專利名稱：狐米草低能重離子輻射誘變育種方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用低能重離子輻射誘變選育狐米草優質新品系的方法。
狐米草在中國引種始于上世紀80年代，國內品種單一，且至今沒有其遺傳育種方面的報道。以往離子束輻射誘變育種的報道都集中在作物種子和微生物，而未見于植物胚性愈傷組織。美國特拉華大學的鹽生植物生物技術中心，首次進行了狐米草組織培養方面的研究，并發表論文一篇(Xianggan Li et al.，1995.Plantregeneration from callus cultures of salt marsh hay，Spartina patens，and itscellular-based salt tolerance.Aquatic botany 51，103-113)，但未報道其再生效率。本方法發明人及合作者也曾就狐米草組織培養發表兩篇文章(蔡小寧等，2000.狐米草離體培養植株再生.江蘇農業學報16(3)，143-147；Zhou Lu et al.，2003.Effect of brassinolide on callus growth and regeneration in Spartina patens(Poaceae).Plant cell，tissueand organ culture 73，87-89)，并申請了實驗室大規模生產狐米草再生苗的技術專利(專利號00112526.5)。但所有工作均未涉及狐米草遺傳改良和新優品系的篩選，而且所用組織培養技術操作復雜、試劑浪費。
本項工作的關鍵是從大量愈傷組織中獲得胚性個體。在光照條件下，部分組織(5％左右)在生長初期出現綠色顆粒，立即將其與周圍白色組織小心分離并單獨培養，在以后一個月內，一發現白色組織，即立刻切除。兩個月后，將其它并未轉綠的組織塊全部清除。
綠色致密組織即胚性愈傷組織，在新的激素配比下繼代，每月更換一次培養基，材料即以1∶8的比例迅速擴繁。
本方法中所用愈傷組織誘導與胚性材料繼代培養基的基本成分均為MS基本元素(Sigma成品)4.6g/L+蔗糖30g/L+Phytagel瓊脂糖2g/L激素配比分別為誘導培養基2，4-D2.0mg/L+IAA 1.0mg/L繼代培養基NAA 1.0mg/L+2，4-D0.5mg/L+BA 0.5mg/L2.低能重離子輻射將胚性愈傷組織從繼代培養基上取出，在2％滅菌的DMSO水溶液中浸泡45min，在超凈工作室內晾去表面水跡，之后放入離子束注入機靶室中。以能量為20KeV，劑量范圍為2.6×1015ions cm-2到15.6×1015ions cm-2的N+輻射材料。注入機每工作10s，間息10s。注入前靶室須抽真空。輻射后的材料重新接到繼代培養基上恢復3個月，約27.4％的組織能夠存活。
3.組織分化與幼苗的生長將輻射后恢復生長的胚性愈傷組織接入芽分化培養基，待幼芽長至4cm高以上時將其從組織塊上切下，接入根分化培養基。剩余的組織塊可繼續誘導新芽。本方法中采用的芽分化培養基基本成分同前，激素為BA 3mg/L；根分化培養基基本成分改為2.3g/L+蔗糖15g/L+Phytagel瓊脂糖2g/L，不另加激素。
當根長至1cm以上時，即可將幼苗移栽到氣候可人工控制的封閉溫室中。苗床基質以鋸木屑與碳渣(10∶1)為主。幼苗栽種密度為15株/m2。以人工方式每周澆灌一次改進的Hoagland營養液或人工海水，平時以自動滴灌自來水保持基質濕潤。
溫室中夏季(6～8月)日最高溫平均34.5℃，日最高光照強度平均583.9μmols-1m-2；冬季(12～2月)日最低溫平均5.7℃，日最高光照強度平均217.5μmols-1m-2；年平均濕度72.7％。
改進的Hoagland營養液和人工海水配方為

運用本方法，每塊反綠的胚性愈傷組織可以分化出3～4批幼苗，共計30株左右。幼苗在苗床上成活率達95％以上。
4.植株品質性狀比較與DNA檢測在苗床上生長3個月以后，分別測定每株再生苗的株高、節間距、葉長、葉寬、莖粗、分蘗數、地上生物量、地下生物量、地上/地下生物量之比、粗蛋白含量等品質性狀指標，并用單因素方差分析與未經輻射愈傷組織形成的原始再生苗相關數據進行對照。對發生正向變異的樣本標記，用CTAB法提取DNA，用Operon引物A18，A10，A4，A3，Bi0，C2，C11，D7對每個標記樣本進行RAPD擴增，比較DNA變異情況。
經過本方法中N+輻射處理后，約73.7％的再生植株能檢測到品質指標的差異，其中正向變異占1/3。在出現正向變異的樣本中又有64.9％左右的植株發生DNA的變異(約占總數的15.1％)。
5.將品質明顯改良并且DNA也發生變異的植株移栽入新的苗床，作為新的種質資源保存。本發明的效果在于1)首次建立了一套完整的狐米草誘變育種程序。2)在愈傷組織繼代中，白色非胚性組織被徹底剔除。已有實驗證明占據多數的白色組織分化再生能力極差，基本沒有利用價值。僅擴繁綠色胚性組織可以大大節省勞動力和試劑，且因綠色組織不存在粘液化、褐化等問題，有利于操作簡單化。較以往培養基配方，在繼代培養基中省去了椰子汁，在芽分化培養基中省去了IAA，在根分化培養基中省去了全部激素和活性炭，且基本元素和蔗糖也減少了一半。改變后的配方對胚性愈傷組織生長沒有影響，但可以簡化操作和節省試劑。3)將植物胚性愈傷組織作為低能重離子輻射的受體，該材料分裂旺盛，對輻射較休眠的種子更加敏感，容易產生突變。4)再生苗栽種于相對封閉的溫室中，光照、氣溫、濕度等氣候因子可人工控制，可盡量減少環境因子對植株生長發育的影響。5)能量為20KeV，劑量范圍為2.6×1015ions cm-2到15.6×1015ions cm-2的N+輻射對狐米草胚性愈傷組織誘變突變率很高，同時通過將再生苗各品質性狀進行量化比較，容易發現細微的差異，能夠為狐米草遺傳育種準備大量突變材料。
本項發明能夠在較短時間內為濱海灘涂牧場建設和濕地恢復提供優良種質資源。
具體實施例方式
實例1.取狐米草種子100顆，切除非胚端后萌發，共獲得61株幼苗。取無菌幼苗莖基部在含有MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、2，4-D2.0mg/L、IAA1.0mg/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的誘導培養基上誘導出愈傷組織，并從中分離出綠色胚性組織4份，放入含有MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、NAA 1.0mg/L、2，4-D0.5mg/L、BA0.5mg/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的繼代培養基上培養。擴繁到一定數量后，從中選出20塊組織浸入2％DMSO溶液45min，晾去表面水跡后施以能量為20KeV，劑量為10.4×1015ions cm-2的N+輻射。恢復培養3個月后，6塊組織存活。將之轉入含MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、BA3mg/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的芽分化培養基上誘導出芽，再將芽切下，轉到含MS基本元素2.3g/L、蔗糖15g/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的根分化培養基上誘導出根。總計獲得再生苗150多株。在南京大學智能溫室中生長3個月后進行品質分析，發現有92株出現了一項或多項指標變異，其中正向變異樣本29株，而正向變異樣本中又有19個樣本出現了DNA變異。其中有一株在株高、節間距、葉長、葉寬、莖粗、分蘗數、地上生物量、地下生物量、地上/地下生物量之比與原始狐米草均無明顯差異，但粗蛋白含量高達6.5％(鮮重比)，為原始狐米草的1.8倍，原始狐米草對應引物C11擴增產物中250bp的片段在該株中消失，說明已發生了遺傳學上的變異。該株系因營養價值明顯提高而被認為是一個適合灘涂牧場建設的優質新品系，并保存在南京大學溫室中。實例2.取狐米草種子100顆，切除非胚端后萌發，共獲得78株幼苗。取無菌幼苗莖基部在含有MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、2，4-D2.0mg/L、IAA1.0mg/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的誘導培養基上誘導出愈傷組織，并從中分離出綠色胚性組織6份，放入含有MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、NAA1.0mg/L、2，4-D0.5mg/L、BA0.5mg/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的繼代培養基上培養。擴繁到一定數量后，從中選出30塊組織浸入2％DMSO溶液45min，晾去表面水跡后施以能量為20KeV，劑量為10.4×1015ions cm-2的N+輻射。恢復培養3個月后，8塊組織存活。將之轉入含MS基本元素4.6g/L、蔗糖30g/L、BA3mg/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的芽分化培養基上誘導出芽，再將芽切下，轉到含MS基本元素2.3g/L、蔗糖15g/L和Phytagel瓊脂糖2g/L的根分化培養基上誘導出根。總計獲得再生苗200多株。在南京大學智能溫室中生長3個月后進行品質分析，發現有152株出現了一項或多項指標變異，其中正向變異樣本57株，而正向變異樣本中又有28個樣本出現了DNA變異。其中有一株葉長、莖粗、地上/地下生物量之比無明顯變化，但株高、節間距、葉寬、分蘗數、地上生物量、地下生物量和粗蛋白含量依次為原始植株的1.7、1.5、1.3、3.1、5.4、5.9和1.4倍，引物A10對原始狐米草的擴增產物中1200bp和700bp兩個片段在該株系中同時消失。該新品系由于植株高大健壯容易建群而被認為適合于灘涂濕地恢復，并也作為新優品系保存在南京大學溫室中。
權利要求
1.一種狐米草誘變育種的方法，其特征是利用能量為20KeV，劑量范圍為2.6×1015ions cm-2到15.6×1015ions cm-2的N+輻照狐米草胚性愈傷組織，誘導胚性細胞產生突變，在分化形成的再生苗中，篩選品質性狀改良并且遺傳物質已經發生改變，能夠穩定遺傳的新優品系，其技術方法為(1)將狐米草種子非胚端切除以提高種子萌發率，在改良的繼代培養基上僅擴繁狐米草胚性愈傷組織；(2)以能量為20KeV，劑量范圍為2.6×1015ions cm-2到15.6×1015ions cm-2的N+輻照狐米草胚性愈傷組織，誘導產生胚性細胞的突變；(3)在改良的分化培養上，從受輻射后恢復活力的胚性愈傷組織上分化獲得再生苗，并栽種于環境相對封閉，光照、氣溫、濕度等氣候因子人為控制的溫室中；(4)檢測再生植株株高、節間距、葉長、葉寬、莖粗、分蘗數、地上生物量、地下生物量、地上/地下生物量之比以及粗蛋白含量，篩選品質性狀改良的株系；(5)在品質改良的株系中，用RAPD檢測DNA，篩選遺傳物質已經發生變異，能夠穩定遺傳的新優品系。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域。通過低能重離子輻照狐米草胚性愈傷組織，導致胚性細胞遺傳物質的突變，受輻射材料分化形成的再生苗在氣候人工控制的封閉溫室中長大后，經過生物量、粗蛋白含量等10項性狀指標的檢測，篩選出品質明顯改良的株系，在此基礎上再比較DNA變異情況，最終篩選到品質性狀明顯改善并且遺傳基礎已經發生變異，能夠穩定遺傳的優質新品系。為濱海灘涂牧場建設和濕地恢復提供優良種質資源。
文檔編號A01H1/06GK1442043SQ0311320
公開日2003年9月17日 申請日期2003年4月16日 優先權日2003年4月16日
發明者欽佩, 周長芳, 朱曉佳 申請人:南京大學