度高。

本發明既可目視定性分析又可實現對目標物的定量檢測。本發明方法與傳統膠體金免疫層析法相比，具有靈敏度高、重現性好、可準確定量等優勢。

附圖說明

圖1是免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為硝酸纖維素膜，3為吸水紙，4為定量線，5為質控線，6為底板。

圖2是比色熒光雙信號納米球的透射電鏡、掃描電鏡和紫外吸收光譜圖，其中A為透射電鏡圖，B為掃描電鏡圖，C為紫外吸收光譜圖。

圖3是比色熒光雙信號納米球的熒光顯微鏡圖。

圖4是可視化檢測埃博拉病毒表面糖蛋白的結果圖，上層為直接目視圖、下層為紫外燈下目視圖。

圖5是定量檢測埃博拉病毒表面糖蛋白的結果圖。

具體實施方式

以下實施例僅用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。

實施例1 埃博拉病毒表面糖蛋白的定量檢測

下面以埃博拉病毒表面糖蛋白為例，對比色熒光雙信號納米球免疫夾心法定量檢測的方法進行詳細的說明。在本實施例中，所用的免疫層析試紙條僅設置了定量線。

一、方法

1. 比色熒光雙信號納米球的制備

以表面羧基化的苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米球（Pst-AAm-COOH）為載體，通過超聲溶脹的方法，利用疏水相互作用，將疏水的量子點包埋到納米球的內部。具體步驟如下：首先通過無皂乳液聚合法制備苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米球（100 mL超純水中加熱通入氮氣除氧后依次加入10 mL苯乙烯、2.5 g丙烯酰胺、0.25 g過硫酸鉀，70℃，700 rpm攪拌反應12 h）；然后將苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米球與水合肼反應（體積比為4:1，55℃反應12 h），得到表面有酰胺基的共聚納米球；最后將表面有酰胺基的共聚納米球與丁二酸酐在 pH為4的條件下反應（質量比為1:1）12 h，最終得到表面含有豐富羧基粒徑約為260 nm的苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米球（Pst-AAm-COOH）。將0.5 mg發射波長為608nm的疏水的量子點（CdSe/ZnS QDs）分散于氯仿/正丁醇（體積比為95:5），然后將量子點的溶液加入到20 mg共聚納米球中，超聲30 min后用己烷離心洗滌（6000 rpm×1 min）除去多余的量子點，然后用乙醇洗滌（12000 rpm×5 min）三次，最后用1 mL超純水超聲分散，從而得到表面帶有羧基、粒徑約為270 nm的紅色熒光納米球（RNs）。

利用檸檬酸鈉還原法制備粒徑為20 nm的納米金。將20 nm的納米金與紅色熒光納米球以20:1的摩爾比混合孵育30 min后用超純水離心洗滌（12000 rpm×5 min）三次，最后將其用1 mL超純水分散，得到比色熒光雙信號納米球。

2. 免疫比色熒光雙信號納米球的制備

取大約2 mg比色熒光雙信號納米球分散到300 μL 0.01 M pH 6.8的PBS中，并加入100 μL 50 mM EDC/NHS，活化20 min，用0.01 M pH 7.2的PBS離心洗滌一次，然后分散到400 μL 0.01 M pH 7.2的PBS中，加入10 μg的埃博拉病毒表面糖蛋白的抗體，反應4 h，用0.01 M pH 7.2的PBS離心洗滌五次，即得到了對糖蛋白靶向的免疫比色熒光雙信號納米球。最后用BSA封閉后置于4°C冰箱中待用。

3. 埃博拉病毒表面糖蛋白樣品的檢測

將4 μL免疫比色熒光雙信號納米球（1.89 nM）、1 μL不同濃度的埃博拉病毒表面糖蛋白樣品與45 μL層析液（包含1% BSA和1%吐溫-20的0.01 M 7.4 PBS）混合均勻，得到一系列埃博拉病毒表面糖蛋白終濃度為20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL、400 ng/mL、1000 ng/mL的混合溶液。將混合液體加到免疫層析試紙條的樣品墊上。20 min后用倒置熒光顯微鏡拍定量線區域的圖片，并測定定量線的平均熒光強度。

所用免疫層析試紙條包括品墊、硝酸纖維素膜、吸水紙和底板，硝酸纖維素膜上設定有定量線，定量線固定有埃博拉病毒表面糖蛋白的抗體；底板上順次搭接樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙。

4. 定量檢測曲線

將不同濃度的埃博拉病毒表面糖蛋白，按照3描述的步驟進行檢測，并測定每個樣品檢測區域（定量線）的平均熒光強度，繪制埃博拉病毒表面糖蛋白濃度與熒光強度關系曲線并擬合。

二、結果

1. 比色熒光雙信號納米球的表征

透射電鏡可以看到量子點很好地分散在共聚納米球里，而納米金則在納米球的表面（圖2A）。掃描電鏡則可以更加清楚地看到納米金在共聚納米球表面（圖2B）。而且紫外吸收光譜（圖2C）可以看到，該比色熒光雙信號納米球具有納米金的特征吸收峰，而且峰位置由520nm處紅移至527 nm處。這是由于納米金固定到納米球表面后，納米金之間的距離減小。

2. 比色熒光雙信號納米球的熒光信號

由顯微鏡圖（圖3）可以看出，比色熒光雙信號納米球表現出很強的熒光。

3. 埃博拉病毒表面糖蛋白的檢測

檢測埃博拉病毒表面糖蛋白的可視化結果見圖4所示。在沒有任何儀器的條件下，目測可以看到40 ng/mL的糖蛋白的信號；在手持式紫外燈照射下，可以看到20 ng/mL的糖蛋白的信號。通過測量檢測區的熒光強度，建立了埃博拉病毒表面糖蛋白檢測的定量關系。如圖5所示，埃博拉病毒表面糖蛋白濃度在20～1000 ng/mL濃度范圍內該方法呈現很好的定量關系（R²=0.995）最低檢出限為3.3 ng/mL。

通過以上各項檢測，證明本發明方法可以應用于埃博拉病毒表面糖蛋白的超靈敏定量的檢測，操作簡單快速，靈敏度高。直接目視檢測限可達到40 ng/mL，紫外燈下目視可達20 ng/mL；定量檢出限低至3.3 ng/mL，且批內差與批間差精密度均較好，相關系數R²>0.99，對埃博拉病毒的快速檢測具有一定的意義。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。