專(zhuān)利名稱(chēng)：使用抗氧化劑的組合增強(qiáng)陪伴動(dòng)物免疫反應(yīng)的方法和產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于增強(qiáng)陪伴動(dòng)物(如狗)的免疫反應(yīng)和提高其總體健康狀況的方法和產(chǎn)品，更明確地說(shuō)，涉及一種于動(dòng)物飲食中提供有益量的抗氧化劑的方法和產(chǎn)品。
近年來(lái)，抗氧化劑的保健作用引起了人們?cè)絹?lái)越多的興趣。抗氧化劑是可對(duì)抗活性氧類(lèi)(也公知為自由基)作用的營(yíng)養(yǎng)物。這些有害分子是正常代謝的副產(chǎn)物。抗氧化劑營(yíng)養(yǎng)物通過(guò)附著至這些分子、中和它們并將它們從身體內(nèi)清除來(lái)對(duì)抗自由基的作用。自由基的低效清除牽涉到對(duì)人體造成損傷，據(jù)信其可導(dǎo)致某些疾病如阿爾茨海默病、自身免疫病、腫瘤、心血管疾病、白內(nèi)障、糖尿病、斑點(diǎn)退化、多發(fā)性硬化癥、肌營(yíng)養(yǎng)不良、胰腺炎、帕金森病以及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。由于這些自由基的累積而引起的損傷可能是老化過(guò)程的原因，這些自由基隨著時(shí)間推移而累積，引起隨衰老而發(fā)生的免疫反應(yīng)抑制，導(dǎo)致老年人群中漸增的發(fā)病趨勢(shì)。
抗氧化劑營(yíng)養(yǎng)物是對(duì)一些化合物的一種分類(lèi)，其中所述化合物具有相似的中和有害自由基的作用。它們包括公知的維生素如維生素A、維生素C和維生素E。它們也包括其它分類(lèi)為類(lèi)胡蘿卜素的化合物。類(lèi)胡蘿卜素的實(shí)例包括β-胡蘿卜素、黃體素、蝦青素、角黃素和番茄紅素。這些化合物是形成水果、花和蔬菜中的綠色、黃色、橙色和粉紅色色素的原因。這些類(lèi)胡蘿卜素公知對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起重要作用(例如，已發(fā)現(xiàn)類(lèi)胡蘿卜素可防止小鼠中化學(xué)誘導(dǎo)的致癌作用以及增加大鼠淋巴細(xì)胞增殖)。已發(fā)現(xiàn)蝦青素和β-胡蘿卜素可增加小鼠脾細(xì)胞針對(duì)T-依賴(lài)性抗原的離體抗體反應(yīng)。已發(fā)現(xiàn)飲食性黃體素可增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞的淋巴細(xì)胞增殖。
雖然這些化合物全部分類(lèi)為抗氧化劑，但有一點(diǎn)已逐漸明顯，即它們并不以同樣的方式發(fā)揮作用。例如，以前對(duì)人進(jìn)行的研究表明，攝食高抗氧化劑之飲食(即水果和蔬菜的高攝入)的群體較其它人群組比較，前者具有較低的腫瘤發(fā)病率。然而提供補(bǔ)加抗氧化劑(如單一的維生素E或β-胡蘿卜素)的臨床研究表明它們不提供同等的保護(hù)。目前認(rèn)為受益于抗氧化劑營(yíng)養(yǎng)物的人類(lèi)之健康可通過(guò)一些不同的抗氧化劑的低水平組合實(shí)現(xiàn)，而非高水平的單一抗氧化劑。
雖然狗還沒(méi)有進(jìn)化為依賴(lài)基于大量水果和蔬菜的飲食，但它確實(shí)搜尋并吃小的食植動(dòng)物，后者消費(fèi)具有高濃度此類(lèi)化合物的植物。因此，可能狗對(duì)抗氧化劑的需要是自然地進(jìn)化的。據(jù)此，在本領(lǐng)域中，需要在陪伴動(dòng)物(如狗)的飲食中提供有益的抗氧化劑，以提供保健作用。
本發(fā)明提供了一種飼喂陪伴動(dòng)物(如狗)飲食的方法，其中飲食包含有效量的抗氧化劑的組合，以增強(qiáng)動(dòng)物的免疫反應(yīng)和提高動(dòng)物的總體健康狀況。優(yōu)選地，飼喂動(dòng)物一種飲食，其包括維生素E、黃體素和β-胡蘿卜素的組合。該抗氧化劑包為動(dòng)物提供了從約175至約400IU的維生素E/千克飲食、從約1至約50mg/天的黃體素、以及從約1至約50mg/天的β-胡蘿卜素。已發(fā)現(xiàn)此類(lèi)飲食可優(yōu)化狗的免疫細(xì)胞以及增加狗的疫苗識(shí)別。
因此，本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)是通過(guò)在動(dòng)物飲食中提供有效量的抗氧化劑的組合，來(lái)提供增強(qiáng)陪伴動(dòng)物(如狗)的免疫反應(yīng)和提高其總體健康狀況的一種寵物食品和方法。通過(guò)下列詳述、附圖和附加的權(quán)利要求，本發(fā)明的這個(gè)和其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。


圖1是狗的抗體濃度(mg/dl)對(duì)mg/kg飲食中的β-胡蘿卜素作圖。
圖2是闡明飲食性黃體素對(duì)狗疫苗識(shí)別之影響的作圖。
本發(fā)明提供了一種飼喂陪伴動(dòng)物(如狗)飲食的方法，其中飲食包含有效量的抗氧化劑的組合，以增強(qiáng)動(dòng)物的免疫反應(yīng)和提高動(dòng)物的總體健康狀況。該抗氧化劑的組合可作為補(bǔ)充物或包含在飼喂動(dòng)物的飲食中提供給動(dòng)物。此補(bǔ)充物可為丸劑或膠囊劑形式、糖果(treat)或餅干、或任一其它可食用的形式。“飲食”是指被動(dòng)物有規(guī)律地?cái)z入的食物或飲料。通過(guò)使用抗氧化劑的組合，認(rèn)為可對(duì)免疫系統(tǒng)的許多方面提供保健作用，例如，優(yōu)化的免疫細(xì)胞激活、抗體水平的增加、以及抗體識(shí)別的提高。
飲食可為任一合適的寵物食品配方，該配方也可為動(dòng)物提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物。例如，本發(fā)明使用的一般狗食可包含約18-40％粗蛋白、約4-30％脂肪、以及約4-20％總飲食性纖維。但這些或其它營(yíng)養(yǎng)物不要求特定比率或百分比。抗氧化劑的組合可與此類(lèi)飲食混合，以提供所需要的有益的數(shù)量。
為了使本發(fā)明更易于理解，可參照以下實(shí)施例，其用于闡明本發(fā)明，而不用于限制發(fā)明范圍。
為了研究給予單劑口服β-胡蘿卜素的狗對(duì)口服β-胡蘿卜素的攝入，狗(n＝6只/處理)一次性經(jīng)口給予0、50、100或200mg β-胡蘿卜素(10％冷水溶解；BASF Corp.，Ludwigshafen，德國(guó))。合適劑量的β-胡蘿卜素溶于5ml水，其通過(guò)飼喂注射器口服飼喂。為建立合適的取樣時(shí)間，用兩只狗進(jìn)行了初步研究。對(duì)這些狗一次飼喂50mg的β-胡蘿卜素，并于0(恰好在飼喂β-胡蘿卜素前)、3、6、9、12、15、18、21和24小時(shí)抽取血樣。
通過(guò)離心分離血漿，并用高效液相層析(HPLC)如下分析β-胡蘿卜素濃度。所有步驟在暗光下進(jìn)行。在BHT存在下，用1∶1的二乙醚和石油醚混合物對(duì)雙份血漿、每份白細(xì)胞勻漿和每份白細(xì)胞的亞細(xì)胞級(jí)分進(jìn)行提取。移去醚相并于流動(dòng)氮下干燥。在流動(dòng)相中重建殘余物，用于β-胡蘿卜素的HPLC測(cè)定。將樣品(50μl)注入5μm球形C-18反相柱(3.9×150mm；Resolve)，并且用47∶47∶6(v/v/v)的乙腈、甲醇和氯仿之混合物以1.0ml/分鐘的流速洗脫。
這個(gè)實(shí)施例的結(jié)果顯示β-胡蘿卜素的峰濃度在給予劑量后3至6小時(shí)間出現(xiàn)，且于24小時(shí)時(shí)不可檢測(cè)到。接下來(lái)，在同樣的時(shí)間段從剩余狗抽取血樣。同樣分離血漿并通過(guò)HPLC分析。
在所有的研究時(shí)間段，未補(bǔ)充β-胡蘿卜素的狗均不能檢測(cè)到血漿β-胡蘿卜素的濃度。相反對(duì)口服給予β-胡蘿卜素的狗，其血漿β-胡蘿卜素呈劑量依賴(lài)性升高(P＜0.01)。在給予劑量后6小時(shí)觀察到峰濃度，并且在所有的處理組中是一致的。此后所有補(bǔ)充β-胡蘿卜素之狗中β-胡蘿卜素濃度快速下降(P＜0.01)。在給予劑量后24小時(shí)不可檢測(cè)到濃度。血漿β-胡蘿卜素的半壽期為3(50和100mg劑量)至4(100mg劑量)小時(shí)。狗的血液β-胡蘿卜素的峰濃度比貓?jiān)绯霈F(xiàn)(見(jiàn)下面的實(shí)施例4和5)。同樣，在調(diào)整體重差異后狗的血漿β-胡蘿卜素的濃度比在貓上觀察的低約10至16倍。
在第二個(gè)研究中，狗(n＝6只/處理)每天于0800點(diǎn)連續(xù)飼喂0、12.5、25、50或100mgβ-胡蘿卜素7天。β-胡蘿卜素追加在食物中并于早餐飼喂。于0天(恰好在第一次劑量前)和接下來(lái)于施用每劑后6小時(shí)(1至7天)每天抽取血樣一次。該抽取血樣時(shí)間的選擇是基于實(shí)施例1得到的結(jié)果，其顯示β-胡蘿卜素的峰濃度位于一次劑量后6小時(shí)。分離血漿并分析β-胡蘿卜素的濃度。
7天中每天施用β-胡蘿卜素的狗產(chǎn)生劑量依賴(lài)性上升的循環(huán)β-胡蘿卜素。飼喂100mgβ-胡蘿卜素的狗顯示出血漿β-胡蘿卜素的日濃度急速上升。在這個(gè)實(shí)施例中，飼喂100mgβ-胡蘿卜素的狗在第一天血漿β-胡蘿卜素的峰濃度(18μg/L)類(lèi)似于第一個(gè)研究中所觀察到的。在最后一次劑量后血漿β-胡蘿卜素的濃度通常較第一次劑量后所觀察到的高出2.5至4倍。
設(shè)計(jì)的第三個(gè)研究是用于研究狗的血淋巴細(xì)胞對(duì)β-胡蘿卜素的攝入。狗(n＝8只/處理)每天飼喂0、50或100mgβ-胡蘿卜素30天。所有狗的血樣于10、20和30天時(shí)通過(guò)頸靜脈抽取。密度梯度離心分離血淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞重懸于含有3％抗壞血酸鈉(作為抗氧化劑)的PBS。等份的細(xì)胞懸液超聲處理30秒以破碎細(xì)胞。提取白細(xì)胞勻漿用于β-胡蘿卜素的HPLC分析。
于第30天取較大量的血，如上所述制備白細(xì)胞懸液用于接下來(lái)的亞細(xì)胞分級(jí)分離。于5倍體積的0.25M蔗糖中超聲20秒破碎細(xì)胞。加入抗壞血酸鈉作為抗氧化劑。離心勻漿(4℃，600×g10分鐘)，從上清液分離核沉淀物。離心去核后的上清液(4℃，17,300×g20分鐘)以分離線粒體級(jí)分。離心去線粒體后上清液(4℃，102,000×g60分鐘)，以從胞質(zhì)級(jí)分分離微粒體。用HPLC分析每種亞細(xì)胞級(jí)分的β-胡蘿卜素含量。
第0天(補(bǔ)充β-胡蘿卜素前)，在所有狗的外周血淋巴細(xì)胞中均不能檢測(cè)到β-胡蘿卜素的濃度。同樣，在整個(gè)研究中未補(bǔ)充β-胡蘿卜素的狗淋巴細(xì)胞中仍然檢測(cè)不到β-胡蘿卜素。相反，飼喂β-胡蘿卜素的狗淋巴細(xì)胞中β-胡蘿卜素濃度通常以時(shí)間-依賴(lài)性方式上升(P＜0.01)。比較飼喂50或100mgβ-胡蘿卜素的狗淋巴細(xì)胞中β-胡蘿卜素濃度，沒(méi)有顯著的處理差異。
從未補(bǔ)充β-胡蘿卜素的狗獲得的淋巴細(xì)胞之多種亞細(xì)胞級(jí)分中均不能檢測(cè)到β-胡蘿卜素。相反，從補(bǔ)充β-胡蘿卜素的狗所分離的血淋巴細(xì)胞之所有亞細(xì)胞級(jí)分均攝入β-胡蘿卜素。胞質(zhì)級(jí)分占淋巴細(xì)胞中總β-胡蘿卜素的52至62％，而核含有總β-胡蘿卜素的最低量(6至8％)。線粒體(14至17％)和微粒體(16至23％)介于胞質(zhì)和核之間。在飼喂的第30天，飲食性β-胡蘿卜素之劑量對(duì)亞細(xì)胞級(jí)分?jǐn)z入β-胡蘿卜素?zé)o顯著影響。該結(jié)果表明所有淋巴細(xì)胞亞細(xì)胞級(jí)分均攝入β-胡蘿卜素。但胞質(zhì)中β-胡蘿卜素最高。
與淋巴細(xì)胞一樣，血嗜中性粒細(xì)胞同樣攝入β-胡蘿卜素。但與淋巴細(xì)胞不同的是其最大攝入發(fā)生在第10天，且在第30天觀察時(shí)嗜中性粒細(xì)胞β-胡蘿卜素的濃度無(wú)進(jìn)一步的上升。血嗜中性粒細(xì)胞的胞質(zhì)、線粒體和微粒體也顯示明顯的β-胡蘿卜素的攝入。相反，核中未檢測(cè)到β-胡蘿卜素。與血淋巴細(xì)胞亞細(xì)胞級(jí)分一樣，血嗜中性粒細(xì)胞的胞質(zhì)級(jí)分中β-胡蘿卜素最高(61至68)。沒(méi)有觀察到明顯的劑量效應(yīng)。
在第四個(gè)研究中，雌性小獵兔犬(4至5月齡)每日補(bǔ)充0、25、50或100mgβ-胡蘿卜素，以研究飲食性β-胡蘿卜素在加強(qiáng)狗細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和體液免疫系統(tǒng)中的作用。評(píng)估所有動(dòng)物或外周血淋巴細(xì)胞中的下列參數(shù)(1)針對(duì)PHA(非特異性免疫)和疫苗(特異性免疫)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)，(2)淋巴細(xì)胞增殖，(3)淋巴細(xì)胞群以及(4)免疫球蛋白(Ig)。
補(bǔ)充β-胡蘿卜素可以劑量依賴(lài)性方式使血漿β-胡蘿卜素濃度上升，但不影響血漿視黃醇或α-生育酚。這些改變通常反映對(duì)特異的(疫苗)和非特異的(PHA)抗原之DTH應(yīng)答。飼喂50mgβ-胡蘿卜素的狗可觀察到對(duì)PHA攻擊的最大反應(yīng)，而飼喂20或50mgβ-胡蘿卜素的狗顯示對(duì)疫苗明顯較高的DTH反應(yīng)。遲發(fā)型超敏反應(yīng)是嚴(yán)格地細(xì)胞反應(yīng)，其涉及T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞而不涉及抗體成分。抗原呈遞細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞)呈遞抗原或變應(yīng)原至T細(xì)胞，使T細(xì)胞活化并釋放淋巴因子。這些淋巴因子活化巨噬細(xì)胞并使它們變?yōu)橥鈦?lái)入侵者的貪婪殺手。因此該數(shù)據(jù)顯示飼喂β-胡蘿卜素的狗具有增高的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。
β-胡蘿卜素飼喂也對(duì)淋巴細(xì)胞亞群產(chǎn)生明顯的改變。與對(duì)照比較，飼喂20或50mgβ-胡蘿卜素的狗具有增多的CD4+細(xì)胞(第8周)。飼喂20mgβ-胡蘿卜素的狗在第2和4周也具有增多的CD8細(xì)胞。T細(xì)胞可根據(jù)CD4膜分子的表達(dá)分類(lèi)。CD4作為粘附分子和作為共信號(hào)傳遞的共受體發(fā)揮作用。它在T細(xì)胞活化中起作用。CD4+T淋巴細(xì)胞識(shí)別與II類(lèi)MHC分子結(jié)合的抗原并且主要作為輔助細(xì)胞起作用。對(duì)飼喂20至50mgβ-胡蘿卜素的狗，本研究的T輔助細(xì)胞群之增多可以解釋相應(yīng)的DTH反應(yīng)之增強(qiáng)。
早至規(guī)定飲食補(bǔ)充后一周，飼喂β-胡蘿卜素的狗之IgG、IgM和總IgG的濃度明顯增高。飼喂0至20mgβ-胡蘿卜素的狗其Ig的增高呈劑量依賴(lài)。β-胡蘿卜素的最高水平(50mg)不產(chǎn)生進(jìn)一步的增加。飼喂20mgβ-胡蘿卜素的狗一直對(duì)兩類(lèi)Ig具有最大的抗體反應(yīng)。免疫系統(tǒng)的主要功能之一是產(chǎn)生抗體，其自由地循環(huán)以保護(hù)機(jī)體抵御外來(lái)物質(zhì)。抗體起到中和毒素、固定某些微生物、中和病毒活性、凝集微生物或抗原顆粒以及沉淀可溶抗原的作用。
β-胡蘿卜素飼喂不影響促分裂原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞母細(xì)胞化和IL-2產(chǎn)生。淋巴細(xì)胞參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。識(shí)別抗原后，淋巴細(xì)胞很快分裂，以此克隆自身以備與潛在入侵爭(zhēng)斗。在體液免疫反應(yīng)中，IL-2刺激與抗原反應(yīng)的T輔助細(xì)胞和B細(xì)胞增殖。抗原或促分裂原活化的T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增需要它。在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中，IL-2活化天然殺傷細(xì)胞、刺激胸腺細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞活性。
基于這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，狗從飲食中吸收了顯著量的β-胡蘿卜素并將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)運(yùn)至免疫細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的亞細(xì)胞器。在這些細(xì)胞中β-胡蘿卜素看來(lái)是通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(DTH反應(yīng)、淋巴細(xì)胞亞群漂移)和體液反應(yīng)(IgG和IgM產(chǎn)生)來(lái)增強(qiáng)狗的免疫系統(tǒng)。黃體素56只雌性小獵兔犬(年齡17至18個(gè)月；平均體重11.4±0.4kg)隨機(jī)地每日補(bǔ)充0、5、10或20mg黃體素，共17周。該黃體素含有76.66％黃體素和5.23％玉米黃質(zhì)。將黃體素補(bǔ)充物重懸于大豆油至合適的濃度，并于每天0800時(shí)經(jīng)口施與1ml。在該黃體素補(bǔ)充物后立即提供食物(200g/狗/天)。基礎(chǔ)飲食滿足或超過(guò)對(duì)所有必需營(yíng)養(yǎng)物的需求(NRC1985)。所有狗置于2×2m圍欄內(nèi)(2只狗/圍欄)，置于有溫度(20至22℃)及光照(14hr光)控制設(shè)施的環(huán)境中。在第0、6和12周時(shí)記錄體重。
第0、2、4、8和12周時(shí)，通過(guò)頸靜脈穿刺將血收集至肝素化的空試管，并將等份用于HPLC分析和評(píng)估免疫反應(yīng)。提取和HPLC分析提取血漿用于分析黃體素、玉米黃質(zhì)、視黃醇和α-生育酚。簡(jiǎn)言之，通過(guò)加入等體積含0.1％丁基化羥甲苯(BHT)(Aldrich ChemicalCo.，Milwaukee，WI)的乙醇沉淀血漿蛋白質(zhì)。該混合物用5ml 1∶1的石油醚∶無(wú)水乙醚混合物提取。
將干燥的殘余物重懸于移動(dòng)相，其中移動(dòng)相由47∶47∶6(v∶v∶v)的HPLC級(jí)乙腈∶甲醇∶氯仿(Fisher Scientific，F(xiàn)air Lawn，NJ)之混合物組成。通過(guò)比較曲線下面積對(duì)黃體素、玉米黃質(zhì)和α-生育酚定量，而用峰高度對(duì)視黃醇定量。通過(guò)比較洗脫化合物與純標(biāo)準(zhǔn)物的吸收光譜進(jìn)一步證實(shí)它們的身份。由于黃體素和玉米黃質(zhì)沒(méi)完成基線分離，故血漿濃度報(bào)告為黃體素+玉米黃質(zhì)。遲發(fā)型超敏反應(yīng)第0、6和12周時(shí)對(duì)所有狗評(píng)估皮膚硬化反應(yīng)。狗側(cè)腹區(qū)真皮內(nèi)注射鹽水(8.5g/L；對(duì)照)，含有犬瘟熱病毒、犬2型腺病毒、犬副流感病毒和細(xì)小病毒的減毒多價(jià)疫苗(Vanguard 5，Smithkline Beacham，WestChester，PA；特異性抗原)，以及PHA(0.5g/L；非特異性抗原)。所使用的疫苗和PHA之劑量是事先測(cè)定的，其可對(duì)年齡相仿的小獵兔犬提供最佳皮膚反應(yīng)。備皮并用70％乙醇擦拭注射位點(diǎn)。注射體積為100μl。于注射后0、24、48和72h用壓力敏感的數(shù)字微米尺(Mitsutoyo，東京，日本)測(cè)定皮膚的硬化，并將反應(yīng)表達(dá)為0時(shí)測(cè)得的皮膚厚度百分比。淋巴細(xì)胞增殖對(duì)第0、2、4、8和12周收集的血通過(guò)外周血單核細(xì)胞(PBMC)評(píng)估促分裂原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖。使用全血培養(yǎng)物以模擬體內(nèi)條件。所用的促分裂原為植物凝集素(PHA)、伴刀豆凝集素A(ConA)和商陸絲裂素(PWM)。充分混勻全血，然后用含有25mM Hepes、青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100μg/mL)的RPMI-1640(Sigma，St.Louis，MO)1∶12稀釋。使用未稀釋的血以及1∶2、1∶4、1∶8、1∶12和1∶16稀釋的血進(jìn)行的初步研究顯示，1∶12稀釋的血具有最佳PBMC增殖反應(yīng)。將三個(gè)重復(fù)的150μL滴加入96孔圓底板并加入50μL合適的促分裂原。培養(yǎng)物中促分裂原的終濃度為PHA2和10μg/mL、ConA 1和5μg/mL以及PWM 0.5和2.5μg/mL。在使用來(lái)自類(lèi)似動(dòng)物的血液之初步研究中促分裂原的這兩個(gè)濃度給出最大的(較高的促分裂原濃度)和最適度以下的(較低的促分裂原濃度)增殖反應(yīng)。混合物于環(huán)境中含5％CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)72小時(shí)。在終止培養(yǎng)前4小時(shí)，加入20μL[3H]-胸苷(1μCi/孔)。將細(xì)胞收獲至玻璃纖維濾膜上并通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)放射活性。PBMC的增殖反應(yīng)以刺激指數(shù)(受刺激培養(yǎng)物的cpm/未受刺激培養(yǎng)物的cpm)表示。淋巴細(xì)胞亞群使用Histopaque-1119(Sigma，St.Louis，MO)分離血淋巴細(xì)胞。細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)洗三次，并于NH4Cl(8.4g/L)中裂解污染的紅細(xì)胞。用流式細(xì)胞術(shù)(FACScan，Becton Dickinson，San Jose，CA)測(cè)定淋巴細(xì)胞亞群。分離的單核細(xì)胞以1×107個(gè)細(xì)胞/mL重懸于PBS，其中的PBS補(bǔ)充有2％無(wú)γ球蛋白的血清、5％山羊血清和0.2g/mL疊氮鈉。總共5×105個(gè)細(xì)胞與最佳濃度的小鼠抗犬單克隆抗體(mAb)冰上溫育30分鐘用于免疫熒光分析。所用的mAb對(duì)下列淋巴細(xì)胞亞群是特異的總T細(xì)胞(抗-CD5)、T輔助細(xì)胞(抗-CD4)、T細(xì)胞毒/抑制細(xì)胞(抗-CD8)、表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(MHCII類(lèi)抗原)的淋巴細(xì)胞(抗-MHCII類(lèi))以及B細(xì)胞(抗-CD21)。然后將細(xì)胞洗三次并與二級(jí)抗體(異硫氰酸熒光素(FTTC)連接的山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)的F(ab’)2)(Caltag，Burlingame，CA)冰上溫育30分鐘，以觀察結(jié)合的mAb。被染色細(xì)胞固定于4％多聚甲醛以制備獲得物。
包括合適的陰性對(duì)照以校正背景熒光。數(shù)據(jù)以陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比表示，其中陽(yáng)性染色細(xì)胞為已經(jīng)二級(jí)抗體非特異的染色細(xì)胞校正過(guò)的細(xì)胞。NK細(xì)胞細(xì)胞毒性在評(píng)估NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性時(shí)，用犬甲狀腺腺癌細(xì)胞作為目標(biāo)細(xì)胞。此細(xì)胞系事先已顯示易于被犬NK細(xì)胞殺傷。在T75燒瓶中用20mL補(bǔ)加10％胎牛血清(FCS)、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的最小必須培養(yǎng)基(MEM；Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞。當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞鋪滿后用胰蛋白酶消化，洗三次并以5×105個(gè)細(xì)胞/mL重懸于完全培養(yǎng)基中(RPMI-1640+10％FCS+100U/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素)。將三個(gè)重復(fù)的100μL目標(biāo)細(xì)胞等份滴加入96孔U-底板(Costar，Cambridge，MA)并溫育8小時(shí)使細(xì)胞粘附。然后向通過(guò)珀可分離法(如上所述)分離的淋巴細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞；100μL)中加入目標(biāo)細(xì)胞，以提供10∶1的效應(yīng)細(xì)胞∶目標(biāo)細(xì)胞(E∶T)比。于37℃溫育10小時(shí)后，加入20μL底物，其中底物包含5μg3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)。混合物于37℃溫育4小時(shí)，此后吸出未代謝的MTT。加入200μL95％的乙醇溶解甲臜結(jié)晶。用微孔板讀數(shù)儀于570nm處測(cè)定光密度。如下計(jì)算NK細(xì)胞特異性裂解百分比特異性細(xì)胞毒性(％)＝100×{1-[(目標(biāo)細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的OD-效應(yīng)細(xì)胞的OD)/(目標(biāo)細(xì)胞的OD)]}IL-2的產(chǎn)生全血用補(bǔ)充了Hepes和抗生素的RPMI-1640(前述)1∶2稀釋?zhuān)?00μL稀釋血滴加入48孔板(Costar，Cambridge，MA)。細(xì)胞于5％CO2環(huán)境、37℃下，用PHA(5μg/mL的溶液取400μL)刺激48小時(shí)。200×g離心板10分鐘并將上清凍存于-80℃。培養(yǎng)上清液的IL-2含量通過(guò)三個(gè)重復(fù)的ELISA(Intergen，Purchase，紐約)測(cè)定。多克隆抗人IL-2可與犬IL-2交叉反應(yīng)并以重組人IL-2作為標(biāo)準(zhǔn)。血清IgG和IgM通過(guò)單向放射免疫擴(kuò)散(SRID)分析于第0、2、4、8和12周收集的血清IgG和IgM濃度。此外，所有狗于第13周和再于第15周接種多價(jià)疫苗(Vanguard 5，Smithkline Beacham，West Chester，PA)，以研究飲食性黃體素可能的回憶效應(yīng)。從第13周至第17周每周收集一次血。山羊抗犬IgG(10％，整個(gè)分子)或IgM(7.5％，μ鏈)(LCN，Aurora，OH)抗血清與融化的瓊脂糖(用PBS配制為10g/L；SigmaChem.Co.，St.Louis，MO)混合，將混合物固化于SRID板。將兩個(gè)重復(fù)的血清或IgG標(biāo)準(zhǔn)(0、2.88、5.75、11.5和23.0mg/ml)或IgM標(biāo)準(zhǔn)(0、0.25、0.5、1.0和2.0mg/ml)5μL體積上樣至孔中。于溫室中室溫孵育24小時(shí)后，用SRID讀數(shù)儀(Transidyne General Corp.，Ann Arbor，MI)測(cè)量環(huán)直徑。脂質(zhì)過(guò)氧化(TBARS)的測(cè)定通過(guò)檢測(cè)丙二醛(MDA)的產(chǎn)生測(cè)定血漿脂質(zhì)過(guò)氧化活性。所用的標(biāo)準(zhǔn)為1，1，3，3-四甲氧丙烷JMP(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)。將兩個(gè)重復(fù)的500μL血漿樣品滴加入15ml玻璃試管，并加入3mL磷酸(10g/L)和1mL TBA溶液(6g/L)。混合物于水浴中沸騰45分鐘。使試管冷卻并用4ml的正丁醇提取該TBA-MDA復(fù)合物。1,000×g離心10分鐘分離丁醇層，于532nm(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)處測(cè)定吸收。TBARS活性用nmole MDA/L血漿表示。統(tǒng)計(jì)使用SAS的General Linear Model通過(guò)分裂-圖表ANOVA分析數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)模式為Yijk＝μ+Dietj+Dogj(Diet)(誤差術(shù)語(yǔ)，用于飲食效應(yīng)的試驗(yàn))+Periodk+Dietj*Periodk+eijk。用正交對(duì)比比較處理平均值之間的差異，并且當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為統(tǒng)計(jì)上具顯著性。結(jié)果血漿對(duì)補(bǔ)充黃體素的狗，其黃體素+玉米黃質(zhì)的血漿濃度在飼喂后2周快速上升(
圖1)。此后對(duì)飼喂10和20mg黃體素的狗，其血漿濃度繼續(xù)上升，雖然上升較緩。相反，未補(bǔ)充的狗不能檢測(cè)到血漿黃體素+玉米黃質(zhì)。飼喂黃體素的狗血漿黃體素+玉米黃質(zhì)的濃度在第2周至第12周之間明顯高于(P＜0.05)未補(bǔ)充的動(dòng)物。黃體素的補(bǔ)充不影響血漿視黃醇和α-生育酚濃度。在所有處理和整個(gè)期間這些維生素的濃度平均分別為3.63±0.14和37±2μmol/L。遲發(fā)型超敏反應(yīng)在整個(gè)研究期間，對(duì)鹽水的DTH反應(yīng)低(皮膚厚度增加3至10％)并在處理組間差別不顯著。飼喂黃體素之前(第0周)，所有規(guī)定飲食組對(duì)PHA和疫苗的DTH反應(yīng)相似。與處理期間無(wú)關(guān)的是在注射后約24小時(shí)可觀察到對(duì)PHA的最大DTH反應(yīng)，而對(duì)疫苗的最大反應(yīng)發(fā)生在48和72小時(shí)間。同樣，對(duì)PHA的皮膚厚度反應(yīng)約比疫苗高兩倍。
第6周時(shí)，在注射PHA后24小時(shí)呈現(xiàn)劑量相關(guān)的DTH反應(yīng)。在48和72小時(shí)時(shí)DTH反應(yīng)下降，并且在這些時(shí)間沒(méi)有觀察到明顯的處理差異。在注射后48和72小時(shí)對(duì)疫苗的DTH反應(yīng)為劑量相關(guān)的，而在24小時(shí)時(shí)并不明顯。
第12周時(shí)，在24、48和72小時(shí)對(duì)PHA的DTH反應(yīng)具有普遍的劑量依賴(lài)性升高；然而，飼喂20mg黃體素的狗與未補(bǔ)充的狗比較，該反應(yīng)明顯較高。對(duì)疫苗的DTH反應(yīng)與第6周相反，沒(méi)有明顯的飲食性影響。
促分裂原誘導(dǎo)的PBMC增殖飲食性黃體素對(duì)未刺激之PBMC的自發(fā)增殖無(wú)明顯影響。在第0和4周時(shí)，飲食性黃體素對(duì)PHA刺激之PBMC反應(yīng)沒(méi)有明顯影響。但第8周(10μg/mL PHA)和第12周(2和10μg/mL PHA)時(shí)，飼喂20mg黃體素的狗與未補(bǔ)充的狗比較，前者增殖反應(yīng)被加強(qiáng)(P＜0.01)。第8周時(shí)，飼喂5和10mg黃體素的狗也對(duì)10μg/mL PHA具較高的PBMC增殖反應(yīng)。
飲食性黃體素對(duì)ConA刺激之PBMC增殖反應(yīng)的影響一般與那些觀察到的PHA誘導(dǎo)的增殖相似。在第8和12周，飼喂20mg黃體素的狗對(duì)兩個(gè)濃度的ConA均有較高的PBMC增殖反應(yīng)。飼喂10mg黃體素的狗在第8和12周對(duì)5μg/mL ConA也顯示較高的PBMC增殖反應(yīng)。一般地，5μg/mLConA較1μg/mL ConA的PBMC增殖要高。
對(duì)PWM的PBMC增殖反應(yīng)一般類(lèi)似于那些觀察到的PHA和ConA。在第8和12周，飼喂20mg黃體素的狗與未補(bǔ)充的對(duì)照比較，前者對(duì)兩個(gè)濃度的PWM均有明顯的較高PBMC增殖反應(yīng)。那些飼喂10mg黃體素的狗在第8周也具有較高的增殖反應(yīng)。再者，在第0和4周時(shí)觀察到不顯著的處理差異。
天然殺傷細(xì)胞細(xì)胞毒活性飲食性黃體素補(bǔ)充不明顯影響NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性。在所有的處理和取樣期間PBMC對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的特異性裂解平均為49.1±1.1％。
淋巴細(xì)胞亞群飲食性黃體素補(bǔ)充前(第0周)，任一淋巴細(xì)胞標(biāo)記的百分比無(wú)明顯差異。第12周時(shí)，飼喂5和10mg黃體素的狗具較高的CD4+細(xì)胞％，而該飲食不影響CD8+細(xì)胞群。另一方面，飼喂20mg黃體素的狗在第8周時(shí)與對(duì)照比較，具明顯較高的CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞％。在第0、4和8周時(shí)處理之間的CD4∶CD8之比相似，而飼喂10mg的狗(2.50±0.16)與對(duì)照(2.10±0.16)比較，前者趨于較高(P＜0.08)。
在第4和8周時(shí)，飼喂黃體素的狗與未補(bǔ)充的對(duì)照比較，普遍具有較高的CD5+細(xì)胞百分比，并且對(duì)飼喂5和20mg黃體素的狗具有統(tǒng)計(jì)意義。在第8和12周時(shí)，飼喂20mg黃體素的狗與未補(bǔ)充的狗比較，前者也具有升高的MHCII類(lèi)細(xì)胞群％。飼喂較低量黃體素的狗具有與對(duì)照類(lèi)似的MHCII類(lèi)細(xì)胞群。
與其它的淋巴細(xì)胞亞群相反，飲食性黃體素不明顯影響CD21+B細(xì)胞群。
IL-2產(chǎn)生整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，在飲食性處理中PHA刺激的全血培養(yǎng)物之PBMC產(chǎn)生IL-2方面沒(méi)有明顯差異。研究期間培養(yǎng)基中IL-2濃度平均為15.7±0.4。
免疫球蛋白產(chǎn)生17周的取樣期間，血漿IgG濃度趨于上升(P＞0.05)。在前12周的規(guī)定飲食補(bǔ)充期間，飲食性處理間濃度相似。然而，于第15周再接種后，飼喂5mg黃體素的狗在16周以及飼喂20mg黃體素的狗在17周時(shí)血漿IgG較高(P＜0.05)，而血漿IgM濃度不變。
脂質(zhì)過(guò)氧化黃體素的補(bǔ)充不明顯影響血漿TBARS活性，其在所有的處理和整個(gè)期間平均為95.8±0.1nmole MDA/L。
討論結(jié)果表明，飲食性黃體素明顯加強(qiáng)了狗中細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。黃體素的補(bǔ)充刺激了PBMC對(duì)PHA、ConA和PWM的增殖反應(yīng)。在第12周時(shí)飼喂20mg黃體素的狗對(duì)PHA和ConA的PBMC增殖反應(yīng)明顯升高。
數(shù)據(jù)顯示飲食性黃體素所致增強(qiáng)的有絲分裂發(fā)生可歸因于增加的淋巴細(xì)胞群。補(bǔ)充黃體素的狗具有較高的CD5+和CD4+細(xì)胞群。飲食性黃體素可特異性地對(duì)T淋巴細(xì)胞起作用，因?yàn)橛^察到黃體素的補(bǔ)充不改變B細(xì)胞群。
數(shù)據(jù)也顯示出在第8和12周黃體素的補(bǔ)充明顯增加了PWM誘導(dǎo)的PBMC增殖。
飲食性黃體素也明顯增加了對(duì)疫苗的DTH反應(yīng)，其表示一種特異的免疫反應(yīng)。與未補(bǔ)充的狗比較，黃體素的補(bǔ)充明顯增加了MHCII類(lèi)分子的染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。
在補(bǔ)充的前12周，黃體素對(duì)離體狗多克隆抗體(IgG和IgM)產(chǎn)生無(wú)明顯影響。但再次暴露于該抗原時(shí)，飼喂黃體素的狗血漿IgG濃度上升，這暗示飲食性黃體素在提高記憶B細(xì)胞分泌IgG能力方面的回憶效應(yīng)。
總之，飲食性黃體素使犬T輔助細(xì)胞群以及MHCII類(lèi)分子的表達(dá)提高，導(dǎo)致促分裂原誘導(dǎo)的犬PBMC增殖和DTH反應(yīng)。同樣認(rèn)為黃體素提高了Ig產(chǎn)生。
對(duì)每一個(gè)研究結(jié)果的概述總結(jié)在表1中。
表1
圖1闡明向飲食中加入β-胡蘿卜素使血中的抗體水平上升20％。
圖2顯示狗識(shí)別疫苗的能力。如圖所示，向飲食中加入黃體素可使識(shí)別提高達(dá)32％。這使狗對(duì)接種的疫苗具有升高的反應(yīng)，以額外地保護(hù)狗免于疾病。
應(yīng)該注意到，沒(méi)有一種抗氧化劑能對(duì)檢查的所有免疫系統(tǒng)提供有益作用。例如，雖然維生素E和黃體素均可優(yōu)化免疫細(xì)胞的活性，維生素E對(duì)T細(xì)胞起作用而黃體素對(duì)B細(xì)胞起作用。提高的T細(xì)胞功能對(duì)抵抗病毒感染和腫瘤是重要的，而提高的B細(xì)胞功能對(duì)抵抗細(xì)菌感染是重要的。因此抗氧化劑的組合可提供對(duì)免疫系統(tǒng)的協(xié)同效應(yīng)，它優(yōu)于對(duì)任一抗氧化劑水平的增加。
為了闡明本發(fā)明，給出了某些代表性的實(shí)施方案和詳述，同時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)此處公開(kāi)的方法和設(shè)備進(jìn)行的多種改變顯然未離開(kāi)本發(fā)明的范圍，在所附的權(quán)利要求中對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行了限定。
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)陪伴動(dòng)物中免疫反應(yīng)的方法，其包括給該動(dòng)物飼喂一種飲食的步驟，該飲食含有有效量的維生素E、黃體素和β-胡蘿卜素的組合。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的飲食包含從約175至約400IU的維生素E/千克飲食、從約1至約50mg/天的黃體素、以及從約1至約50mg/天的β-胡蘿卜素。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的陪伴動(dòng)物為狗。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的飲食包含約18至40％粗蛋白、約4至30％脂肪、以及約4至20％總飲食性纖維。
5.一種優(yōu)化狗中免疫細(xì)胞的方法，其包括飼喂所述狗一種飲食的步驟，該飲食含有有效量的維生素E、黃體素和β-胡蘿卜素的組合。
6.一種優(yōu)化狗中疫苗識(shí)別的方法，其包括飼喂所述狗一種飲食的步驟，該飲食含有有效量的維生素E、黃體素和β-胡蘿卜素的組合。
7.一種用于增強(qiáng)陪伴動(dòng)物免疫反應(yīng)的寵物食品之產(chǎn)品，所述寵物食品之產(chǎn)品包含寵物食品的組合物，該組合物含有有效量的維生素E、黃體素和β-胡蘿卜素的組合。
8.如權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其中所述的組合物包含從約175至約400IU的維生素E/千克飲食、從約1至約50mg/天的黃體素、以及從約1至約50mg/天的β-胡蘿卜素。
9.如權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其中所述的陪伴動(dòng)物為狗。
10.如權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其中所述的組合物包含約18至40％粗蛋白、約4至30％脂肪、以及約4至20％總飲食性纖維。
全文摘要
提供了一種飼喂陪伴動(dòng)物(如狗)飲食的方法,其中飲食包含有效量的抗氧化劑的組合,以增強(qiáng)動(dòng)物的免疫反應(yīng)和提高動(dòng)物的總體健康狀況。優(yōu)選地,飲食包含有從約175至約400 IU的維生素E/千克飲食、從約1至約50mg/天的黃體素、以及從約1至約50mg/天的β－胡蘿卜素。
文檔編號(hào)A23K1/18GK1352529SQ00808119
公開(kāi)日2002年6月5日 申請(qǐng)日期2000年5月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月27日
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