本發(fā)明涉及單分子免疫檢測，尤其涉及一種單分子檢測方法。

背景技術：

1、傳統(tǒng)的檢測技術中，使用的最廣泛的是化學發(fā)光和(或)免疫檢測。但在部分重大疾病早篩、神經障礙早診、心血管疾病早檢方面，尚不能達到理想的測量水平。常規(guī)免疫技術缺點：1.檢測速度慢。2.靈敏度低，檢測限偏高，僅能檢測到血液中nm-pm濃度的抗原分子。3.方法開發(fā)困難。

2、單分子檢測技術是不同于傳統(tǒng)檢測方法的新一代檢測技術，在傳統(tǒng)的檢測方法(如化學發(fā)光法、酶聯免疫法)中，通常對溶液中整體的信號進行放大，來統(tǒng)計樣本的信號值，當溶液中待測樣本的信號低到一定程度時，很容易被溶液中的噪聲所淹沒，所以對于低濃度的樣本很難進行精準定量檢測。單分子檢測方法中將待測信號進行數字化分割，通過信號放大或熒光標記后直接觀察對單分子信號進行統(tǒng)計，通過待測信號與標準曲線的計量關系來實現單分子級別的定量檢測。采用不同的信號數字化分割和檢測方式決定了的單分子檢測的能力。包括檢測速度和檢測靈敏度等，目前單分子檢測主要有以下幾種信號數字化的策略：

3、(1)通過微孔芯片進行分割，再對每個目標單元的信號進行放大后進行計數觀察。以美國quanterix公司的simoa為代表，在檢測抗體上偶聯酶促蛋白，使用具有微孔陣列的特制載體，微孔中加入酶促底物。在檢測過程中微孔陣列使信號數字化，通過酶促反應對單分子信號進行放大，實現單分子定量檢測。但是該方案中涉及酶促的信號放大過程，導致檢測時間長，同時特制的檢測載體在使用過程中會帶來較高的成本。

4、(2)通過磁珠對單個信號進行分割，使用大粒徑的熒光顆粒進行標記，并對目標信號進行計數觀察。如宇測公司(專利號cn?111771126)，采用原位增強的熒光納米顆粒對檢測抗體進行標記，通過對熒光信號的統(tǒng)計進行單分子檢測，該方法中使用的熒光納米顆粒直徑為200-350nm，在與檢測抗體偶聯后會產生較大的空間位阻，會引起溶液中抗原抗體免疫反應結合效率低，同時磁珠進一步放大了空間位阻，存在反應結合時間長的問題，如果檢測時間不足，則難以滿足低濃度樣本的定量檢測。

5、綜上，單分子免疫檢測領域內存在的檢測時間長、檢測成本高的問題，極大程度上制約了單分子檢測在科研和醫(yī)療方面的使用和推廣。

技術實現思路

1、基于背景技術存在的技術問題，本發(fā)明提出了一種檢測時間短、檢測成本低、檢測靈敏度和準確性進一步提升的單分子檢測方法。

2、本發(fā)明提出的一種單分子檢測方法，包括以下步驟：

3、準備成像載體，所述成像載體包括底板和設在底板上的一個或多個凹槽，所述凹槽具有平整的底面，所述凹槽的底面和底板的底面均為水平面，且所述凹槽的底面與底板的底面之間的部分為透明材料制成；

4、先將樣品、捕獲抗體和熒光染料標記的檢測抗體混合孵育，再加入固相載體混合孵育，其中固相載體與捕獲抗體能夠直接或者間接地偶聯；或者先將固相載體與捕獲抗體直接或者間接地偶聯形成捕獲抗體偶聯的固相載體，再將樣品、捕獲抗體偶聯的固相載體、熒光染料標記的檢測抗體混合孵育；

5、將上述混合孵育的產物在所述成像載體的凹槽中進行離心，用熒光顯微鏡對凹槽底面的熒光點數進行檢測計數；

6、所述捕獲抗體能夠與靶標分子第一結合位點結合，檢測抗體能夠與靶標分子第二結合位點結合，且第一結合位點與第二結合位點為不同的結合位點；

7、所述固相載體為直徑為20nm～500nm的微球。

8、優(yōu)選地，所述固相載體為直徑為50nm～200nm的微球，更優(yōu)選為直徑為100nm～200nm的微球。

9、優(yōu)選地，所述靶標分子為蛋白(例如可以是酶、細胞因子、受體蛋白)、核酸(例如可以是dna、rna)、小分子化合物、病原體(例如可以是細菌、病毒)或者細胞。

10、優(yōu)選地，所述微球為表面修飾的或者未經表面修飾的微球，所述表面修飾包括氨基化修飾、羧基化修飾、羥基化修飾、硫酸鹽修飾、甲苯磺酰化修飾、環(huán)氧化修飾、鏈霉親和素修飾、生物素修飾、熒光染料修飾的至少一種。

11、優(yōu)選地，所述微球為表面熒光染料修飾的微球，且標記檢測抗體的熒光染料與微球表面修飾的熒光染料的顏色不同。在本發(fā)明中，通過在固相載體的表面和對檢測抗體修飾發(fā)出不同顏色的熒光染料，可以實現熒光共定位，進一步提高檢測的靈敏度。

12、優(yōu)選地，所述熒光染料為熒光素類染料、羅丹明類染料、香豆素類染料、量子點類染料、二苯乙烯類染料、萘酰胺類染料中的至少一種。

13、更優(yōu)選地，所述熒光染料選自atto-647-nhs、atto-532-nhs或者alexa?fluor647-nhs。

14、優(yōu)選地，所述微球的材質為硅、硅膠、二氧化硅、聚苯乙烯、鐵、鐵的氧化物中的至少一種。

15、在本發(fā)明中，固相載體與捕獲抗體的偶聯可以采用本領域的常規(guī)方法。其中，固相載體與捕獲抗體直接地偶聯是指捕獲抗體通過物理吸附或化學修飾的方法，直接吸附或偶聯在固相載體上；固相載體與捕獲抗體間接地偶聯是指通過抗捕獲抗體(即二抗)或生物素-鏈霉親和素體系進行結合，將捕獲抗體特異性地偶聯在固相載體上。優(yōu)選地，所述固相載體與捕獲抗體通過戊二醛交聯法、碳化二亞胺法、nhs酯和edc交聯法、硅烷化法、親和配體介導法、物理吸附法中的至少一種偶聯。在檢測中，可以根據靶標分子、固相載體、捕獲抗體、檢測抗體以及其他檢測過程中所使用的材料的性質不同選用不同的偶聯方法。

16、優(yōu)選地，混合孵育的溫度為25～45℃，時間為3～30min。

17、優(yōu)選地，所述成像載體為孔板或者具有凹槽的芯片或玻片。

18、優(yōu)選地，所述透明材料為玻璃或塑料，所述凹槽的底面與底板的底面之間的距離為0.08～0.25mm。

19、在本發(fā)明中，樣品的混合孵育可以在成像載體的凹槽中進行，此時為確保檢測結果的準確性與穩(wěn)定性，需要對凹槽的內部進行封閉處理；樣品的混合孵育也可以在其他容器中進行，在其他容器中反應完畢后再將產物加入成像載體的凹槽中，此時可以對凹槽的內部進行封閉處理或不進行封閉處理，若進行封閉處理，可以直接將產物加入凹槽中，若不進行封閉處理，為降低游離熒光物質對檢測結果的干擾，需要用溶劑對混合孵育的產物進行清洗，再加入凹槽中。其中清洗可以為一次或者多次，清洗所使用的溶劑可以為本領域常用的緩沖液，例如tris-hcl緩沖液、dpbs緩沖液、醋酸鈉緩沖液，清洗所使用的溶劑中還可以包括濃度為0.01～1％的表面活性劑，表面活性劑優(yōu)選為tween20、tritonx-100、np40中的至少一種。

20、在本發(fā)明中，混合孵育的產物可以先在溶劑中分散均勻，再進行離心和檢測計數；分散所使用的溶劑可以為本領域常用的緩沖液，例如tris-hcl緩沖液、dpbs緩沖液、醋酸鈉緩沖液，分散所使用的溶劑中還可以包括濃度為0.01～1％的表面活性劑，表面活性劑優(yōu)選為tween20、tritonx-100、np40中的至少一種。

21、在本發(fā)明中，可以采用本領域常規(guī)的封閉試劑對成像載體的凹槽內部進行封閉處理，例如可以是脫脂奶粉、牛血清白蛋白(bsa)、血清、酪蛋白、甲醛、明膠、聚乙二醇中的一種或多種。封閉處理的具體方法可以采用本領域的常規(guī)方法。

22、優(yōu)選地，s3中，所述離心的轉速為500～2500rpm。

23、本發(fā)明的有益效果如下：

24、本發(fā)明采用小粒徑的微球作為固相載體連接捕獲抗體，使捕獲抗體與熒光染料標記的檢測抗體、靶標分子結合，在具有底面平整的凹槽的成像載體中經過離心沉降，使微球能夠均勻、高度分散地沉降在成像載體的凹槽底部，再用熒光顯微鏡對凹槽底面的熒光點數進行檢測計數，從而實現快速、準確的單分子檢測。該方法的檢測成本低，檢測時間短，在高靈敏檢測的前提下，整個檢測過程在30min以內即可完成，其檢測靈敏度大幅提升，檢測限可以達到10fg/ml以下，更利于單分子檢測在科研和醫(yī)療領域的推廣，可以廣泛應用于生物醫(yī)學(包括臨床診斷、生物制藥質量控制)、化學、材料科學、環(huán)境科學等領域中。