一、技術領域

本發明涉及痕量檢測領域，特別涉及一種潛在指紋中蛋白質成分的提取及顯現方法。

二、

背景技術：

指紋鑒定是進行個人識別的最可靠的方法之一，目前警方利用刑事技術偵破的案件中，指紋識別占七成左右。指紋一度被司法界公認為“物證之首”。潛在指紋中包含著復雜的成分，如內源性的蛋白質、氨基酸、藥物代謝物，以及外源性的爆炸物、違禁藥物等。這些成分可以通過相應的抗體進行識別檢測。充分、準確地了解潛在指紋的組成成分，不僅有助于人們選擇合適的顯現方法以達到成功識別指紋的目的，還能為研究者提供更多有價值的附加信息，如指紋的遺留時間、主人的性別、年齡甚至生活習慣等。

申請公布號為“cn103543145a”的中國發明專利公開了“基于化學發光酶聯免疫分析的潛在指紋成像的方法”，該方法在指紋上直接加入手指代謝物的抗體溶液進行孵育，孵育完成后用緩沖液進行沖洗；將所述的指紋樣本干燥，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗進行孵育；孵育后，用緩沖溶液沖洗指紋樣本，干燥后將指紋樣本置于化學發光反應底物溶液中，采集指紋圖像。該方法雖然簡單快速，但是該方法容易受雜質影響(如指紋中的油脂、灰塵)，存在非特異性吸附的問題。

蛋白質印跡法是蛋白質分析最成熟的技術之一。該方法主要利用抗原抗體的高特異性結合原理，通過信號放大作用，將基底的蛋白部分以圖像的形式顯現出來，方法直觀、方便。本發明采用蛋白質印跡法提取潛在指紋中的蛋白質成分，可避免油脂、灰塵等雜質對檢測結果的影響，提高檢測結果的準確性。本發明為研究潛在指紋中的蛋白質成分提供了科學依據，并可有效地提高公安機關提取鑒別潛在指紋的工作效率。

三、

技術實現要素：

為了彌補現有技術的不足，解決現有技術中蛋白質成分提取難度大，后期檢驗鑒定困難的問題，本發明提供了一種潛在指紋中蛋白質成分的提取及顯現方法。本發明方法簡單、檢測特異性好、發光強度高，可對指紋清晰顯現。

本發明的技術方案為：

一種潛在指紋中蛋白質成分的提取及顯現方法，包括步驟：

1)將客體上殘留的潛在指紋樣本轉移至sds-page膠上；

2)將指紋樣本上的目的蛋白轉移至pvdf膜上；

3)將步驟2)處理后的pvdf膜浸入脫脂牛奶中封閉0.5-2h，然后清洗pvdf膜上過多的牛奶；

4)向步驟3)處理后的pvdf膜上滴加一抗溶液進行孵育，孵育完成后清洗過多抗體；

5)向步驟4)處理后的pvdf膜上滴加辣根過氧化物酶標記的二抗溶液進行孵育，孵育完成后清洗過多抗體；

6)向步驟5)處理后的pvdf膜上滴加顯影液，暗箱中顯影，得到清晰的指紋圖像。

作為優選方案，步驟1)中所述基底為無孔玻璃基底或者多孔紙質基底。

作為優選方案，步驟1)中，sds-page膠的組成如下：4-5ml水、2-3ml30％的丙烯酰胺、2-3ml濃度為1.5mol/lph為8.8的tris溶液、0.05-0.15ml10％的sds溶液、5-7μltemed。指紋中的蛋白質分子與sds結合形成帶負電荷的蛋白質-sds復合物，在電壓作用下轉移到pvdf膜上。

作為優選方案，步驟2)中采用濕轉儀將目的蛋白轉移至pvdf膜上。

進一步地，濕轉時，設定電壓110-130v，轉移時間為20-40min。可以使蛋白質充分轉移到pvdf膜上。

作為優選方案，步驟3)中脫脂牛奶的濃度為4-6％(w/v)。該濃度可以有效地結合pvdf膜上的非特異性吸附位點。

作為優選方案，步驟3)、4)、5)中清洗均采用tbst緩沖液清洗；所述tbst緩沖液為含0.05％tween-20的tbs緩沖液，tbs緩沖溶液為0.1mtris-hcl，ph為7.5，含0.15mnacl。

作為優選方案，步驟4)中所述一抗溶液為兔抗人egf、兔抗人溶菌酶、兔抗人皮離蛋白溶液中的任意一種，所述一抗溶液的濃度為0.01-0.03mg/ml。

作為優選方案，步驟5)中所述二抗溶液為辣根過氧化物酶標記羊抗兔igg，所述二抗溶液的濃度為0.005-0.015mg/ml。

作為優選方案，步驟6)中所述顯影液為ph為8.5的0.1mtris-hcl含0.4-0.6mm魯米諾、0.2-0.3mm對碘苯酚和2-5mm過氧化氫。

本發明方法實現了對潛在指紋的高靈敏檢測，主要包括：將客體上殘留的潛在指紋樣本轉移至sds-page膠上；利用濕轉方式將目標蛋白轉移至pvdf膜；選擇特異性檢測目標蛋白的一抗與辣根過氧化物酶標記的二抗，利用抗體與目標物的特異性反應，將辣根過氧化物酶連接到目標檢測物上；增強化學發光底物在辣根過氧化物酶催化下產生化學發光，從而顯現出指紋并可由此確定待測物的存在。

本發明的有益效果為：

1、本發明在添加檢測試劑前預先提取潛在指紋中的蛋白質成分，特異性強，避免了非特異性吸附問題；

2、本發明使用pvdf膜作為蛋白質載體，蛋白質的附著力強；

3、本發明的檢測方法使蛋白質信號放大，靈敏度高，且發光試劑造價低；

4、本發明操作簡單，采用傳統蛋白質印跡方法，可靠，穩定。

四、附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發明潛在指紋中蛋白質成分的提取及顯現方法檢測潛在指紋示意圖；

圖2為實施例1潛在指紋中蛋白質成分的提取及顯現方法檢測潛在指紋的發光圖像。

圖3為實施例2潛在指紋中蛋白質成分的提取及顯現方法檢測潛在指紋的發光圖像。

五、具體實施方式

實施例1

潛在指紋中蛋白質成分的提取及顯現方法，包括：

1)將指紋按捺在無孔玻璃基底上；玻璃基底分別用無水乙醇，水超聲清洗20min；

2)將基底上的指紋樣本轉移到8％的sds-page膠上；

8％的sds-page膠的配制如下：

水：4.6ml；30％的丙烯酰胺：2.7ml；1.5mtris(ph8.8)：2.5ml；10％的sds：0.1ml；temed：6μl；

3)使用濕轉儀，設定電壓120v，轉移時間30min，將sds-page膠上指紋樣本的目的蛋白轉移到pvdf膜上；

4)轉移完成后，將pvdf膜浸入5％(w/v)的脫脂牛奶中封閉1h；

5)用tbst清洗膜上過多的牛奶，清洗3次，每次5min；

6)向步驟6)處理后的pvdf膜上滴加0.02mg/ml一抗(兔抗人egf)，4℃過夜孵育一抗溶液進行孵育；

7)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min；

8)向步驟8)處理后的pvdf膜上滴加辣根過氧化物酶標記的二抗(羊抗兔igg)常溫孵育1h，二抗濃度為0.01mg/ml；

9)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min；

10)配制顯影液(顯影液為ph為8.5的0.1mtris-hcl，含0.5mm魯米諾、0.23mm對碘苯酚和3mm過氧化氫)，將其均勻滴到步驟10)處理后的pvdf膜上，暗箱中顯影，得到清晰指紋圖像。在辣根過氧化物酶的作用下，過氧化氫與魯米諾反應產生波長為425nm的光，從而顯現出指紋。

其中，步驟5)、7)、9)中的tbst為含0.05％tween-20的tbs緩沖液，tbs緩沖溶液為0.1mtris-hcl，ph為7.5，含0.15mnacl。

本發明潛在指紋中蛋白質成分的提取及顯現方法檢測潛在指紋示意圖如圖1所示，選擇特異性檢測目標蛋白的一抗與辣根過氧化物酶標記的二抗，利用抗體與目標物的特異性反應，將辣根過氧化物酶連接到目標檢測物上；增強化學發光底物在辣根過氧化物酶催化下產生化學發光，從而顯現出指紋并可由此確定待測物的存在。

本實施例潛在指紋中蛋白質成分的提取及顯現方法檢測潛在指紋的發光圖像如圖2所示，可見本發明方法可獲得的指紋圖像，指紋紋線清晰。

實施例2

潛在指紋中蛋白質成分的提取及顯現方法，包括：

1)將指紋按捺在多孔紙質基底(普通商品化a4紙)上；

2)將基底上的指紋樣本轉移到10％的sds-page膠上；

10％的sds-page膠的配制如下：

水：4.1ml；30％的丙烯酰胺：3.3ml；1.5mtris(ph8.8)：2.5ml；10％的sds：0.1ml；temed：6μl；

3)使用濕轉儀，設定電壓110v，轉移時間30min，將sds-page膠上指紋樣本的目的蛋白轉移到pvdf膜上；

4)轉移完成后，將pvdf膜浸入4％(w/v)的脫脂牛奶中封閉1.5h；

5)用tbst清洗膜上過多的牛奶，清洗3次，每次5min；

6)向步驟6)處理后的pvdf膜上滴加0.03mg/ml一抗(兔抗人皮離蛋白)，4℃過夜孵育一抗溶液進行孵育；

7)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min，

8)向步驟8)處理后的pvdf膜上滴加辣根過氧化物酶標記的二抗(羊抗兔igg)常溫孵育1h，二抗濃度為0.02mg/ml；

9)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min；

10)配制顯影液(顯影液為ph為8.5的0.1mtris-hcl含0.5mm魯米諾、0.23mm對碘苯酚和2mm過氧化氫)，將其均勻滴到步驟10)處理后的pvdf膜上，暗箱中顯影，得到清晰指紋圖像。在辣根過氧化物酶的作用下，過氧化氫與魯米諾反應產生波長為425nm的光，從而顯現出指紋。

其中，步驟5)、7)、9)中的tbst為含0.05％tween-20的tbs緩沖液，tbs緩沖溶液為0.1mtris-hcl，ph為7.5，含0.15mnacl。

實施例3

潛在指紋中蛋白質成分的提取及顯現方法，包括：

1)將指紋按捺在多孔紙質基底(普通商品化a4紙)上；

2)將基底上的指紋樣本轉移到10％的sds-page膠上；

10％的sds-page膠的配制如下：

水：4.1ml；30％的丙烯酰胺：3.3ml；1.5mtris(ph8.8)：2.5ml；10％的sds：0.1ml；temed：6μl；

3)使用濕轉儀，設定電壓110v，轉移時間30min，將sds-page膠上指紋樣本的目的蛋白轉移到pvdf膜上；

4)轉移完成后，將pvdf膜浸入4％(w/v)的脫脂牛奶中封閉1.5h；

5)用tbst清洗膜上過多的牛奶，清洗3次，每次5min；

6)向步驟6)處理后的pvdf膜上滴加0.03mg/ml一抗(兔抗人溶菌酶)，4℃過夜孵育一抗溶液進行孵育；

7)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min，

8)向步驟8)處理后的pvdf膜上滴加辣根過氧化物酶標記的二抗(羊抗兔igg)常溫孵育1h，二抗濃度為0.02mg/ml；

9)tbst清洗膜上過多的抗體，清洗3次，每次10min；

10)配制顯影液(顯影液為ph為8.5的0.1mtris-hcl含0.5mm魯米諾、0.23mm對碘苯酚和2mm過氧化氫)，將其均勻滴到步驟10)處理后的pvdf膜上，暗箱中顯影，得到清晰指紋圖像。在辣根過氧化物酶的作用下，過氧化氫與魯米諾反應產生波長為425nm的光，從而顯現出指紋。

其中，步驟5)、7)、9)中的tbst為含0.05％tween-20的tbs緩沖液，tbs緩沖溶液為0.1mtris-hcl，ph為7.5，含0.15mnacl。