本發明涉及光學成像技術領域，特別涉及離軸光束焦面共軛的熒光成像光切片顯微術。

背景技術：

廣泛應用于生物醫學、材料學等領域的傳統寬場熒光顯微鏡，由于具有較大的景深，較難獲取樣品內部三維結構的顯微圖像。光切片技術，能夠獲取樣品內部結構的三維顯微圖像，進一步擴展了顯微鏡的應用范圍。目前常用于光切片技術的熒光顯微術主要有：掃描共焦熒光顯微術[j.pawley,ed.handbookofbiologicalconfocalmicroscopy,3rdedn.(springer,2006)]、結構光照明熒光顯微術[r.heintzmann&p.a.benedetti,“high-resolutionimagereconstructioninfluorescencemicroscopywithpatternedexcitation,”appl.opt.45,5037-5045(2006)]、選擇平面照明熒光顯微術[j.huisken,j.swoger,f.delbene,j.wittbrodt,ande.h.k.stelzer,“opticalsectioningdeepinsideliveembryosbyselectiveplaneilluminationmicroscopy,”science305,1007-1009(2004)]。這些技術各有其優點和局限。

掃描共焦熒光顯微術利用照明針孔和探測針孔的共軛物象關系，進行共焦的點照明和點探測成像，也就是使得來自照明針孔發射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點被激發的熒光成像在探測針孔上，該點以外發射的任何熒光均被探測針孔阻擋，通過逐點掃描焦面處的樣品層，從而獲得比傳統熒光顯微術更高的軸向分辨率，實現光切片成像。顯然，逐點掃描的成像方式耗時，對動態物體成像非常不利，因此，對生物活體的光切片成像有局限性。結構光照明熒光顯微術采用結構光照明，照明裝置相對復雜。選擇平面照明熒光顯微術，成像速度較快，但軸向分辨率有限。

技術實現要素：

本發明的第一個目的在于克服現有技術的不足，提供一種基于離軸光束焦面共軛的熒光成像光切片方法，可以提高光切片成像速度。

本發明的另一個目的在于提供一種實現上述方法的裝置。

本發明第一個目的通過以下技術方案實現：

一種基于離軸光束焦面共軛的熒光成像光切片方法，所述方法包括下列步驟：

一個大數值孔徑組合物鏡和一個管鏡構成無限遠校正光學系統，組合物鏡的物方焦面與管鏡的像方焦面形成一對物象共軛面，相機的光敏面設置在管鏡的像方焦面；一個光欄設置在組合物鏡的像方焦平面，阻擋來自樣品的近似平行組合物鏡光軸的近軸熒光光束進行成像，允許與組合物鏡光軸有夾角的離軸熒光光束進行成像；樣品內的一個層面和組合物鏡物方焦面重合，激發光源照明樣品，樣品發射出的熒光被無限遠校正光學系統成像，相機拍攝經濾色器過濾后的熒光圖像，獲得樣品內一個層面的光切片；承載樣品的樣品臺在平移器的控制下，帶動樣品在組合物鏡光軸方向移動，使得樣品內不同的層面和組合物鏡物方焦面重合，相機拍攝圖像，獲得樣品內多個層面的光切片；其中，所述大數值孔徑組合物鏡的數值孔na的范圍：0.75≤na＜2.0。

進一步地，所述物鏡和兩個中繼透鏡構成一個組合物鏡，兩個中繼透鏡設置在物鏡和管鏡之間，第一中繼透鏡的物方焦面和物鏡的像方焦平面重合，第二中繼透鏡的物方焦平面和第一中繼透鏡的像方焦平面重合，第二中繼透鏡的像方焦平面為組合物鏡的像方焦平面。

進一步地，所述光欄為一圓形，中央有一個不透光圓片，圓片外的環帶可透過熒光進行成像。

進一步地，所述光欄為一個可繞光軸旋轉的圓形光欄，中央有一個不透光圓片，圓片外的環帶中的部分區域可透過熒光進行成像；一個旋轉器帶動光欄繞光軸旋轉，每轉動一個相同的角度，相機拍攝一幅圖像，旋轉一周獲得m幅圖像：i1(x,y)、i2(x,y)、…、im(x,y)，利用消除離焦像算法，對這m幅圖像進行消除離焦像處理，獲得樣品內一個層面的光切片圖像i(x,y)；其中(x,y)為相機光敏面的像素點坐標。

進一步地，所述消除離焦像算法為將所有圖像進行線性疊加：i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+im(x,y)。

本發明另一個目的通過以下技術方案實現：

一種基于離軸光束焦面共軛的熒光成像光切片裝置，所述裝置包括：組合物鏡、光欄7、管鏡2和相機3構成的成像光路，以及激發光源9的激發光路，其中，所述組合物鏡由物鏡1、第一中繼透鏡5、第二中繼透鏡6構成，所述成像光路用于樣品熒光成像，所述激發光路用于激發樣品發出熒光；激發光源9發出的光束照明樣品臺4上的樣品，被激發出的樣品熒光依次經物鏡1、第一中繼透鏡5、第二中繼透鏡6、光欄7、濾色器11、管鏡2成像到管鏡像方焦面，設置在管鏡像方焦面的相機3拍攝圖像；旋轉器12驅動光欄7旋轉，每旋轉一個角度，相機3拍攝一幅圖像；樣品臺4在平移器8的控制下，帶動樣品在物鏡1光軸方向移動，使得樣品內的不同層面和物鏡1物方焦面重合，相機3拍攝圖像；計算機13控制旋轉器12、平移器8和相機3之間的聯動。

進一步地，所述光欄7，中央有一個不透光圓片，圓片外的環帶可透過熒光進行成像，不透光圓片的半徑r的范圍為：其中fo′為物鏡1的像方焦距、f1為第一中繼透鏡5的焦距、f2為第二中繼透鏡6的焦距。

進一步地，所述光欄7可繞光軸旋轉圓形光欄，中央有一個不透光圓片，不透光圓片的半徑r的范圍為：不透光圓片的外環帶中只有部分區域可透光；透光區域為一透光扇形環，扇形環的圓心角α的范圍1°≤α≤90°；透光區域或者為一個偏心透光圓孔，圓孔中心偏離圓形光欄中心的距離d為透光圓孔的半徑rt為其中rw為圓形光欄半徑。

進一步地，所述激發光源9的激發光路，激發光源9發出的光束經一個二向色鏡10進入物鏡1，再從物鏡1出射照明樣品臺4上的樣品，二向色鏡10置于物鏡1和第一中繼透鏡之間；或者激發光源9發出的光束不經物鏡1直接照明樣品臺4上的樣品。

進一步地，所述激發光源9發出的光束形成均勻光場照明樣品或形成結構光場照明樣品。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：

(1)掃描共焦熒光顯微術是點對點的共焦成像，而本發明是面對面的共焦成像，成像速度更快，方便用于動態樣品成像。

(2)相對結構光照明熒光顯微術，本發明照明裝置簡單。

(3)操作簡單、方便實用。

附圖說明

圖1是焦面處的樣品層發出的離軸熒光光束，在管鏡像方焦面的成像情況；

圖2是焦面內的離焦樣品層發出的離軸熒光光束，在管鏡像方焦面的成像情況；

圖3是焦面外的離焦樣品層發出的離軸熒光光束，在管鏡像方焦面的成像情況；

圖4是實施例一中的裝置示意圖；

圖5是實施例二中的裝置示意圖；

圖6是一種旋轉對稱圓形光欄示意圖，黑色表示不透光區域、白色表示透光區域；

圖7是一種非旋轉對稱扇形環光欄示意圖，黑色表示不透光區域、白色表示透光區域；

圖8是一種非旋轉對稱偏心圓孔光欄示意圖，黑色表示不透光區域、白色表示透光區域；

圖中：1-物鏡，2-管鏡，3-相機，4-樣品臺，5-第一中繼透鏡，6-第二中繼透鏡，7-光欄，8-平移器，9-激發光源，10-二向色鏡，11-濾色器，12-旋轉器，13-計算機。

具體實施方式

為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

傳統熒光顯微鏡都是利用包含近軸的光束進行成像，軸向可分辨距離一般大于500納米。為了提高顯微成像軸向分辨率，獲取光切片，本發明提出采用由物鏡和管鏡等構成的無限遠校正光路系統，利用大傾角偏離光軸的熒光光束進行顯微成像，阻擋近軸光束進行成像，偏離光路系統光軸的光束稱為離軸光束，近似平行光軸方向的光束稱為近軸光束，光束和光軸的夾角稱為傾角。相機光敏面置于管鏡像方焦面，由于物鏡的物方焦面和管鏡的像方焦面是物象共軛關系，因此獲取的圖像是和物鏡物方焦面重合的樣品層發出的熒光圖像。根據成像理論，圖1、圖2、圖3分別給出了樣品層處于物鏡焦面、焦面內側、焦面外側時，在管鏡像方焦面的熒光成像情況，圖中，相機的光敏面和管鏡的像方焦面重合。圖1表示焦面處的樣品層發出的離軸熒光光束，在管鏡像方焦面的成像情況；圖2表示焦面內的離焦樣品層發出的離軸熒光光束，在管鏡像方焦面的成像情況；圖3表示焦面外的離焦樣品層發出的離軸熒光光束，在管鏡像方焦面的成像情況。圖1顯示，對焦面處的樣品層，盡管光欄阻擋了近軸熒光光束的成像，但離軸熒光光束仍然在管鏡像方焦面形成一清晰的像，焦面處的樣品層面上的一個物點發出的不同方向的離軸熒光光束經光學系統會聚到管鏡像方焦面同一點；圖2和圖3顯示，不論在焦面內側還是在焦面外側的離焦樣品層，其清晰像面不在管鏡像方焦面，相機在管鏡像方焦面拍攝到的像是模糊的，離焦樣品層面上的一個物點發出的不同方向的離軸熒光光束經光學系統會聚到管鏡像方焦面不是同一點，是相互錯開的，離軸熒光光束的方向、樣品物點的離焦量、顯微放大倍數(或管鏡和物鏡的焦距比)都會影響相互錯開的程度：熒光光束離軸傾角越大，錯開程度越大；物點的離焦距離越大，錯開程度也越大；放大倍數越大，錯開程度也越大。錯開程度越大，離焦樣品層面在管鏡像方焦面的像就越模糊。根據這一成像特性，本發明在物鏡或組合物鏡的像方焦面處設置一圓形光欄，光欄中央有一個不透光圓片，圓片外的環帶可透過熒光進行成像,這樣就限制了近軸熒光光束進行成像，使得離焦樣品層在管鏡像方焦面處的圖像將變得更加模糊甚至消失，圖像的軸向分辨率將得到提高，如果光欄為一旋轉對稱光欄，相機直接拍攝該圖像，從而獲得光切片；如果設置的圓形光欄是一個非旋轉對稱的光欄，例如中央有一個不透光圓片，其透光區域不是一個圓形環帶，只有圓片外環帶中的部分區域可透光，就構成一個非旋轉對稱的光欄，使得參與成像的離軸熒光光束的方向也是非旋轉對稱，通過一旋轉器驅動光欄繞光軸旋轉，每旋轉一個角度拍攝一幅圖像，旋轉一周將拍攝得到多幅圖像，由于同一離焦樣品層的模糊像在這多幅圖像中的位置是不同的，而焦面樣品層的清晰像在這多幅圖像中的位置卻是相同的，根據這一特性，可以利用這多幅圖像進行消除離焦像處理，重建得到一幅焦面樣品層的光切片圖像。消除離焦像的處理算法，可優選：將這多幅圖像進行線性疊加得到一幅圖像。激發光源發出的光束可以生成均勻光場照明樣品，或者生成結構光場照明樣品。激發光源生成結構光場照明樣品時，需利用圖像重建算法，獲得光切片圖像。

實施例一

如附圖4所示，本實施例公開了一種基于離軸光束焦面共軛的熒光成像光切片裝置，依次由物鏡1、第一中繼透鏡5、第二中繼透鏡6、光欄7、濾色器11、管鏡2和相機3構成無限遠校正成像光路；第一中繼透鏡5的物方焦面和物鏡1的像方焦平面重合，第二中繼透鏡6的物方焦平面和第一中繼透鏡5的像方焦平面重合，物鏡1、第一中繼透鏡5、第二中繼透鏡6構成組合物鏡；激發光源9、二向色鏡10、物鏡1構成激發光路。激發光源9發出的光束經二向色鏡10進入到物鏡1，再從物鏡1出射照明樣品臺4上的樣品，樣品被激發產生熒光；樣品發出的熒光依次經物鏡1、第一中繼透鏡5、第二中繼透鏡6、光欄7、濾色器11和管鏡2，最后成像到管鏡2像方焦面，相機3的光敏面設置在管鏡2的像方焦面。當光欄7選用圖6所示旋轉對稱光欄，相機3拍攝圖像，獲得樣品內一個層面的光切片；當光欄7選用圖7或圖8所示的非旋轉對稱光欄，旋轉器12驅動光欄7旋轉，每旋轉一個角度，相機3拍攝一幅圖像，旋轉一周拍攝到m幅圖像：i1(x,y)、i2(x,y)、…、im(x,y)，利用消除離焦像公式i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+im(x,y)，對這m幅圖像進行消除離焦像處理，獲得樣品內一個層面的光切片i(x,y)。樣品臺4在平移器8的控制下，帶動樣品在物鏡1光軸方向移動，使得樣品內不同的層面和物鏡1物方焦面重合，相機3拍攝圖像，獲得樣品內多個層面的光切片；計算機13控制旋轉器12、平移器8和相機3之間的聯動。

實施例二

如附圖5所示，本實施例公開了另一種基于離軸光束焦面共軛的熒光成像光切片裝置，依次由物鏡1、第一中繼透鏡5、第二中繼透鏡6、光欄7、濾色器11、管鏡2和相機3構成無限遠校正成像光路；第一中繼透鏡5的物方焦面和物鏡1的像方焦平面重合，第二中繼透鏡6的物方焦平面和第一中繼透鏡5的像方焦平面重合，物鏡1、第一中繼透鏡5、第二中繼透鏡6構成組合物鏡；激發光源9發出的光束直接照明樣品臺4上的樣品，樣品被激發產生熒光；樣品發出的熒光依次經物鏡1、第一中繼透鏡5、第二中繼透鏡6、光欄7、濾色器11和管鏡2，最后成像到管鏡2像方焦面，相機3的光敏面設置在管鏡2的像方焦面。當光欄7選用圖6所示旋轉對稱光欄，相機3拍攝圖像，獲得樣品內一個層面的光切片；當光欄7選用圖7或圖8所示的非旋轉對稱光欄，旋轉器12驅動光欄7旋轉，每旋轉一個角度，相機3拍攝一幅圖像，旋轉一周拍攝到m幅圖像：i1(x,y)、i2(x,y)、…、im(x,y)，利用消除離焦像公式i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+im(x,y)，對這m幅圖像進行消除離焦像處理，獲得樣品內一個層面的光切片i(x,y)。樣品臺4在平移器8的控制下，帶動樣品在物鏡1光軸方向移動，使得樣品內不同的層面和物鏡1物方焦面重合，相機3拍攝圖像，獲得樣品內多個層面的光切片；計算機13控制旋轉器12、平移器8和相機3之間的聯動。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。