利用可編程核酸探針的高通量且高度多路復用的成像的制作方法
【專利摘要】在此尤其提供了用于以高空間分辨率將感興趣的靶標成像的方法和組合物。
【專利說明】利用可編程核酸探針的高通量且高度多路復用的成像
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求2014年3月11日提交的美國臨時申請號61/951,461的權益，其全部內 容通過引用結合在此。 發明領域
[0003] 本發明總體上涉及檢測和量化分析物(例如，靶標)的領域。
[0004] 發明背景
[0005] 熒光顯微鏡檢術是一種用于探索在例如生物系統中的分子的有力工具。然而，可 以被區別地且同時地可視化的不同物種的數目（即多路復用能力)受到熒光團之間的光譜 重疊的限制。
[0006] 發明概述
[0007] 本發明尤其提供了用于檢測、成像并且/或者量化感興趣的靶標(例如，生物分子） 的方法和組合物。在此提供的方法中的一些包括（1)使一個有待分析的樣品（例如，一個疑 似含有一個或多個感興趣的靶標的樣品）與特異性結合這些靶標的部分(每個部分是一個 給定靶標的結合配偶體)接觸，其中每個部分偶聯至一個核酸(在此稱為對接鏈)并且其中 具有不同特異性的結合配偶體偶聯至不同對接鏈，（2)任選地去除未結合的結合配偶體， (3)使該樣品與經標記的（例如，熒光標記的）核酸接觸，這些核酸具有互補于并且因此特異 于一個對接鏈的核苷酸序列（此類標記核酸在此稱為經標記的成像鏈），（4)任選地去除未 結合的成像鏈，（5)將樣品整體或部分成像以便檢測經結合的成像鏈的位置和數目，（6)猝 滅來自樣品的經標記成像鏈的信號（例如，通過漂白，包括光漂白），并且（7)重復步驟(3)_ (6)，每次使用一個相對于本方法中所用的全部其他成像鏈來說具有獨特核苷酸序列的成 像鏈。
[0008] 成像鏈可以被相同地標記，包括被相同地進行熒光標記。在其他實施例中，具有一 個相同序列的成像鏈可以被相同地標記。第一種方法可能是更方便的，因為它需要單一的 激發波長和檢測器。
[0009] 用這樣的方式，可以檢測、成像并且/或者量化一個樣品中的兩個或更多個靶標， 無論它們在該樣品中的位置如何，包括無論它們在樣品中的位置是否非常接近，以致于如 果同時觀察來自這兩個或更多個靶標的信號則是不能區別的。因此，兩個或更多個靶標之 間的距離可小于用于檢測靶標的成像系統的分辨距離，并且仍然使用在此提供的方法，可 以將兩個或更多個靶標彼此區別開，由此促進對此類靶標的更準確且穩健的檢測和量化。 在一些情況下，該分辨距離可以為約50nm，作為一個實例。
[0010] 應當理解，在進行該方法之前，一個樣品的"靶標內容"可能是已知或懷疑的、或未 知和不受懷疑的。接觸樣品的結合配偶體可結合或不可結合到該樣品上，這取決于靶標是 否存在(例如，當靶標存在時，該結合配偶體可結合到該樣品上）。接觸樣品的成像鏈可結合 或不可結合到該樣品上，這取決于靶標是否存在(例如，當靶標存在時，該成像鏈可結合一 個結合到靶標上的相應的對接鏈）。"結合到樣品上"意指結合配偶體或成像鏈被結合到其 對應的靶標或對接鏈上。
[0011] 結合配偶體可以是天然存在的蛋白質，諸如抗體或抗體片段。在結合配偶體是一 種抗體或抗體片段的情況下，對接鏈可以在一個恒定區偶聯到其上。結合配偶體可以是一 種諸如單克隆抗體的抗體，或者它可以是抗原結合抗體片段，諸如來自單克隆抗體的抗原 結合片段。在一些實施例中，結合配偶體是一種受體。
[0012] 結合配偶體可以通過一個中間接頭連接至對接鏈。在一些實施例中，一個中間接 頭包含生物素和/或鏈霉抗生物素蛋白。
[0013] 可以對成像鏈進行熒光標記（即，將它們偶聯至一個熒光團）。偶聯至具有不同核 苷酸序列的成像鏈的熒光團可以是彼此相同的，或者它們可具有與其他熒光團重疊或不重 疊的發射分布圖。熒光標記的成像鏈可包括至少一個熒光團。
[0014] 在一些情況下，諸如成像鏈的熒光標記的成像核酸可包括1、2、3、或更多個熒光 團。
[0015] 該樣品可以是細胞、細胞群、或者來自細胞或細胞群的細胞裂解物。該靶標可以是 蛋白質。
[0016] 因此將了解到，本發明提供一種用于檢測分析物的方法，該方法是通過將分析物 結合到其對應的結合配偶體上并且順序地確定此類結合配偶體的存在，通過重復地結合、 檢測并且猝滅(例如，漂白，諸如光漂白）任選地被相同地標記(例如，相同地熒光標記）的成 像鏈。
[0017] 因此，本披露提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進行 測試的樣品與一個或多個靶標特異性結合配偶體接觸，其中每個靶標特異性結合配偶體連 接至一個對接鏈，并且其中具有不同特異性的靶標特異性結合配偶體連接至不同對接鏈， (2)任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體，（3)使該樣品與具有互補于一個對接鏈的 核苷酸序列的經標記成像鏈接觸，（4)任選地去除未結合的成像鏈，（5)將該樣品成像以便 檢測結合的經標記成像鏈的位置和數目，（6)猝滅來自結合的經標記成像鏈的信號，并且 (7)重復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像鏈來說具有獨特核苷酸序 列的經標記成像鏈。
[0018] 在一些實施例中，該樣品在步驟(1)中與多于一個的靶標特異性結合配偶體接觸。
[0019] 在一些實施例中，該靶標特異性結合配偶體是一種抗體或抗體片段。
[0020] 在一些實施例中，這些經標記成像鏈被相同地標記。在一些實施例中，這些經標記 成像鏈各自包括一個不同的標記。在一些實施例中，這些經標記成像鏈是熒光標記的成像 鏈。
[0021 ]在一些實施例中，該一個或多個靶標是蛋白質。在一些實施例中，該樣品是細胞、 細胞裂解物或組織裂解物。
[0022] 在一些實施例中，使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術在步驟(5)中將該樣品成像。
[0023] 在一些實施例中，步驟(6)中的猝滅信號包括光漂白。
[0024] 本披露進一步提供一種包含結合到多于一個的靶標識別部分(諸如靶標特異性結 合配偶體)上的樣品的組合物，每個靶標識別部分結合到一個對接核酸(諸如對接鏈)上，并 且至少一個對接核酸穩定地結合到經標記成像核酸(諸如成像鏈)上。
[0025] 本披露進一步提供一種組合物，該組合物包含結合到多于一個的靶標特異性結合 配偶體上的一個樣品，每個結合配偶體結合到一個對接鏈上；以及至少一個穩定地結合到 經標記成像鏈上的對接鏈。
[0026] 本披露進一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進 行測試的樣品與一個或多個靶標識別部分(諸如靶標特異性結合配偶體)接觸，其中每個靶 標識別部分連接至一個對接核酸(諸如對接鏈），并且其中具有不同特異性的靶標識別部分 連接至不同對接核酸，（2)任選地去除未結合的靶標識別部分，（3)使該樣品與具有互補于 一個對接核酸的核苷酸序列的經標記成像核酸(諸如成像鏈)接觸，（4)任選地去除未結合 的經標記成像核酸，（5)將樣品成像以便檢測結合的經標記成像核酸的位置和數目，（6)通 過改變溫度和/或緩沖條件將結合的經標記成像核酸從對接核酸去除，并且（7)重復步驟 (3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像核酸來說具有獨特核苷酸序列的經標 記成像核酸。在此類條件下，該成像核酸自發地從對接核酸解離。
[0027] 本披露進一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進 行測試的樣品與一個或多個靶標特異性結合配偶體接觸，其中每個靶標特異性結合配偶體 連接至一個對接核酸，并且其中具有不同特異性的靶標特異性結合配偶體連接至不同對接 核酸，（2)任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體，（3)使該樣品與具有互補于一個對 接核酸的核苷酸序列的經標記成像核酸接觸，（4)任選地去除未結合的經標記成像核酸， (5)將樣品成像以便檢測結合的經標記成像核酸的位置和數目，（6)通過改變溫度和/或緩 沖條件將結合的經標記成像核酸從對接核酸去除，并且(7)重復步驟(3)-(6)，每次使用一 個相對于全部其他經標記成像核酸來說具有獨特核苷酸序列的經標記成像核酸。在此類條 件下，該成像核酸自發地從對接核酸解離。
[0028] 在一些實施例中，通過減小鹽濃度、添加變性劑、或提高溫度將經標記成像核酸從 對接核酸去除。在一些實施例中，該鹽是Mg++。在一些實施例中，該變性劑是甲酰胺、尿素或 DMS0〇
[0029] 本披露進一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進 行測試的樣品與一個或多個靶標識別部分(諸如靶標特異性結合配偶體)接觸，其中每個靶 標識別部分連接至一個對接核酸(諸如對接鏈），并且其中具有不同特異性的靶標識別部分 連接至不同對接核酸，（2)任選地去除未結合的靶標識別部分，（3)使該樣品與具有互補于 一個對接核酸的核苷酸序列的經標記成像核酸(諸如成像鏈)接觸，（4)任選地去除未結合 的經標記成像核酸，（5)將樣品成像以便檢測結合的經標記成像核酸的位置和數目，（6)將 結合的經標記成像核酸從對接核酸去除，并且(7)重復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于 全部其他經標記成像核酸來說具有獨特核苷酸序列的經標記成像核酸。
[0030] 本披露進一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進 行測試的樣品與一個或多個靶標特異性結合配偶體接觸，其中每個靶標特異性結合配偶體 連接至一個對接核酸，并且其中具有不同特異性的靶標特異性結合配偶體連接至不同對接 核酸，（2)任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體，（3)使該樣品與具有互補于一個對 接核酸的核苷酸序列的經標記成像核酸接觸，（4)任選地去除未結合的經標記成像核酸， (5)將樣品成像以便檢測結合的經標記成像核酸的位置和數目，（6)將結合的經標記成像核 酸從對接核酸去除，并且(7)重復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像 核酸來說具有獨特核苷酸序列的經標記成像核酸。
[0031 ]在一些實施例中，在步驟(6)中，在一個競爭核酸的存在下，不通過鏈置換將經標 記成像核酸從對接核酸去除。
[0032] 在一些實施例中，在步驟(6)中，通過化學法、光化學法或酶促法裂解、修飾或降解 經標記成像核酸，將經標記成像核酸從對接核酸去除。
[0033] 在一些實施例中，當經標記成像核酸結合到其對應的對接核酸上時，在成像核酸 或對接核酸上不存在單鏈區。在一些實施例中，該對接核酸不具有立足點序列（toehold sequence)。在一些實施例中，該成像核酸不具有立足點序列。
[0034] 在一些實施例中，該經標記成像核酸不是自淬滅的。
[0035] 本披露進一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進 行測試的樣品與一個或多個靶標識別部分(諸如靶標特異性結合配偶體)接觸，其中每個靶 標識別部分連接至一個對接核酸(諸如對接鏈），并且其中具有不同特異性的靶標識別部分 連接至不同對接核酸，（2)任選地去除未結合的靶標識別部分，（3)使該樣品與具有互補于 一個對接核酸的核苷酸序列的經標記成像核酸(諸如成像鏈)接觸，（4)任選地去除未結合 的經標記成像核酸，（5)將樣品成像以便檢測結合的經標記成像核酸的位置和數目，（6)通 過去除或修飾它們的信號發射部分而不完全去除成像核酸來滅活結合的經標記成像核酸， 并且(7)重復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像核酸來說具有獨特核 苷酸序列的經標記成像核酸。
[0036] 本披露進一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進 行測試的樣品與一個或多個靶標特異性結合配偶體接觸，其中每個靶標特異性結合配偶體 連接至一個對接核酸，并且其中具有不同特異性的靶標特異性結合配偶體連接至不同對接 核酸，（2)任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體，（3)使該樣品與具有互補于一個對 接核酸的核苷酸序列的經標記成像核酸接觸，（4)任選地去除未結合的經標記成像核酸， (5)將樣品成像以便檢測結合的經標記成像核酸的位置和數目，（6)通過去除或修飾它們的 信號發射部分而不完全去除成像核酸來滅活結合的經標記成像核酸，并且（7)重復步驟 (3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像核酸來說具有獨特核苷酸序列的經標 記成像核酸。
[0037] 不同實施例同樣適用于前述方法。這些實施例如下：
[0038] 在一些實施例中，該樣品在步驟（1)中與多于一個的靶標特異性結合配偶體接觸。 在一些實施例中，該靶標特異性結合配偶體是一種抗體或抗體片段。在一些實施例中，該靶 標特異性結合配偶體是天然或工程化的配體、小分子、適體、肽、或寡核苷酸。
[0039] 在一些實施例中，這些經標記成像核酸被相同地標記。在一些實施例中，這些經標 記成像核酸各自包括一個不同的標記。在一些實施例中，這些經標記成像核酸是熒光標記 的成像核酸。
[0040] 在一些實施例中，該一個或多個靶標是蛋白質。在一些實施例中，該樣品是細胞、 細胞裂解物或組織裂解物。
[0041] 在一些實施例中，使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術在步驟(5)中將該樣品成像。
[0042] 在一些實施例中，該未結合的對接核酸是部分雙鏈的。在一些實施例中，該未結合 的成像核酸是部分雙鏈的。
[0043] 在一些實施例中，該成像核酸是一個分子信標或者包括一個發夾二級結構。在一 些實施例中，該成像核酸是一個分子信標或者包括一個自淬滅的發夾二級結構。在一些實 施例中，該成像核酸是一個半雙鏈體(hemiduplex)。在一些實施例中，該半雙鏈體是自淬滅 的。在一些實施例中，該成像核酸通過一個樹枝狀結構或一個聚合結構結合到多個信號發 射部分上。該成像核酸可以是直鏈或支鏈的。
[0044] 在一些實施例中，該對接核酸包括一個發夾二級結構。
[0045] 這些和其他實施例將在此更詳細地進行說明。
[0046] 附圖簡述
[0047] 圖1是在本披露中提供的一種高通量和本質上可縮放的多路復用成像方法的一個 實施例的示意圖。在探針雜交后將細胞成像并且然后在隨后輪次的成像之前進行光漂白。
[0048] 圖2是一種基于緩沖液更換的高通量和本質上可縮放的多路復用成像方法的一個 實施例的示意圖，該緩沖液更換使用具有輕微變性特征的溶液，諸如減小的鹽濃度、增加的 甲酰胺濃度、或更高的溫度。
[0049] 圖3是通過使用在本披露中提供的方法去除成像鏈來滅活該成像鏈的一個實施例 的示意圖。
[0050] 圖4是通過滅活熒光團而不去除成像鏈的核酸部分來滅活該成像鏈的一個實施例 的示意圖。
[0051] 圖5是一個分子信標樣的自淬滅成像鏈的一個實施例的示意圖。
[0052]圖6是一個半雙鏈體自淬滅成像鏈的一個實施例的示意圖。
[0053]圖7是一個非單鏈對接鏈的一個實施例的示意圖。
[0054] 圖8是一個成像鏈的一個實施例的示意圖，該成像鏈募集多個信號發射部分拷貝 至對接鏈。
[0055] 圖9是一個非單鏈成像鏈的一個實施例的示意圖。
[0056] 圖10是示出在3種不同條件下具有對應的反向互補鏈的10個不同寡核苷酸的預測 解離常數的圖。序列al: 5 ' -CATCTAAAGCC-3 '（ SEQ ID NO: 1);序列a2:5 ' -GAATTTCCTCG-3 ' (SEQIDN0:2);序列a3:5'-GTTTAATTGCG-3'（SEQIDN0:3) ;序列a4:5'-ACAATTCTTCG-3' (SEQ ID N0:4);序列a5:5'-TTTCTTGCTTC_3'（SEQ ID N0:5);序列a6:5'-GCATTGTTACT_3' (SEQIDN0:6) ;序列a7:5'-ATATACAAGCG-3'（SEQIDN0:7);序列a8 :5'-GCTGTCTATTG-3' (SEQIDN0:8);序列a9:5'-TCTTTATGCTG-3'（SEQIDN0:9) ;序列al0:5'-CAATCTCATCC-3' (SEQ ID NO:10)。
[0057] 發明說明
[0058] 本發明尤其提供了例如，在使用基于核酸的成像探針(例如，基于DNA的成像探針） 的細胞環境中用于多路復用熒光成像的組合物和方法。在此提供的方法是部分地基于核酸 對接鏈和成像鏈的可編程性。也就是說，例如，對接鏈和成像鏈可以被設計，從而使得它們 在某些條件下彼此結合一定的時間。這種可編程性允許成像鏈穩定結合到對接鏈，如在此 提供的。總體上，在此提供的方法涉及鑒定一個特定樣品（例如，生物樣品）中的一個或多個 靶標(例如，諸如蛋白質或核酸的一個或多個生物分子）。在一些情況下，一個或多個靶標是 否存在于樣品中是未知的。因此，本披露的方法可用于確定在一個疑似含有一個或多個靶 標的樣品中是否存在該一個或多個靶標。在在此提供的方面和實施例的任一個中，一個樣 品可含有或可疑似含有一個或多個靶標。
[0059] 因此，本發明提供用于基于可編程核酸(例如，DNA)探針進行高通量且高度多路復 用的成像以及分析物/靶標檢測的方法。這些方法依賴于一種采用正交成像鏈的順序成像 方法，這些正交成像鏈可以穩定地附接至一個固定在結合配偶體(諸如抗體)上的互補對接 鏈(圖1)。在與一個成像鏈雜交且成像后，進行一個猝滅步驟(諸如一個光漂白步驟)以便消 除和/或減少來自雜交(結合)的成像鏈的熒光。
[0060] 在另一個實施例中，這些方法利用對接鏈與成像鏈之間的較弱結合以便去除信 號。例如，雜交條件可改變，這樣使得在對接鏈或成像鏈之間形成的雙鏈體的熔點略高于室 溫(例如，25°C)或成像溫度。如上所述地進行標記步驟（即，其中成像鏈結合到其對應的對 接鏈上的步驟)和成像步驟。作為一個實例，在對第一個靶標進行成像后，使該樣品經受一 個變性條件。可使用一種具有例如較低鹽濃度，存在或增加變性劑(諸如甲酰胺)的濃度，或 增加的溫度的溶液，在緩沖液更換步驟中提供該變性條件（圖2)。該樣品可以可替代地或另 外地暴露于增加的溫度。上述的增加或減小是相對于在標記步驟中存在的條件（即，當成像 鏈結合到對接鏈上時）。在緩沖液更換的情況下，可洗滌該樣品，可重復該緩沖液更換，可再 次洗滌該樣品，并且然后將下一個成像鏈添加到該樣品。
[0061] 對于多路復用，在例如用于猝滅信號的光漂白或其他方法或者成像鏈滅活或去除 的每個步驟之后順序地向相同樣品施用正交成像鏈的不同儲庫，以便潛在地成像無限數目 的靶標。不同于傳統的成像方法中多路復用受到顏色通道之間的光譜重疊限制，在此提供 的方法僅受到(對接鏈或可替代地成像鏈的）可能的正交核苷酸序列數目的限制。由于可以 容易地設計較大量的正交核苷酸序列，此方法具有僅通過使用單個熒光團就達到的本質上 可縮放的多路復用能力。此方法可以容易地與標準顯微鏡檢術設置(例如，共聚焦或落射熒 光顯微鏡檢術)整合，從而允許高通量地分析該樣品。
[0062] 這些方法具有在例如高通量篩選測定(諸如藥物篩選測定）中的適用性。此成像方 法允許在使用標準共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術成像的同時，以一種超多路復用格式分析 大的細胞群(~1，〇〇〇-1〇,〇〇〇)或組織樣品。以一種高通量的方式從相同樣品中篩選大量靶 標(諸如蛋白質）將提供關于新藥或調節劑的信息，同時提供細胞異質性信息。具有高通量 且超多路復用的成像能力的組織樣品的大規模篩選將適用于病理學分析，例如，在醫院或 其他服務提供商設置中。
[0063] 在此提供的方法還可以用于鑒定一個單一靶標(例如，諸如例如，一種特定的蛋白 質）的絕對量，或一個單一靶標相對于一個或多個其他靶標而言的量。
[0064] 另外，在此提供的方法可用于鑒定一個靶標在一個樣品中或相對于樣品中的其他 靶標的位置。
[0065] 因此，本披露提供一種方法，包括（1)使一個樣品同時與多個序列標記的靶標識別 部分接觸，（2)引入成像核酸(諸如成像鏈），這些成像核酸通過序列互補性識別序列標記的 靶標識別部分中的對接核酸(諸如對接鏈)亞組，（3)去除或滅活成像核酸或者猝滅來自成 像核酸的信號，并且(4)至少一次重復步驟(2)和任選地步驟(3)以便成像并且檢測一個或 多個另外的對接核酸。
[0066] 該方法可任選地包括用對接核酸(諸如對接鏈)來標記多個靶標識別部分以便形 成序列標記的靶標識別部分。
[0067] 本披露提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進行測試 的樣品與一個或多個靶標特異性結合配偶體接觸，其中每個靶標特異性結合配偶體連接至 一個對接鏈，并且其中具有不同特異性的靶標特異性結合配偶體連接至不同對接鏈，（2)任 選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體，（3)使該樣品與具有互補于一個對接鏈的核苷 酸序列的經標記成像鏈接觸，（4)任選地去除未結合的成像鏈，（5)將該樣品成像以便檢測 結合的經標記成像鏈的位置和數目，（6)猝滅來自結合的經標記成像鏈的信號，并且（7)重 復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像鏈來說具有獨特核苷酸序列的 經標記成像鏈。
[0068] 步驟(3)-(6)可重復一次或多次。例如，步驟(3)-(6)可重復1-10次或更多次。在一 些實施例中，步驟(3)-(6)重復1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
[0069] 本披露進一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進 行測試的樣品與一個或多個靶標識別部分(諸如靶標特異性結合配偶體)接觸，其中每個靶 標識別部分連接至一個對接核酸，并且其中具有不同特異性的靶標識別部分連接至不同對 接核酸，（2)任選地去除未結合的靶標識別部分，（3)使該樣品與具有互補于一個對接核酸 的核苷酸序列的經標記成像核酸(諸如成像鏈)接觸，（4)任選地去除未結合的經標記成像 核酸，（5)將樣品成像以便檢測結合的經標記成像核酸的位置和數目，（6)將結合的經標記 成像核酸從對接核酸去除，并且(7)重復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標 記成像核酸來說具有獨特核苷酸序列的經標記成像核酸。
[0070] 步驟(3)-(6)可重復一次或多次。例如，步驟(3)-(6)可重復1-10次或更多次。在一 些實施例中，步驟(3)-(6)重復1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
[0071] 本披露進一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進 行測試的樣品與一個或多個靶標識別部分(諸如靶標特異性結合配偶體)接觸，其中每個靶 標識別部分連接至一個對接核酸(諸如對接鏈），并且其中具有不同特異性的靶標識別部分 連接至不同對接核酸，（2)任選地去除未結合的靶標識別部分，（3)使該樣品與具有互補于 一個對接核酸的核苷酸序列的經標記成像核酸(諸如成像鏈)接觸，（4)任選地去除未結合 的經標記成像核酸，（5)將樣品成像以便檢測結合的經標記成像核酸的位置和數目，（6)通 過去除或修飾它們的信號發射部分而不完全去除成像核酸來滅活結合的經標記成像核酸， 并且(7)重復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像核酸來說具有獨特核 苷酸序列的經標記成像核酸。
[0072] 步驟(3)-(6)可重復一次或多次。例如，步驟(3)-(6)可重復1-10次或更多次。在一 些實施例中，步驟(3)-(6)重復1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
[0073] 在一些實施例中，在此提供的方法包括一個以下步驟:使用一種除了鏈置換之外 的方法來去除結合到對接核酸(諸如對接鏈)上的成像核酸(諸如成像鏈）。
[0074] 在一些實施例中，在此提供的方法包括一個去除結合到對接核酸(諸如對接鏈)上 的成像核酸(諸如成像鏈)的步驟，其中該成像核酸在結合到對接核酸上之前發射信號（即， 這種信號未淬滅）。
[0075] 在一些實施例中，在此提供的方法包括一個去除結合到對接核酸(諸如對接鏈)上 的成像核酸(諸如成像鏈)的步驟，其中使用不包含淬滅劑的核酸去除該成像核酸。
[0076] 在每個前述方法中，對接核酸(包括對接鏈)可以是單鏈對接核酸或對接鏈，或者 它可以是雙鏈對接核酸或對接鏈，或者它可以是部分雙鏈對接核酸或對接鏈(例如，含有一 個單鏈和一個雙鏈區）。
[0077]在一些實施例中，在使用多個靶標識別部分(包括多個結合配偶體）的情況下，該 多個可同時與樣品接觸并且因此與感興趣的靶標接觸。靶標識別部分(諸如結合配偶體)不 需要順序地與樣品接觸，雖然它們是可以的。
[0078]這些不同方法促進用旋轉盤共聚焦顯微鏡進行高通量成像。據估計，一次一種顏 色的全細胞3D成像過程將平均需要約30秒。此方法允許用兼容的10X或20X物鏡對大面積 (例如，高達mm規模)進行成像。可實現約30-50微米的成像深度。在此提供的方法已被用于 染色肌動蛋白、Ki-67、網格蛋白、細胞角蛋白等等(數據未示出）。
[0079] 結合配偶體
[0080] 這些方法采用偶聯至核酸(例如，對接核酸(諸如對接鏈））的結合配偶體。這些可 以在此稱為結合配偶體-核酸偶聯物（"BP-ΝΑ偶聯物"）。它們還可被稱為序列標記的靶標識 另嘟分。如在此所使用的，"結合配偶體-核酸偶聯物，"或"BP-ΝΑ偶聯物，"是指一種連接(例 如，通過一種N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)接頭)至一個單鏈核酸(例如，DNA)對接鏈的分子。
[0081] 偶聯物的結合配偶體可以是對于一個感興趣的靶標(諸如，生物分子(例如，蛋白 質或核酸））具有親和力的任何部分(例如，抗體或適體）。在一些實施例中，結合配偶體是一 種蛋白質。包含一種連接至對接鏈的蛋白質(或肽)的BP-ΝΑ-偶聯物可以在此稱為"蛋白質-核酸偶聯物"或"蛋白質-NA偶聯物。"用于本發明偶聯物的蛋白質的實例包括但不限于:抗 體(例如，單克隆抗體）、抗原結合抗體片段(例如，Fab片段）、受體、肽以及肽適體。其他結合 配偶體可根據本發明進行使用。例如，在此設想通過靜電（例如，靜電顆粒）、疏水性或磁性 (例如，磁性顆粒)相互作用結合到靶標上的結合配偶體。
[0082] 如在此所使用的，"抗體"包括全長抗體和它的任何抗原結合片段(例如，"抗原結 合部分"）或單鏈。術語"抗體"包括但不限于一種包含通過二硫鍵相互連接的至少兩個重 (H)鏈和兩個輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結合部分。抗體可以是多克隆或單克隆的；異種 (xenogeneic)、同種異體(allogeneic)、或同基因的（syngeneic);或其修飾形式(例如，人 源化的、嵌合的）。
[0083] 如在此所使用的，一個抗體的"抗原結合部分"是指抗體的保留特異性結合到抗原 上的能力的一個或多個片段。抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段執行。涵蓋于術 語抗體的"抗原結合部分"中的結合片段的實例包括（i)Fab片段，一種由Vh、V l、Cl以及(^結 構域組成的單價片段；（ii)F(ab'）2片段，一種包含通過二硫橋在鉸鏈區處連接的兩個Fab 片段的二價片段；（iii)一種由Vh和Chi結構域組成的Fd片段；（iv)-種由抗體的單臂的Vh和 結構域組成的Fv片段，（v)-種由VH結構域組成的dAb片段（沃德（Ward)等人，自然 (Nature)341:544 546,1989);以及(vi)-個分離的互補性決定區（Q)R)，或(vii)可任選地 通過合成接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的一個組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域 VH和VL是通過獨立的基因編碼的，但是這兩個結構域可以使用重組方法通過合成接頭接合， 該合成接頭能夠使其制成其中Vh和Vl區配對以形成單價分子的單蛋白質鏈(稱為單鏈Fv (scFv);參見，例如伯德(Bird)等人，科學（Science)242:423 426，1988;和休斯頓(Huston) 等人，美國國家科學院院刊(Proc.Natl .Acad. Sci .USA)85:5879-5883，1988)。這類單鏈抗 體也涵蓋于術語抗體的"抗原結合部分"范圍內。使用本領域技術人員已知的常規技術，獲 得這些抗體片段，并且按照與完整抗體相同的方式篩選所述片段的有用性。
[0084] 如在此所使用的，"受體"是指結合到配體(諸如，例如，肽或小分子(例如，低分子 量(〈900道爾頓)的有機或無機化合物））上的細胞來源的分子(例如，蛋白質）。
[0085] 如在此所使用的，"肽適體"是指一種具有插入恒定支架蛋白質的可變肽序列的分 子(參見例如，貝恩斯(Baines) 1C等人，今日藥物發現(Drug Discov.Today) 11:334-341， 2006) 〇
[0086] 在一些實施例中，BP-ΝΑ偶聯物的分子是一種核酸(諸如，例如，一種核酸適體）。如 在此所使用的，"核酸適體"是指一種可以形成能夠特異性結合到蛋白質或其他細胞靶標上 的二級和三級結構的小RNA或DNA分子(參見例如，倪(Ni)X等人，當今醫藥化學（Curr Med Chem) 18(27) :4206-4214,2011)。因此，在一些實施例中，BP-ΝΑ偶聯物可以是一種適體-核 酸偶聯物。
[0087] 本發明的一些實施例使用靶標識別部分來鑒定和標記靶標。靶標識別部分是特異 性識別樣品中感興趣的靶標的試劑。靶標識別部分的實例包括諸如在此列舉的那些的結合 配偶體。靶標識別部分包括抗體、抗體片段以及諸如單鏈抗體、單鏈Fv結構域、Fab結構域、 納米抗體等的抗體衍生物、肽、適體、以及寡核苷酸(例如，以便在諸如熒光原位雜交或FISH 的過程中檢測感興趣的核酸）。
[0088]諸如對接鏈的對接核酸
[0089] 本發明的某些實施例可涉及對接核酸。對接核酸包括如在此描述的對接鏈。對接 核酸是能夠結合到具有互補序列的核酸(諸如，成像核酸)上的線性核酸。對接核酸可包含 或可由DNA、RNA或具有其他磷酸酯-糖主鏈(例如2 ' -0-甲基RNA、2 ' -氟(2 ' -f luoral )RNA、 LNA、XNA)或包含非磷酸酯-糖部分的主鏈(例如，肽核酸和嗎啉代)的核酸樣結構構成。核堿 基可包括天然發生的核堿基，諸如腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、肌苷以及它們的衍生 物，以及非天然發生的核堿基，諸如丨8〇(：、丨8〇6、(1?以及(12。當未結合到它的互補成像核酸上 時，對接核酸可以是單鏈而沒有穩定的二級結構。可替代地，對接核酸可包括諸如發夾環的 二級結構（圖7,頂部）。對接核酸可以是多鏈復合物的一部分(圖7,底部）。
[0090] 如在此所使用的，"對接鏈"是指一種能夠穩定地結合到它的互補成像鏈上的單鏈 核酸(例如，DNA)。穩定的結合可以是對接鏈（以及相反的成像鏈）的長度的結果，或者它可 以是在其下發生雜交的具體條件(例如，鹽濃度、溫度等）的結果。在一些實施例中，對接鏈 的長度為約20至60個，或更多個核苷酸。對接鏈可以能夠結合到(具有相同序列和相同地標 記的）一個或多個相同的成像鏈上。
[0091] 諸如成像鏈的成像核酸
[0092] 本發明的某些實施例可涉及成像核酸。成像核酸包括如在此描述的成像鏈。成像 核酸是可以（1)經由序列特異的互補性與對接核酸相互作用，并且(2)通過共價或非共價相 互作用募集一個信號發射部分或多個信號發射部分拷貝的核酸。如在此說明的，成像核酸 可以是直鏈或支鏈的。一個成像核酸可經由一個聚合結構（圖8,頂部)或樹枝狀結構（圖8， 底部)募集多個信號發射部分拷貝。例如，可以使用諸如在納澤米(Nazemi)A.等人，生物偶 聯物的化學：合成、表征與生物醫學應用（Chemistry of Bioconjugates:Synthesis, Characterization,and Biomedical Applications)，在線發布：2014年2月 13 日）中討論的 方法以及其中提供的參考來化學合成聚合或樹枝狀結構。可替代地，可以通過如例如在德 克斯(Dirks)R.等人，美國國家科學院院刊，2004; 1010(43) :15275-78 ;以及在烏姆(Um) s.Η.等人，自然研究步驟(Nat.Protocols)2006; 1:995-1000(所述參考各自通過引用結合 在此)中示出的DNA雜交來形成聚合或樹枝狀結構。
[0093]成像核酸可包含或可由DNA、RNA或具有其他磷酸酯-糖主鏈(例如2'-0_甲基RNA、 2'-氟(2'-丨111〇^1)1?^、^^4~4)或包含非磷酸酯-糖部分的主鏈(例如，肽核酸和嗎啉代） 的核酸樣結構構成。核堿基可包括天然發生的核堿基，諸如腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧 啶、肌苷以及它們的衍生物，以及非天然發生的核堿基，諸如is 〇C、is〇G、dP以及dZ。
[0094] 在一些實施例中，成像核酸的長度為約30至約60個，或更多個核苷酸，包括30、35、 40、45、50、55或60核苷酸的長度。在一些實施例中，成像核酸的長度為30至40、30至50、40至 50、40至60、或50至60個核苷酸。
[0095] 當未結合到它的互補對接核酸上時，成像核酸可以是單鏈而沒有穩定的二級結 構。可替代地，成像核酸可包括諸如發夾環的二級結構（圖9,頂部）。成像核酸可以是多鏈復 合物的一部分(圖9,底部）。
[0096] 在一些實施例中，成像鏈可以是自淬滅的，這表明未結合的成像核酸可攜帶與信 號發射部分(諸如，熒光團）極為接近的淬滅劑部分。為了實現這個目的，成像核酸可以被設 計為采取一個分子信標樣的結構（圖5)或一個半雙鏈體的結構（圖6)。
[0097] 這種自淬滅變化可以用于簡化背景并且/或者避免洗滌步驟。另外地或可替代地， 結合與成像緩沖液可含有常規用于FI SH、RNA印跡法以及DNA印跡法中的添加劑(例如，帶負 電荷的聚合物(諸如葡聚糖硫酸鹽和肝素））以便減少非特異性結合。
[0098] 如在此所使用的"信號發射部分"是一個在某些條件下發射可檢測信號（諸如光 子、福射、正電子、電磁波、以及磁核共振)的部分。
[0099]如在此所使用的，"成像鏈"是一種長度為約30至約60個，或更多個核苷酸的單鏈 核酸(例如，DNA)。本發明的成像鏈互補于對接鏈并且穩定地結合到對接鏈上。穩定的結合 表明，成像鏈和對接鏈在測定的時長內、或者至少30分鐘、或至少60分鐘、或至少2小時、或 更久保持彼此結合。這種結合可以是或不是可逆的或不可逆的。
[0100] 在一些實施例中，如果核酸保持彼此結合(或至少）30、35、40、45、50、55或60分鐘 (min)，則認為對接核酸穩定地結合到成像核酸(諸如成像鏈)上。在一些實施例中，如果核 酸保持彼此結合（或至少）30至60min、30至120min、40至60min、40至120min、或60至120min， 則認為對接核酸穩定地結合到成像核酸上。這種結合可以是或不是可逆的，或者可以是或 不是不可逆的。
[0101]如在此所使用的，"結合"是指至少兩個分子之間歸因于例如靜電、疏水性、離子 和/或氫鍵相互作用，任選地在生理條件下的一種締合。
[0102] 如果兩個核酸或核酸結構域彼此堿基配對或結合以便經由沃森-克里克(Watson-Crick)相互作用形成一種雙鏈核酸，則它們是彼此"互補的"。
[0103] 在一些實施例中，本發明的核酸(諸如對接核酸和成像核酸）以"完美互補"彼此結 合，"完美互補"指的是100%互補(例如，5' -ATTCGC-3'完美互補于5'GCGAAT-3'）。
[0104] 本發明的成像鏈可用一種可檢測的標記(例如，一個熒光標記，并且因此被認為是 "熒光標記的"）來進行標記。例如，在一些實施例中，成像鏈可包含至少一個（即，一個或多 個)熒光團。根據本發明使用的熒光團的實例包括但不限于:咕噸衍生物(例如，熒光黃素、 羅丹明、俄勒閃綠、伊紅以及得克薩斯紅）、花青衍生物(例如，花青、吲哚碳菁、氧雜碳菁、硫 雜碳菁以及部花青）、萘衍生物(例如，丹磺酰和普羅丹(prodan)衍生物）、香豆素衍生物、噁 二唑衍生物（例如，吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑以及苯并噁二唑）、芘衍生物（例如，瀑布 藍）、噁嗪衍生物(例如，尼羅紅、尼羅藍、甲酚紫以及噁嗪170)、吖啶衍生物（例如，原黃素、 吖啶橙以及吖啶黃）、芳基次甲基(ary lmethine)衍生物(例如，金胺、結晶紫以及孔雀綠）、 以及四吡咯衍生物(例如，撲吩、酞菁以及膽紅素）。
[0105] 可用諸如在此列舉或本領域已知的那些的一種可檢測標記來共價地標記包括成 像鏈的成像核酸。在一些情況下，包括成像鏈的成像核酸可包括2、3、4、或更多個可檢測的 標記(諸如熒光團）。
[0106] 包括成像鏈的正交成像核酸可包含一個不同的標記(例如，紅色熒光團、藍色熒光 團、或綠色焚光團），或者它們可以全部包含相同的標記(例如，紅色焚光團），即使它們的核 苷酸序列不同。
[0107] 諸如結合配偶體和對接鏈偶聯物的序列標記的靶標識別部分
[0108] 在一些實施例中，本發明的BP-ΝΑ偶聯物(例如，蛋白質-核酸偶聯物)可包含一個 (例如，共價或非共價)將結合配偶體連接至對接鏈的中間接頭。該中間接頭可包含生物素 和/或鏈霉抗生物素蛋白。例如，在一些實施例中，一個抗體和一個對接鏈可各自被生物素 化(即，連接至少一個生物素分子)并且通過生物素結合至一個中間鏈霉抗生物素蛋白分子 來彼此連接。其他中間接頭可根據本發明進行使用。在一些實施例中，諸如其中分子是核酸 的那些實施例中，可能不需要中間接頭。例如，BP-ΝΑ偶聯物的對接鏈可以是一個核酸分子 (諸如，例如，一個核酸適體）的延伸(例如，5'或3'延伸）。類似的方法可用于產生如在此提 供的序列標記的靶標識別部分。
[0109] 在此提供多個BP-ΝΑ偶聯物(例如，蛋白質-核酸偶聯物)和成像鏈。多個可以是相 同物種或不同物種的一個群體。相同物種的多個BP-ΝΑ偶聯物可包括全部結合到相同靶標 (例如，生物分子）（例如，相同表位或區域/結構域)上的偶聯物。相反地，不同物種的多個 BP-ΝΑ偶聯物可包括偶聯物、或偶聯物的亞組，每個偶聯物或偶聯物的亞組結合到相同靶標 上的不同表位上或結合到不同靶標上。相同物種的多個成像鏈可包括具有相同核苷酸序列 和相同熒光標記(例如，Cy2、Cy3或Cy4)的成像鏈。相反地，不同物種的多個成像鏈可包括具 有不同核苷酸序列（例如，DNA序列）和不同熒光標記(例如，Cy2、Cy3或Cy4)，或者具有不同 核苷酸序列和相同熒光標記(例如，都是Cy2)的成像鏈。在一個給定的多個BP-ΝΑ偶聯物中 的不同物種的數目受到結合配偶體(例如，抗體）的數目和具有不同核苷酸序列的對接鏈 (并且因此互補成像鏈)的數目的限制。在一些實施例中，多個BP-ΝΑ偶聯物(例如，蛋白質-核酸偶聯物）包含至少 10、50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、104、50000、105、10 5、 106、107、108、109、10 1()、1011個BP-ΝΑ偶聯物。類似地，在一些實施例中，多個熒光標記的成像 鏈包含至少 10、50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、104、50000、105、10 5、106、107、108、 10^1(^^10 11個熒光標記的成像鏈。在一些實施例中，多個可含有1至約200個或更多個不同 物種的BP-ΝΑ偶聯物和/或成像鏈。例如，多個可以含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200或更多個不同 的物種。在一些實施例中，多個可含有少于約5至約200個不同物種的BP-ΝΑ偶聯物和/或成 像鏈。例如，多個可以含有小于5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、125、150、175或200個不同的物種。這些實施例適用于如在此提供的 序列標記的靶標識別部分。
[0110]信號或成像核酸滅活
[0111] 為了在在此提供的方法的一些中實現成像核酸滅活，可通過諸如但不限于升高溫 度;減小反離子(例如，游離Mg++)的濃度；引入或增大變性劑(例如甲酰胺、尿素、DMS0等）的 濃度；以及化學地、光化學地或酶促地裂解、修飾或降解成像鏈，或它們的任意組合的手段， 來將成像核酸(包括成像鏈)從靶標識別部分(包括結合配偶體)中去除（圖3)。
[0112] 為了在在此提供的方法的一些中實現成像核酸滅活，可通過去除并且/或者修飾 該信號發射部分而不將成像核酸的全部核酸部分從對接鏈去除來滅活這些成像核酸(包括 成像鏈）。（圖4.)
[0113] 作為一個實例，可通過將成像鏈裂解成多個部分來促進成像核酸的去除。在一些 實施例中，成像核酸包含一個化學可裂解部分，該化學可裂解部分可以通過引入作用于這 種可裂解部分上的化合物而裂解。此類化學可裂解部分的實例包括但不限于可以由某些基 于Pd的試劑裂解的烯丙基基團（周（Ju)J.等人，美國科學院院報，2006年12月26日；103 (52): 19635-40,該參考通過引用結合在此）；可以由某些基于磷的試劑(諸如TCEP)裂解的 疊氮基基團，（郭(Guo)J等人，美國科學院院報，2008年7月8日；105(27): 9145-50,該參考通 過引用結合在此）；可以由基于銀的試劑裂解的橋接硫代磷酸酯(瑪格(Mag)M.等人，核酸研 究(Nucleic Acids Res)，1991年4月11日；19(7) :1437-41，該參考通過引用結合在此）；可 由諸如DTT和TCEP的還原劑裂解的二硫鍵；以及可由諸如氫氧化物和咪唑的各種親核試劑 裂解的核糖。
[0114] 在一些實施例中，該成像核酸包含一種可以光化學地(例如，通過UV暴露)裂解的 可光裂解接頭。在一些實施例中，該成像核酸含有一個可以由一種酶裂解的部分。此類酶促 可裂解部分的實例包括但不限于可以由各種核糖核酸酶裂解的核糖核苷酸；可以由諸如 USER(新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs))的酶組合裂解的脫氧尿苷；以及可以 由序列特異性切口酶或限制性內切酶裂解的限制性酶切位點。在一些實施例中，該限制性 內切酶可裂解成像核酸和對接核酸兩者。在仍然其他實施例中，可通過將成像核酸修飾成 一種使對接核酸結合以便形成一個具有降低的穩定性(或降低的溶解溫度）的雙鏈體的形 式來促進成像核酸的去除。
[0115] 作為一個實例，該成像核酸包含可以光異構化的偶氮苯，其中不同異構體不同地 影響成像核酸對于對接核酸的結合強度（淺沼（Asanuma)H.等人，應用化學英語國際版 (Angew Chem Int Ed Engl)，2001 年7月 16日；40(14):2671-2673,該參考通過引用結合在 此）。在一些實施例中，該成像核酸包含一種脫氧尿苷，其中尿嘧啶基團可由尿嘧啶-DNA糖 基化酶裂解。在去除尿嘧啶后，成像鏈的結合強度減弱。
[0116] 可替代地，可以通過將成像核酸與信號發射部分之間的接頭（如果存在這樣的接 頭)裂解來實現信號發射部分的去除。在此描述的化學物質也可以用于此目的。
[0117] 可以通過化學地或光化學地修飾信號發射部分來實現該信號發射部分的滅活。例 如，當該信號發射部分是一個熒光團時，可以通過化學試劑（諸如例如過氧化氫，格迪斯 (Gerdes)M.等人，美國科學院院報2013年7月16日；110(29): 11982-87,該參考通過引用結 合在此)來將其漂白或對其進行光漂白（例如，使用如在舒伯特(SchuberOW.等人，自然生 物技術(Nat.Biotech. )2006;24:1270-78中描述的軟多波長激發，該參考通過引用結合在 此)。
[0118] 如在本領域中將理解的，"光漂白"是指一個染料或熒光團分子的光化學改變，從 而使得它不能發出熒光。這是由熒光團與周圍分子之間的共價鍵裂解或非特異性反應而導 致的。在一些實施例中，可以通過降低曝光的強度或時間間隔，通過增大熒光團的濃度，通 過降低輸入光的頻率并因此降低其光子能量，或者通過采用不太容易漂白的更加牢固的熒 光團（例如Alexa Fluors或DyLight Fluors)，來控制由光漂白導致的活性損失。參見，例 如，Ghauharali R.等人，顯微鏡學雜志（Journal of Microscopy)2001; 198:88-100;和格 林(Eggeling)C.等人，分析化學(Analytical Chemistry) 1998;70:2651-59。
[0119] 因此，光漂白可用于去除、修飾或在一些情況下消滅來自信號發射部分的信號。可 通過將熒光團暴露于具有適合波長、能量和持續時間的光的波長來進行光漂白，以便永久 且不可逆地消滅熒光團進一步發射信號的能力。光漂白技術是本領域中已知的。
[0120] 還發現，與通常能夠在低于生理溫度的寬范圍溫度（即，0°C至37°C)下結合到它們 的靶標上并且可以忍受鹽濃度的輕微變化（即，從10mM至1M的單價陽離子濃度;從0至10mM 的二價陽離子濃度）的抗體不同，短核酸雜交的親和力取決于溫度和鹽濃度。例如，在23°C 下，在具有5〇〇mM[Na+]和1 OmM[Mg++]濃度下，ssDNA 5 '-CATCTAAAGCC-3 '與它的反向互補鏈 5'-GGCTTTAGATG-3'之間的預測解離常數（使用參考PMID 15139820概述的參數集）是~ 90pM。換句話說，在此條件下，該結合是非常強的。在37°C下，在具有150mM[Na+]和0mM[Mg+ + ]下，此ssDNA對的預測解離常數高達~500nM。換句話說，在此條件下，該結合是相當弱的。 這兩種條件的解離常數改變近4個數量級，盡管預期大多數抗體在兩種條件下都強力地結 合到它們的靶標上。針對其他DNA序列觀察到類似的趨勢（圖10)。作為一個另外的實例，成 像條件可以是23°C、具有500mM[Na+]和10mM[Mg++]，并且染料滅活條件可以是37°C、具有 150mM[Na+]和0mM[Mg++]。
[0121] 在一些實施例中，被分析的樣品是培養的細胞、組織切片、或來自活生物體的其他 樣品。
[0122] 在一些實施例中，該樣品是固定(包括單獨固定)在一個固體表面(例如，玻璃載片 或蓋玻片)上的解離細胞。例如，樣品可以是血液中的細胞。例如，樣品可含有在血液中循環 的癌細胞(也稱為循環腫瘤細胞，或CTC)。樣品可以是在懸浮液中生長的細胞。樣品可以是 從一個固體組織散播的細胞。
[0123] 樣品
[0124] "樣品"可包括細胞（或一個細胞）、組織、或諸如血液(血清和/或血漿）、尿液、精 液、淋巴液、腦脊髓液或羊水的體液。樣品可得自（或來源于)任何來源，包括但不限于人類、 動物、細菌、病毒、微生物以及植物。在一些實施例中，樣品是細胞裂解物或組織裂解物。樣 品還可含有來自一個來源或不同來源的材料的混合物。樣品可以是一個空間區域或體積 (例如，一個陣列上的網格、或一個板或盤中的孔）。在一些實施例中，樣品包括一個或多個 靶標、一個或多個BP-ΝΑ偶聯物、以及一個或多個成像鏈。這些細胞可以是散播的（或解離 的)細胞。
[0125] 靶標
[0126] "靶標"是希望觀察或量化并且存在其結合配偶體的任何部分。在一些實施例中， 靶標可以是非天然存在的。在一些實施例中，靶標可以是一種生物分子。如在此所使用的， "生物分子"是可由一個活生物體產生的任何分子，包括大的大分子，諸如蛋白質、多糖、月旨 質以及核酸(例如，DNA和RNA(諸如mRNA))，以及小分子，諸如初級代謝產物、次級代謝產物、 以及天然產物。生物分子的實例包括但不限于:〇嫩3祖、〇0嫩、或經受逆轉錄的8祖的0嫩產 物、A23187(卡西霉素、鈣離子載體）、阿維菌素、松香酸、醋酸、乙酰膽堿、肌動蛋白、放線菌 素 D、腺苷、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷一磷酸(AMP)、腺苷三磷酸(ATP)、腺苷酸環化酶、側金盞 花醇、腎上腺素(Adrenaline)、腎上腺素(epinephrine)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、水母發 光蛋白（Aequorin)、黃曲霉毒素、瓊脂、丙甲菌素、丙氨酸、白蛋白、醛固酮、糊粉 (Aleuroneha-毒蕈環肽、尿囊素、丙烯菊酯、α-鵝膏蕈堿(α-Amanatin)、氨基酸、淀粉酶、促 蛋白合成類固醇(Anabolic steroid)、茴香腦、血管緊張素原、茴香霉素、抗利尿素(ADH)、 阿拉伯糖、精氨酸、子囊霉素、抗壞血酸(維生素 C)、天冬酰胺、天冬氨酸、不對稱二甲基精氨 酸、心房鈉尿肽(ANP)、生長素、抗生物素蛋白、印楝素 A-C35H44016、細菌素、白僵菌素、荷苞 牡丹堿、膽紅素、生物聚合物、生物素(維生素 H)、布雷菲德菌素 A、布拉西諾內酯、馬錢子堿、 尸胺、咖啡因、鈣化醇(維生素 D)、降鈣素、鈣調蛋白、鈣調蛋白、鈣網蛋白、樟腦-(C10H160)、 大麻酚、辣椒素、糖酶、碳水化合物、肉毒堿、角叉菜膠、酪蛋白、半胱天冬酶、纖維素酶、纖維 素-(C6H1005)、淺藍菌素、西曲溴銨(Cetrimide)-C19H42BrN、白屈菜赤堿、色霉素 A3、伴侶 蛋白、甲殼質、氯醛糖、葉綠素、縮膽囊素(CCK)、膽固醇、膽堿、硫酸軟骨素、肉桂醛、檸檬 醛、檸檬酸、橘霉素、香茅醛、香茅醇、瓜氨酸、鈷胺素(維生素 Β12)、輔酶、輔酶Q、秋水仙堿、 膠原質、毒芹堿、皮質類固醇、皮質酮、促腎上腺皮質素釋放激素(CRH)、皮質醇、肌酸、肌酸 激酶、晶狀體蛋白、α-環糊精、環糊精糖基轉移酶、環巴胺、環匹阿尼酸、半胱氨酸、胱氨酸、 胞啶、細胞松弛素、細胞松弛素 Ε、細胞色素、細胞色素 C、細胞色素 c氧化酶、細胞色素 c過氧 化物酶、細胞因子、胞嘧啶-C4H5N30、脫氧膽酸、D0N(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）、脫氧呋喃核糖、 脫氧核糖、脫氧核糖核酸（DNA)、右旋糖酐、糊精、DNA、多巴胺、酶、麻黃素、腎上腺素-C9H13N03、芥酸-CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11C00H、赤蘚糖醇、促紅細胞生成素(EP0)、雌二醇、 丁子香酚、脂肪酸、纖維蛋白、纖連蛋白、葉酸（維生素 M)、促卵泡激素(FSH)、甲醛、甲酸、 Formnoci、果糖、伏馬菌素 B1、丙種球蛋白、半乳糖、丙種球蛋白、γ -氨基丁酸、γ -丁內酯、 γ-羥基丁酸酯（GHB)、胃泌素、明膠、香葉醇、球蛋白、胰高血糖素、葡萄糖胺、葡萄糖-C6H1206、葡糖氧化酶、谷蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、谷蛋白、甘油（丙三醇）、甘氨 酸、糖原、乙醇酸、糖蛋白、促性腺激素釋放激素(GnRH)、粒酶、綠色熒光蛋白質、生長激素、 生長激素釋放激素(GHRH)、GTP酶、鳥嘌呤、鳥苷、鳥苷三磷酸(+GTP)、觸珠蛋白、蘇木精、血 紅素、蚯蚓血紅蛋白、血藍蛋白、血紅蛋白、血紅素蛋白、硫酸乙酰肝素、高密度脂蛋白、HDL、 組胺、組氨酸、組蛋白、組蛋白甲基轉移酶、HLA抗原、高半胱氨酸、激素、絨毛膜促性腺激素 (hCG)、人類生長激素、透明質酸鹽、透明質酸酶、過氧化氫、5-羥甲基胞嘧啶、羥基脯氨酸、 5-羥色胺、靛藍染料、吲哚、肌苷、肌醇、胰島素、胰島素樣生長因子、膜內在蛋白、整合酶、整 合蛋白、內含肽、干擾素、菊粉、離子霉素、紫羅酮、異亮氨酸、鐵硫簇、K252a、K252b、KT5720、 ΚΤ5823、角蛋白、激酶、乳糖酶、乳酸、乳糖、羊毛脂、月桂酸、瘦素、來普霉素 Β、亮氨酸、木質 素、檸檬烯、芳樟醇、亞油酸、亞麻酸、脂肪酶、脂質、脂質錨定蛋白、硫辛酰胺、脂蛋白、低密 度脂蛋白LDL、促黃體生成素(LH)、番茄紅素、賴氨酸、溶菌酶、蘋果酸、麥芽糖、褪黑激素、膜 蛋白、金屬蛋白、金屬硫蛋白、蛋氣酸、含羞草氣酸、光神霉素 Α、絲裂霉素 C、單體、霉酸酸、肌 紅蛋白、肌球蛋白、天然酚類、核酸、赭曲霉毒素 Α、雌激素、寡肽、寡霉素、地衣酚、阿立新素、 鳥氨酸、草酸、氧化酶、催產素、P53、PABA、紫杉醇、棕櫚酸、泛酸(維生素 B5)、甲狀旁腺激素 (PTH)、副蛋白、摩西魚毒肽、小白菊內酯、展青霉素、蕈青霉素、青霉酸、盤尼西林、青霉震顫 素 A、肽酶、胃蛋白酶、肽、表霉素、外周膜蛋白、Perosamine、苯乙胺、苯丙氨酸、磷酸肌酸、磷 酸酶、磷脂、苯丙氨酸、植酸、植物激素、多肽、多酚、多糖、撲啉、朊病毒、黃體酮、促乳素 (PRL)、脯氨酸、丙酸、魚精蛋白、蛋白酶、蛋白質、類蛋白、腐胺、除蟲菊酯、吡哆醇或吡哆胺 (維生素 B6)、吡咯賴氨酸、丙酮酸、醌、根赤殼菌素、棉子糖、腎素、視黃醛、視黃醇(維生素 A)、視紫紅(視紫紅質）、核黃素(維生素 B2)、呋喃核糖、核糖、核酶、蓖麻毒蛋白、RNA-核糖核 酸、RuBisCO、黃樟素、水楊醛、水楊酸、丹酸-4(3&1￥；[1101'；[11-4)-023!12808、阜苷、分泌素、硒 代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、含硒蛋白質、絲氨酸、絲氨酸激酶、血清素、糞臭素、信號識別顆 粒、生長抑素、山梨酸、角鯊烯、星形孢菌素、硬脂酸、雜色曲霉素、留醇、番木鱉堿 (Strychnine)、蔗糖(糖）、糖類(一般來說）、超氧化物、T2毒素、鞣酸、丹寧酸、酒石酸、牛磺 酸、河豚毒素、奇甜蛋白、拓撲異構酶、酪氨酸激酶、牛磺酸、睪酮、四氫大麻酚(THC)、河豚毒 素、毒胡蘿卜素、奇甜蛋白、硫胺素(維生素 B1)_C12H17C1N40S · HC1、蘇氨酸、促血小板生成 素、胸苷、胸腺嘧啶、三氮菌素 C、促甲狀腺激素(TSH)、促甲狀腺素釋放激素(TRH)、甲狀腺素 (T4)、生育酚(維生素 E)、拓撲異構酶、三碘甲腺原氨酸(T3)、跨膜受體、曲古抑菌素 A、促激 素、胰蛋白酶、色氨酸、微管蛋白、衣霉素、酪氨酸、泛激素、尿嘧啶、尿素、脲酶、尿酸-C5H4N403、尿苷、繳氨酸、繳氨霉素、f凡綁定蛋白（Vanabins )、加壓素、震顫真菌毒素 (Verruculogen)、維生素(一般來說）、維生素 A(視黃醇）、維生素 B、維生素 Bl(硫胺素）、維生 素 B2(核黃素）、維生素 B3(煙酸或尼克酸）、維生素 B4(腺嘌呤）、維生素 B5(泛酸）、維生素 B6 (吡哆醇或吡哆胺）、維生素 B12(鈷胺素）、維生素 C(抗壞血酸）、維生素 D(鈣化醇）、維生素 E (生育酚）、維生素 F、維生素 H(生物素）、維生素 K(萘醌）、維生素 Μ(葉酸）、渥曼青霉素以及木 糖。
[0127]在一些實施例中，一個靶標可以是一個蛋白質靶標，諸如例如，一種細胞環境的蛋 白質（例如，細胞內的或膜蛋白）。蛋白質的實例包括但不限于:纖維狀蛋白質，諸如細胞支 架蛋白質（例如，肌動蛋白、arp2/3、冠蛋白、肌養蛋白、FtsZ、角蛋白、肌球蛋白、伴肌動蛋 白、血影蛋白、tau蛋白、肌聯蛋白、原肌球蛋白、微管蛋白以及Jj父原質），以及細胞外基質蛋 白（例如，膠原質、彈性蛋白、底板反應蛋白（f-spondin)、皮卡丘素(pikachurin)、以及纖連 蛋白）；球狀蛋白質，諸如血漿蛋白質（例如，血清淀粉樣蛋白P成分和血清白蛋白）、凝血因 子(例如，補體蛋白質、C1-抑制劑以及C3-轉化酶、因子VIII、因子XIII、纖維蛋白、蛋白質C、 蛋白質S、蛋白質Z、蛋白質Z相關蛋白酶抑制劑、凝血酶、血管假性血友病因子），以及急性期 蛋白質，諸如C反應蛋白質；血紅素蛋白；細胞粘附蛋白（例如，|丐粘蛋白、室管|旲蛋白 (ependymin)、整合蛋白、Ncam以及選擇蛋白）；跨膜運輸蛋白質(例如，CFTR、血型糖蛋白D和 混雜酶(scramblase))，諸如離子通道(例如，配體門控離子通道，諸如煙堿型乙酰膽堿受體 和GABAa受體，以及電壓門控離子通道，諸如鉀、鈣和鈉通道），同向運輸/反向運輸蛋白質 (例如，葡萄糖轉運蛋白）；激素和生長因子(例如，表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因 子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、肽類激素（諸如胰島素、胰島素樣生長因子以及催產 素）以及類固醇激素(諸如雄激素、雌激素和黃體酮）；受體，諸如跨膜受體(例如，G蛋白偶聯 受體、視紫紅)和細胞內受體(例如，雌激素受體）;DNA結合蛋白質(例如，組蛋白、魚精蛋白、 CI蛋白）；轉錄調節物(例如，(3-1^(：、？(^?2^(??3、1^〇0以及？53);免疫系統蛋白質（例如，免 疫球蛋白、主要組織相容性抗原以及T細胞受體）；營養物儲存/轉運蛋白質(例如，鐵蛋白）； 伴侶蛋白；以及酶。
[0128] 在一些實施例中，靶標可以是一種核酸靶標，諸如，例如，細胞環境的核酸。如關于 靶標、對接鏈、以及成像鏈在此使用的，"核酸"是指具有任何長度的核苷酸的聚合物形式， 諸如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或它們的類似物。例如，核酸可以是DNA、RNA、或經受逆 轉錄的RNA的DNA產物。核酸的非限制性實例包括:基因或基因片段的編碼或非編碼區、由連 鎖分析限定的基因座、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重 組核酸、支化核酸、質粒、載體、具有任何序列的分離DNA、具有任何序列的分離RNA、核酸探 針、以及引物。核酸的其他實例包括但不限于:cDNA、適體、肽核酸（叩祖"）、2'-5'0嫩(一種 具有縮短主鏈的合成材料，該主鏈具有匹配DNA的A構象的堿基間隔；2'-5'DNA通常將不會 與為B形式的DNA雜交，但它將容易地與RNA雜交）、鎖核酸（"LNA"）、以及具有修飾主鏈的核 酸(例如，天然存在的核酸的堿基修飾或糖修飾形式）。核酸可包含修飾的核苷酸，諸如甲基 化的核苷酸和核苷酸類似物(嘌呤和嘧啶的"類似"形式在本領域中是熟知的）。如果存在對 核苷酸結構的修飾，那么在組裝聚合物之前或之后進行。核酸可以是一種單鏈、雙鏈、部分 單鏈、或部分雙鏈的DNA或RNA。
[0129] 在一些實施例中，核酸(例如，核酸靶標)是天然存在的。如在此所使用的，"天然存 在"是指一種在沒有人為干預的情況下，存在于在自然界中存在的生物體或病毒中的核酸。 在一些實施例中，核酸天然存在于一種生物體或病毒中。在一些實施例中，核酸是基因組 DNA、信使RNA、核糖體RNA、微小RNA、前微小RNA( pre-mi cr〇-RNA)、原微小RNA(pr〇-micr〇-RNA)、病毒DNA、病毒RNA或piwi-RNA。在一些實施例中，核酸靶標不是一種合成DNA納米結構 (例如，包含通過沃森-克里克相互作用彼此雜交以形成2-D或3-D納米結構的兩個或更多個 核酸的二維(2-D)或三維(3-D)DNA納米結構）。
[0130] 在此描述的核酸對接鏈和成像鏈可以是以上描述的核酸(例如，DNA、RNA、修飾核 酸、核酸類似物、天然存在的核酸、合成核酸）中的任意一種。
[0131] 組合物
[0132] 在此提供的組合物包含至少一個或至少兩個(例如，多個)本發明的BP-ΝΑ偶聯物 (例如，蛋白質-核酸偶聯物）ΑΡ-ΝΑ偶聯物可結合到一個感興趣的靶標(例如，生物分子)上 并且/或者穩定結合到一個互補的熒光標記的成像鏈上。組合物可包含多個相同物種或不 同物種的BP-ΝΑ偶聯物。在一些實施例中，一種組合物可包含至少10、50、100、500、1000、 2000、3000、4000、5000、10 4、50000、105、105、106、107、10 8、109、101()、1011個8?-嫩偶聯物。在一 些實施例中，一種組合物可包含至少 1〇、50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、104、 5000(^10^10^10^10^10^10^1(^^10 11個互補的熒光標記的成像鏈。在一些實施例中， 一種組合物可含有1至約200個或更多個不同物種的BP-ΝΑ偶聯物和/或成像鏈。例如，一種 組合物可以含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、125、150、175、200或更多個不同的物種。在一些實施例中，一種組合 物可含有少于約5至約200個不同物種的BP-ΝΑ偶聯物和/或成像鏈。例如，一種組合物可以 含有小于5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、 125、150、175或200個不同的物種。
[0133] 應當理解，組合物中的互補的熒光標記的成像鏈的數目可小于、等于或大于組合 物中BP-ΝΑ偶聯物的數目。
[0134]試劑盒
[0135] 本發明進一步提供包括一種或多種本發明組分的試劑盒。試劑盒可包括，例如， BP-ΝΑ偶聯物和/或熒光標記的成像鏈。試劑盒還可包括用于產生BP-ΝΑ偶聯物或用于標記 成像鏈的組分。例如，試劑盒可包括結合配偶體(例如，抗體）、對接鏈和中間接頭(諸如，例 如，生物素和鏈霉抗生物素蛋白分子）、和/或成像鏈。試劑盒可以用于本領域技術人員明顯 知曉的目的，包括以上描述的那些。
[0136] 試劑盒可包括其他試劑，以及例如，用于進行雜交反應的緩沖液。試劑盒還可包括 用于使用試劑盒組分、和/或用于制作和/或使用BP-ΝΑ偶聯物和/或經標記成像鏈的說明 書。
[0137] 應用
[0138] 本發明的BP-ΝΑ偶聯物(例如，蛋白質-核酸偶聯物或抗體-核酸偶聯物)可以尤其 在其中使用現有的靶標檢測技術的任何測定中使用。
[0139] 典型地，測定包括以下檢測測定:包括診斷測定、預后測定、患者監測測定、篩選測 定、生物戰測定、法醫分析測定、產前基因診斷測定等。該測定可以是一種體外測定或一種 體內測定。本發明提供以下優勢:可以使用本發明的方法從一個單一樣品同時分析許多不 同的靶標，即使是當其中此類靶標使用現有技術成像方法在空間上不可分辨(并且因此空 間上難辨認的)時。這允許例如在一個樣品上進行幾個診斷試驗。
[0140] BP-ΝΑ偶聯物還可以用于簡單地觀察一個區域或區。
[0141] 可將本發明的方法應用于分析得自或來源于患者的樣品，以便確定一個病變的細 胞類型是否存在于該樣品中并且/或者對該疾病進行分期。例如，可以根據在此描述的任何 方法來測定一個血液樣品，以便確定樣品中一個癌變細胞類型的標記物的存在和/或量，由 此對該癌癥進行診斷或分期。
[0142] 可替代地，在此描述的這些方法可以用于通過分別確定樣品中細菌或病毒的標記 物的存在和/或量來診斷病原體感染，例如，由細胞內細菌和病毒引起的感染。因此，使用本 發明的組合物和方法檢測的靶標可以是患者標記物(諸如一種癌癥標記物)或被一種外部 試劑感染的標記物，諸如細菌或病毒標記物。
[0143] 本發明的定量成像方法可用于例如，量化其豐度指示生理狀態或疾病病狀的靶標 (例如，靶標生物分子)（例如，被上調或下調作為一種疾病狀態的結果的血液標記物）。
[0144] 另外，本發明的組合物和方法可用于提供有助于確定患者療程的預后信息。例如， 可以從來自患者的甚至一個小的樣品來準確地量化用于腫瘤的一個具體標記物的量。對于 某些疾病(像乳腺癌），某些蛋白質(諸如Her2-n eU)的過量表達表明將需要一種更加積極的 療程。
[0145] 本發明的方法還可以用于確定擾動(包括化合物、突變、溫度改變、生長激素、生長 因子、疾病、或培養條件的改變)對于不同靶標的影響，由此鑒定其存在、缺乏或水平指示具 體生物學狀態的靶標。在一些實施例中，本發明用于闡明和發現疾病狀態的組分和通路。例 如，存在于一個疾病組織與"正常"組織中的靶標的量的比較允許說明涉及疾病的重要靶 標，由此鑒定用于發現/篩選可以用于治療疾病的新型藥物候選物的靶標。
[0146] 所分析的樣品可以是一個生物樣品，諸如血液、唾液、淋巴、粘液、糞便、尿液等。該 樣品可以是一種環境樣品，諸如水樣品、空氣樣品、食物樣品等。可以使用結合反應的被固 定的一種或多種組分進行該測定。因此，靶標或BP-ΝΑ偶聯物可以是固定的。可以使用結合 反應的非固定的一種或多種組分進行該測定。鑒于由本發明的BP-ΝΑ偶聯物和熒光標記的 成像鏈所提供的多路復用潛力，這些測定可涉及基本上同時檢測一個樣品中的多個靶標。 作為一個實例，一種測定可用于檢測一種具體細胞類型(例如，基于一種特定的細胞表面受 體)和在該具體細胞類型中的一種具體基因突變。以此方式，作為一個實例，最終用戶可以 能夠確定一種具體類型的多少細胞攜帶感興趣的突變。
[0147] 不同實施例
[0148] 本披露提供包括但不限于以下編號實施例的多個實施例：
[0149] 1. 一種方法，包括
[0150] (1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進行測試的樣品與一個或多個靶標特 異性結合配偶體接觸，其中每個靶標特異性結合配偶體連接至一個對接鏈，并且其中具有 不同特異性的靶標特異性結合配偶體連接至不同對接核鏈，
[0151] (2)任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體，
[0152] (3)使該樣品與具有互補于一個對接鏈的核苷酸序列的經標記成像鏈接觸，
[0153] (4)任選地去除未結合的經標記成像鏈，
[0154] (5)將該樣品成像以便檢測結合的經標記成像鏈的位置和數目，
[0155] (6)猝滅來自結合的經標記成像鏈的信號，以及
[0156] (7)重復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像鏈來說具有獨特 核苷酸序列的經標記成像鏈。
[0157] 2.如實施例1所述的方法，其中該樣品在步驟(1)中與多于一個的靶標特異性結合 配偶體接觸。
[0158] 3.如實施例1或2所述的方法，其中該靶標特異性結合配偶體是一種抗體或抗體片 段。
[0159] 4.如實施例1-3中任一項所述的方法，其中這些經標記成像鏈是被相同地標記的。
[0160] 5.如實施例1-3中任一項所述的方法，其中這些經標記成像鏈各自包含一個不同 的標記。
[0161] 6.如實施例1-5中任一項所述的方法，其中這些經標記成像鏈是熒光標記的成像 鏈。
[0162] 7.如實施例1-6中任一項所述的方法，其中該一個或多個靶標是蛋白質。
[0163] 8.如實施例1-7中任一項所述的方法，其中該樣品是細胞、細胞裂解物或組織裂解 物。
[0164] 9.如實施例1-8中任一項所述的方法，其中使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術在 步驟(5)中將該樣品成像。
[0165] 10.如實施例1-9中任一項所述的方法，其中步驟(6)中的猝滅信號包括光漂白。
[0166] 11.-種組合物，包含：
[0167] 結合到多于一個的靶標特異性結合配偶體上的一個樣品，每個結合配偶體結合到 一個對接鏈上，以及
[0168] 至少一個穩定地結合到一個經標記成像鏈上的對接鏈。
[0169] 12. -種方法，包括
[0170] (1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進行測試的樣品與一個或多個靶標特 異性結合配偶體接觸，其中每個靶標特異性結合配偶體連接至一個對接核酸，并且其中具 有不同特異性的靶標特異性結合配偶體連接至不同對接核酸，
[0171] (2)任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體，
[0172] (3)使該樣品與具有互補于一個對接核酸的核苷酸序列的經標記成像核酸接觸，
[0173] (4)任選地去除未結合的經標記成像核酸，
[0174] (5)將該樣品成像以便檢測結合的經標記成像核酸的位置和數目，
[0175] (6)將結合的經標記成像核酸從對接核酸去除，并且
[0176] (7)重復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像核酸來說具有獨 特核苷酸序列的經標記成像核酸。
[0177] 13.如實施例12所述的方法，其中該樣品在步驟（1)中與多于一個的靶標特異性結 合配偶體接觸。
[0178] 14.如實施例12或13所述的方法，其中該靶標特異性結合配偶體是一種抗體或抗 體片段。
[0179] 15.如實施例12或13所述的方法，其中該靶標特異性結合配偶體是天然或工程化 的配體、小分子、適體、肽或寡核苷酸。
[0180] 16.如實施例12-15中任一項所述的方法，其中這些經標記成像核酸是被相同地標 記的。
[0181] 17.如實施例12-15中任一項所述的方法，其中這些經標記成像核酸各自包含一個 不同的標記。
[0182] 18.如實施例12-17中任一項所述的方法，其中這些經標記成像核酸是熒光標記的 成像核酸。
[0183] 19.如實施例12-18中任一項所述的方法，其中該一個或多個靶標是蛋白質。
[0184] 20.如實施例12-19中任一項所述的方法，其中該樣品是細胞、細胞裂解物或組織 裂解物。
[0185] 21.如實施例12-20中任一項所述的方法，其中使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術 在步驟(5)中將該樣品成像。
[0186] 22.如實施例12-21中任一項所述的方法，其中這些經標記成像核酸是通過減小鹽 濃度、添加變性劑、或提高溫度從對接核酸去除的。
[0187] 23.如實施例22所述的方法，其中該鹽是Mg++。
[0188] 24.如實施例22所述的方法，其中該變性劑是甲酰胺、尿素或DMS0。
[0189] 25.如實施例12-21中任一項所述的方法，其中在一個競爭核酸的存在下，不通過 鏈置換將經標記成像核酸從對接核酸去除。
[0190] 26.如實施例12-21中任一項所述的方法，其中通過化學法、光化學法或酶促法裂 解、修飾或降解經標記成像核酸，將經標記成像核酸從對接核酸去除。
[0191 ] 27.如實施例12-21中任一項所述的方法，其中當經標記成像核酸結合到其對應的 對接核酸上時，在成像核酸或對接核酸上不存在單鏈區。
[0192] 28.如實施例12-21中任一項所述的方法，其中該經標記成像核酸不是自淬滅的。
[0193] 2 9 .如實施例12 - 2 8中任一項所述的方法，其中該未結合的對接核酸是部分雙鏈 的。
[0194] 30.如實施例12-28中任一項所述的方法，其中該未結合的成像核酸是部分雙鏈 的。
[0195] 31.如實施例12-28中任一項所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標或者包 括一個發夾二級結構。
[0196] 32.如實施例12-27和29-31中任一項所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信 標或者包括一個自淬滅的發夾二級結構。
[0197] 33.如實施例12-28中任一項所述的方法，其中該成像核酸是一個半雙鏈體。
[0198] 34.如實施例33所述的方法，其中該半雙鏈體是自淬滅的。
[0199] 35.如實施例12-34中任一項所述的方法，其中該對接核酸包括一個發夾二級結 構。
[0200] 36.如實施例12-35中任一項所述的方法，其中該成像核酸是通過一個樹枝狀結構 或一個聚合結構結合到多個信號發射部分上。
[0201] 34. -種方法，包括
[0202] (1)使一個有待針對一個或多個靶標的存在進行測試的樣品與一個或多個靶標特 異性結合配偶體接觸，其中每個靶標特異性結合配偶體連接至一個對接核酸，并且其中具 有不同特異性的靶標特異性結合配偶體連接至不同對接核酸，
[0203] (2)任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體，
[0204] (3)使該樣品與具有互補于一個對接核酸的核苷酸序列的經標記成像核酸接觸，
[0205] (4)任選地去除未結合的經標記成像核酸，
[0206] (5)將該樣品成像以便檢測結合的經標記成像核酸的位置和數目，
[0207] (6)通過去除或修飾它們的信號發射部分而不完全去除成像核酸來滅活結合的經 標記成像核酸，并且
[0208] (7)重復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像核酸來說具有獨 特核苷酸序列的經標記成像核酸。
[0209] 35.如實施例34所述的方法，其中該樣品在步驟（1)中與多于一個的靶標特異性結 合配偶體接觸。
[0210] 36.如實施例34或35所述的方法，其中該靶標特異性結合配偶體是一種抗體或抗 體片段。
[0211] 37.如實施例34或35所述的方法，其中該靶標特異性結合配偶體是天然或工程化 的配體、小分子、適體、肽或寡核苷酸。
[0212] 38.如實施例34-37中任一項所述的方法，其中這些經標記成像核酸是被相同地標 記的。
[0213] 39.如實施例34-37中任一項所述的方法，其中這些經標記成像核酸各自包含一個 不同的標記。
[0214] 40.如實施例34-39中任一項所述的方法，其中這些經標記成像核酸是熒光標記的 成像核酸。
[0215] 41.如實施例34-40中任一項所述的方法，其中該一個或多個靶標是蛋白質。
[0216] 42.如權利要求34-41中任一項所述的方法，其中該樣品是細胞、細胞裂解物或組 織裂解物。
[0217] 43.如實施例34-42中任一項所述的方法，其中使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術 在步驟(5)中將該樣品成像。
[0218] 44 .如實施例34-43中任一項所述的方法，其中該未結合的對接核酸是部分雙鏈 的。
[0219] 45.如實施例34-43中任一項所述的方法，其中該未結合的成像核酸是部分雙鏈 的。
[0220] 46.如實施例34-45中任一項所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標或者包 括一個發夾二級結構。
[0221] 47.如實施例34-45中任一項所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標或者包 括一個自淬滅的發夾二級結構。
[0222] 48.如實施例34-45中任一項所述的方法，其中該成像核酸是一個半雙鏈體。
[0223] 49.如實施例48所述的方法，其中該半雙鏈體是自淬滅的。
[0224] 50.如實施例34-49中任一項所述的方法，其中該對接核酸包括一個發夾二級結 構。
[0225] 51.如實施例34-50中任一項所述的方法，其中該成像核酸是通過一個樹枝狀結構 或一個聚合結構結合到多個信號發射部分上。
[0226] 等效形式
[0227] 盡管已經在此描述并展示幾個發明實施例，但本領域普通技術人員將容易想象用 于執行功能和/或獲得結果和/或在此描述的優點中的一個或多個的多種其他裝置和/或結 構，并且此類變型和/或修改中的每一個被視為是在在此描述的發明實施例的范圍內。更一 般地說，本領域的技術人員將容易理解，在此描述的所有參數、尺寸、材料以及配置意味著 為示例性的，并且實際參數、尺寸、材料和/或配置將取決于發明傳授內容所用于的一種或 多種具體應用。本領域的技術人員僅僅使用常規實驗將認識到或能夠確認在此描述的具體 發明實施例的許多等效物。因此，應了解，前述實施方案是僅藉助于實例來呈現，并且在所 附權利要求書和其相等形式的范圍內，發明實施例可以按與具體地描述和要求不同的方式 實踐。本披露的發明實施例涉及在此描述的每個單獨特征、系統、物品、材料、套件和/或方 法。此外，如果此類特征、系統、物品、材料、套件和/或方法并不相互矛盾，兩個或更多個此 類特征、系統、物品、材料、套件和/或方法的任意組合包括在本披露的發明范圍內。在此限 定并使用的所有定義應當被理解成凌駕于所限定術語的字典定義、通過引用而結合的文件 中的定義、和/或一般含義。
[0228] 在此披露的所有參考文獻、專利和專利申請都相對于每個被引用的主題通過引用 而結合，這在某些情況下可以包括文件的全部內容。
[0229] 除非清楚地作相反指示，否則在說明書中和在權利要求中，如在此使用的不定冠 詞"一個/種)"（a/an)應當理解為意思指"至少一個(種)"。
[0230] 在說明書中和在權利要求中，如在此使用的短語"和/或"應當理解為意思指如此 聯在一起的要素中的"任何一個或兩個"，即，要素在一些情形中聯合地存在并且在其他情 形中分離性地存在。用"和/或"列出的多個元素應當以相同的方式來解釋，即，這樣結合的 元素中的"一個或多個"。除了由"和/或"從句具體識別的元素，其他元素可以任選地存在， 無論是與具體識別的那些元素相關還是不相關。因此，作為非限制性實例，當結合開放式語 言諸如"包括"使用時，對"A和/或B"的提及可以在一個實施例中僅指A(任選地包括除了B的 元素）；在另一個實施例中，僅指B(任選地包括除了A的元素）；在又一個實施例中，指A和B (任選地包括其他元素）；等等。
[0231] 在說明書中和在權利要求中，如在此使用的"或"應理解為具有與如以上所定義的 "和/或"相同的含義。例如，當分隔一個清單中的項目時，"或"或"和/或"應當解釋為包容性 的，即，包括多個元素或元素清單中的至少一個，而且包括其中的多于一個，以及任選地，另 外的未列出的項目。僅相反地清楚指示的術語，諸如"……中的僅一個"或"……中的恰好一 個"，或者當用于權利要求中時，"由……組成"將指恰好包括一些或一列元素中的一個元 素。總體而言，如在此使用的術語"或"當前面加有排他性的術語，諸如"任何一個"、"……中 一個"、"……中僅一個"或"……中只有一個"時，應當僅解釋為指示排他性的替代形式（BP， "一個或另一個，但非兩者主要由……組成"當用于權利要求中時，應具有如在專利法 領域中所用的其普通含義。
[0232] 在說明書中和在權利要求中，如在此所使用，關于具有一個或多個要素的清單的 短語"至少一個"應理解為意思指選自該要素清單中的任一個或多個要素的至少一個要素， 但未必包括在該要素清單內具體地列出的每一個要素中的至少一個，并且不排除該要素清 單中多個要素的任何組合。這一定義還允許，可以任選地存在除該短語"至少一個"所指元 素清單內具體地鑒別出的元素外的元素，無論是與具體地鑒別出的那些元素相關還是不相 關。因此，作為非限制性實例，"A和B中的至少一個"（或等效地，"A或B中的至少一個"，或等 效地"A和/或B中的至少一個"）在一個實施例中可以是指至少一個、任選地包括多于一個A， 而不存在B(并且任選地包括除了B的元素）；在另一個實施例中，可以是指至少一個、任選地 包括多于一個B，而不存在A(并且任選地包括除了A的元素）；在又一個實施例中，可以是指 至少一個、任選地包括多于一個A，以及至少一個、任選地包括多于一個B(并且任選地包括 其他兀素）；等等。
[0233] 還應當理解，除非明確指出相反，在包括多于一個步驟或動作的在此所要求保護 的任何方法中，方法的步驟或動作的順序不一定限于其中方法的步驟或動作被列舉的順 序。
[0234] 在權利要求中，以及在以上說明書中，所有過渡性短語，如"包含"、"包括"、"攜 帶"、"具有"、"含"、"涉及"、"持有"、"由……構成"等應理解為開放性的，即，意思指包括但 不限于。只有過渡性短語"由……組成"和"主要由……組成"應當各自地為封閉或半封閉式 過渡性短語，如美國專利局專利審查程序手冊(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures)，第2111.03節中所述。
【主權項】
1. 一種方法，包括 (1) 使一個有待針對一個或多個靶標的存在進行測試的樣品與一個或多個靶標特異性 結合配偶體接觸，其中每個靶標特異性結合配偶體連接至一個對接鏈，并且其中具有不同 特異性的靶標特異性結合配偶體連接至不同對接核鏈， (2) 任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體， (3) 使該樣品與具有互補于一個對接鏈的核苷酸序列的經標記成像鏈接觸， (4) 任選地去除未結合的經標記成像鏈， (5) 將該樣品成像以便檢測結合的經標記成像鏈的位置和數目， (6) 猝滅來自該結合的經標記成像鏈的信號，并且 (7) 重復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像鏈來說具有獨特核苷 酸序列的經標記成像鏈。2. 如權利要求1所述的方法，其中該樣品在步驟（1)中與多于一個的靶標特異性結合配 偶體接觸。3. 如權利要求1所述的方法，其中該靶標特異性結合配偶體是一種抗體或抗體片段。4. 如權利要求1所述的方法，其中這些經標記成像鏈是被相同地標記的。5. 如權利要求1所述的方法，其中這些經標記成像鏈各自包含一個不同的標記。6. 如權利要求1所述的方法，其中這些經標記成像鏈是熒光標記的成像鏈。7. 如權利要求1所述的方法，其中該一個或多個靶標是蛋白質。8. 如權利要求1所述的方法，其中該樣品是一種細胞、細胞裂解物或組織裂解物。9. 如權利要求1所述的方法，其中使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術在步驟(5)中將該 樣品成像。10. 如權利要求1所述的方法，其中步驟(6)中的猝滅信號包括光漂白。11. 一種組合物，包含： 結合到多于一個的靶標特異性結合配偶體上的一個樣品，每個結合配偶體結合到一個 對接鏈上，以及 至少一個穩定地結合到一個經標記成像鏈上的對接鏈。12. -種方法，包括 (1) 使一個有待針對一個或多個靶標的存在進行測試的樣品與一個或多個靶標特異性 結合配偶體接觸，其中每個靶標特異性結合配偶體連接至一個對接核酸，并且其中具有不 同特異性的靶標特異性結合配偶體連接至不同對接核酸， (2) 任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體， (3) 使該樣品與具有互補于一個對接核酸的核苷酸序列的經標記成像核酸接觸， (4) 任選地去除未結合的經標記成像核酸， (5) 將該樣品成像以便檢測結合的經標記成像核酸的位置和數目， (6) 通過改變溫度和/或緩沖條件將該結合的經標記成像核酸從該對接核酸去除，并且 (7) 重復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像核酸來說具有獨特核 苷酸序列的經標記成像核酸。13. 如權利要求12所述的方法，其中該樣品在步驟(1)中與多于一個的靶標特異性結合 配偶體接觸。14. 如權利要求12所述的方法，其中該靶標特異性結合配偶體是一種抗體或抗體片段。15. 如權利要求12所述的方法，其中該靶標特異性結合配偶體是一種天然或工程化的 配體、小分子、適體、肽或寡核苷酸。16. 如權利要求12所述的方法，其中這些經標記成像核酸是被相同地標記的。17. 如權利要求12所述的方法，其中這些經標記成像核酸各自包含一個不同的標記。18. 如權利要求12所述的方法，其中這些經標記成像核酸是熒光標記的成像核酸。19. 如權利要求12所述的方法，其中該一個或多個靶標是蛋白質。20. 如權利要求12所述的方法，其中該樣品是一種細胞、細胞裂解物或組織裂解物。21. 如權利要求12所述的方法，其中使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術在步驟(5)中將 該樣品成像。22. 如權利要求12所述的方法，其中這些經標記成像核酸是通過減小鹽濃度、添加變性 劑、或提高溫度從這些對接核酸去除的。23. 如權利要求22所述的方法，其中該鹽是Mg++。24. 如權利要求22所述的方法，其中該變性劑是甲酰胺、尿素或DMSO。25. 如權利要求12所述的方法，其中在一個競爭核酸的存在下，不通過鏈置換將這些經 標記成像核酸從這些對接核酸去除。26. 如權利要求12所述的方法，其中該未結合的對接核酸是部分雙鏈的。27. 如權利要求12所述的方法，其中該未結合的成像核酸是部分雙鏈的。28. 如權利要求12所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標或者包括一個發夾二 級結構。29. 如權利要求12所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標或者包括一個自淬滅 的發夾二級結構。30. 如權利要求12所述的方法，其中該成像核酸是一個半雙鏈體。31. 如權利要求30所述的方法，其中該半雙鏈體是自淬滅的。32. 如權利要求12所述的方法，其中該對接核酸包括一個發夾二級結構。33. 如權利要求12所述的方法，其中該成像核酸是通過一個樹枝狀結構或一個聚合結 構結合到多個信號發射部分上。34. 一種方法，包括 (1) 使一個有待針對一個或多個靶標的存在進行測試的樣品與一個或多個靶標特異性 結合配偶體接觸，其中每個靶標特異性結合配偶體連接至一個對接核酸，并且其中具有不 同特異性的靶標特異性結合配偶體連接至不同對接核酸， (2) 任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體， (3) 使該樣品與具有互補于一個對接核酸的核苷酸序列的經標記成像核酸接觸， (4) 任選地去除未結合的經標記成像核酸， (5) 將該樣品成像以便檢測結合的經標記成像核酸的位置和數目， (6) 通過去除或修飾它們的信號發射部分而不完全去除成像核酸來滅活這些結合的經 標記成像核酸，并且 (7) 重復步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經標記成像核酸來說具有獨特核 苷酸序列的經標記成像核酸。35. 如權利要求34所述的方法，其中該樣品在步驟(1)中與多于一個的靶標特異性結合 配偶體接觸。36. 如權利要求34所述的方法，其中該靶標特異性結合配偶體是一種抗體或抗體片段。37. 如權利要求34所述的方法，其中該靶標特異性結合配偶體是一種天然或工程化的 配體、小分子、適體、肽或寡核苷酸。38. 如權利要求34所述的方法，其中這些經標記成像核酸是被相同地標記的。39. 如權利要求34所述的方法，其中這些經標記成像核酸各自包含一個不同的標記。40. 如權利要求34所述的方法，其中這些經標記成像核酸是熒光標記的成像核酸。41. 如權利要求34所述的方法，其中該一個或多個靶標是蛋白質。42. 如權利要求34所述的方法，其中該樣品是一種細胞、細胞裂解物或組織裂解物。43. 如權利要求34所述的方法，其中使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術在步驟(5)中將 該樣品成像。44. 如權利要求34所述的方法，其中該未結合的對接核酸是部分雙鏈的。45. 如權利要求34所述的方法，其中該未結合的成像核酸是部分雙鏈的。46. 如權利要求34所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標或者包括一個發夾二 級結構。47. 如權利要求34所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標或者包括一個自淬滅 的發夾二級結構。48. 如權利要求34所述的方法，其中該成像核酸是一個半雙鏈體。49. 如權利要求48所述的方法，其中該半雙鏈體是自淬滅的。50. 如權利要求34所述的方法，其中該對接核酸包括一個發夾二級結構。51. 如權利要求34所述的方法，其中該成像核酸是通過一個樹枝狀結構或一個聚合結 構結合到多個信號發射部分上。
【文檔編號】C12N15/115GK105980855SQ201580006969
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年3月11日
【發明人】尹鵬, S·阿加斯蒂, 陳曦, R·容曼
【申請人】哈佛學院院長及董事