專利名稱：一種白靈菇與杏鮑菇原生質體的融合方法
技術領域：
本發明屬于食用菌生物技術育種領域，具體涉及一種利用白靈菇與杏鮑菇原生質體融合，獲得兼具白靈菇與杏鮑菇二者優勢特性的菌蓋不易碎、子實體單生菌株的方法。
背景技術：
目前傳統食用菌育種方式多為人工誘變育種，尚無白靈菇與杏鮑菇原生質體融合方面的報道，由于白靈菇具有久煮不爛、耐運輸、易保鮮、貨架時間長、耐旱性強、能防癌抗癌、防治老年人心血管病、婦科腫痛、兒童佝僂病和軟骨病等優點，但其分解木質素、纖維素、蛋白質能力很弱。而杏鮑菇系一種分解木質素、纖維素、蛋白質能力很強的菌類，富含維生素C、高蛋白、低糖、低脂肪、可降血壓、降血脂、預防糖尿病及肥胖癥，有改善腸胃、美容等保健功能。但耐旱性弱，菌蓋和菌柄質地酥脆，易破裂，人工來去除原基分化產生大量菌蕾，加大了成本。因此培育兼具白靈菇與杏鮑菇二者優勢，即能夠耐旱、降解木質素、纖維素，提高菌蓋韌性，子實體單生新菌株顯得尤其重要，可以極大地降低生產成本，培育出優良品種的新菌株。中國專利:申請號201010523452.X公開了一種草菇和杏鮑菇原生質體融合，它主要是采用單滅活法標記原生質體，并通過0°c低溫條件篩選融合株，本發明與其最大的區別是融合過程中采用雙滅活原生質體標記法，并通過頡頏實驗、菌落表型、菌絲形態、出菇試驗，并結合RAPD多種驗證融合株方法，更能準確、全面確定融合株的真實性。目前食用菌育種多為人工誘變方法，由于誘變的不定向特點，用于解決上述問題的效果不佳，查閱資料國內外尚無白靈菇與杏鮑菇原生質體融合報道。

發明內容
本發明目的通過對 白靈菇與杏鮑菇原生質體融合方法克服常規育種方式的不足，將白靈菇與杏鮑菇原生質體成功融合融，獲得兼有兩親本優良特性即菌蓋不易碎、子實體單生新菌株，為實現人工栽培或走發酵工程途徑提供菌種資源。為實現上述目的，本發明公開了一種白靈菇和杏鮑菇原生質體的融合方法，其特征在于將白靈菇和杏鮑菇的菌絲體經酶解制備純化后的原生質體，以白靈菇原生質體熱滅活、以杏鮑菇原生質體紫外滅活作為標記，采用PEG介導的化學融合方法，將白靈菇和杏鮑燕原生質體融合，并通過菌顏頏實驗、菌落表型、菌絲形態、出燕試驗，并結合RAPD (隨機擴增片段多態性)綜合驗證得融合株。所述的酶解液是白靈菇菌絲體酶解液:以0.6mol/L MgSO4.7Η20為滲透壓穩定劑，配制Iml 1.50% (質量體積比)溶壁酶與1.00%蝸牛酶為混合酶解液；杏鮑菇的菌絲體酶解液:以0.6mol/L蔗糖為滲透壓穩定劑，配制Iml 2.00 %溶壁酶與1.00%蝸牛酶為混合酶解液；
所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合:分別將純化后白靈菇與杏鮑菇原生質體懸浮于
0.6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑中，調節濃度至IO5個/ml，按照原生質體懸液體積比1:1混合,3000r/min離心IOmin棄上清,0.6mol/L鹿糖滲透壓穩定劑重懸沉淀后逐滴加入等體積30% (質量體積比)PEG6000與50 mmol/L Ca2+混合溶液，28°C水浴融合30min。本發明進一步公開了一種白靈菇與杏鮑菇原生質體的融合方法，其特征在于它是按如下的步驟進行:
(O白靈菇與杏鮑菇菌絲體制備；
(2)原生質體的制備:白靈菇原生質體制備采用液體靜置培養7d的菌絲體，以0.6mol/L MgSO4.7H20為滲透壓穩定劑，在1.50%溶壁酶與1.00%蝸牛酶混合酶液作用下酶解；杏鮑菇原生質體制備采用液體靜置培養Ild的菌絲體，以0.6mol/L蔗糖為滲透壓穩定齊[J，在2.00%溶壁酶與1.00%蝸牛酶混合酶液作用下酶解；
(3)原生質體純化:將步驟(2)所述酶液過濾去除菌絲殘片，6000r/min離心獲得原生質體沉淀，再將原生質體沉淀經0.6mol/L鹿糖滲透壓穩定劑重懸,再次6000r/min離心洗滌棄上清，分別用0.6mol/L蔗糖為滲透壓穩定劑調節濃度至IO5個/ml:
(4)原生質體滅活標記:白靈菇原生質體采用55°C熱滅活標記處理30min;杏鮑菇原生質體采用紫外滅活采用15W紫外燈下IOcm處垂直照射5min標記處理；
(5)雙親原生質體融合:分別將純化滅活后白靈菇與杏鮑菇原生質體懸浮于0.6mol/L鹿糖滲透壓穩定劑中，調節濃度至IO5個/ml,按照懸液體積比1:1混合，3000r/min離心棄上清，沉淀中逐滴加入30% PEG6000 (聚乙二醇)與50 mmol/L Ca2+混合溶液，28°C水浴融合 30min ；
(6)將步驟(4)處理好的原生質體懸液4000r/min離心15min,棄上清液；再用0.6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑洗滌2次，去除PEG ； (7)融合株再生:將步驟(5)處理好的原生質體沉淀用0.6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑稀釋至IO5個/ml，然后取0.1ml稀釋液涂布在0.6mol/L甘露醇再生培養基上，25°C暗培養7 15d，定期觀察菌落生長情況，待出現菌落時，及時挑出再生菌落轉接備份及獲得融合株。其中所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合的方法，其特征在于步驟(I)所述的白靈菇與杏鮑菇菌絲體制備是指取PDA綜合培養基上生長旺盛的兩親本菌絲體前端，分別接種于裝有白靈菇和杏鮑菇液體培養基IOOmL三角瓶中，裝瓶量為50mL，每瓶接3 4塊0.5cm的菌塊，25°C靜置暗培養5 11 d;無菌條件下挑取菌絲體，無菌濾紙吸干水分，即得到白靈菇與杏鮑菇新鮮的菌絲體。其中所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合的方法，其特征在于步驟(2)
所述酶解是以0.1g菌絲體(濕重)加入Iml酶解液比例進行酶解反應。其中所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合的方法，其特征在于步驟(2)
白靈菇菌絲體原生質體酶解溫度34°C，酶解時間3h，杏鮑菇菌絲體原生質體酶解溫度34 °C，酶解時間2h。其中所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合的方法，其特征在于步驟(4)取濃度IO5個/ml的白靈菇原生質體5ml，采用55°C水浴熱滅活處理30min ;取IO5個/ml的杏鮑菇原生質體5ml,采用15W紫外燈下IOcm處垂直照射5min。其中所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合的方法，其中步驟(7)所述的甘露醇再生培養基:葡萄糖2.00%、麥芽糖2.00 %、酵母粉0.35 %、蛋白胨0.20 %、KH2PO4 0.30 %、MgSO4.7H20 0.15 %，VB10.001 %,0.6 mol/L 甘露醇，pH 自然。
其中所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合的方法，其中融合株綜合驗證，指的是采用頡頏實驗、菌落表型、菌絲形態、出菇試驗，并結合RAPD (隨機擴增片段多態性)分子生物學標記的方法。本發明所述的新鮮白靈菇菌絲的可以通過以下方法培養得到:取PDA綜合培養基上生長旺盛菌絲體前端，接種于裝有白靈菇液體培養基IOOmL三角瓶中，裝瓶量為50mL，每瓶接3 4塊0.5cm的菌塊，25°C靜置暗培養5 11 d ;無菌條件下挑取菌絲體，無菌濾紙吸干水分，即得到白靈菇新鮮的菌絲體。本發明所述的新鮮杏鮑菇菌絲的可以通過以下方法培養得到:取PDA綜合培養基上生長旺盛的兩親本菌絲體前端，接種于裝有杏鮑菇液體培養基IOOmL三角瓶中，裝瓶量為50mL，每瓶接3 4塊0.5cm的菌塊，25°C靜置暗培養5 11 d ;無菌條件下挑取菌絲體，無菌濾紙吸干水分，即得到杏鮑菇新鮮的菌絲體。本發明所述的白靈菇和杏鮑菇原生質體融合株菌落、子實體形態特征及生長特性如下:
融合株菌絲鎖狀聯合數較多、較明顯，菌落規則圓形，顏色潔白，長勢較親本弱，菇體類似白靈菇，菌蓋顏色為淺灰色，與 杏鮑菇相同，而且較親本不易破碎，菌柄顏色稍微發黃；繼承了兩親本的菌蓋不易碎，子實體單生的優良性狀。下面是本發明公開的白靈菇和杏鮑菇原生質體融合后的驗證方法及結果:
頡頏實驗:將白靈菇、杏鮑菇、融合株BXf轉分別接于PDA綜合平板培養基，25°C暗培養，7d后觀察菌落頡頏現象；每個平板內，隨著三菌株菌落的不斷延伸靠近，在三菌株交界處形成明顯的頡頏線。融合株由于自身和兩親本的影響，從正面看，長勢較兩親本弱，兩親本分泌的代謝產物強烈抑制融合株的生長；從背面看白靈菇和融合株BXf都有色素沉淀，因此可初步證明每個平板內不同于親本的種確為融合株再生所得。菌落表型:將白靈菇、杏鮑菇、融合株轉接于同一 PDA綜合平板培養基，同一條件培養；結果顯示白靈菇菌絲體粗壯而稀疏，潔白，菌落長勢不均勻，生長不同步，菌落邊緣不整齊。杏鮑菇菌絲體細而密，顏色潔白，長勢均勻，可以觀察到輪紋，但生長后期菌落表面會。融合株BXf菌落均為規則圓形，顏色潔白，三菌株之間有明顯差異。菌絲形態:插片培養法取白靈菇、杏鮑菇、融合株BXf菌絲體于光學顯微鏡下觀察；結果顯示杏鮑菇菌絲體分枝多，菌絲細而密，白靈菇菌絲體分枝少，菌絲粗而稀，健壯，鎖狀聯合比杏鮑菇明顯。融合株菌絲體形態與白靈菇最為接近，融合株鎖狀聯合數較多、較明顯。具有鎖狀聯合則可形成子實體，得到可育融合株，達到了實目的。出菇試驗:采用出菇培養料接種三菌株，通過發菌，育菇得到了兩親本及融合株子實體，白靈菇子實體形狀馬蹄形，單生或叢生，整個菇體潔白，厚實，菌蓋扁而大，邊緣向內卷曲，菌柄粗而肥厚，下部稍細；杏鮑菇子實體保齡球形狀，多群生或叢生，菇體酥脆，菌蓋灰褐色，相對于白靈菇來說較小，在生長初期呈半球形，成熟時呈淺凹圓形，表面平滑，菌柄呈棍棒球莖狀，表面平滑，顏色潔白。融合株BXf整個菇體類似于白靈菇，菌蓋顏色為淺灰色，與杏鮑菇相同，而且較親本不易破碎，菌柄顏色稍微發黃；經過一系列的比較得出:融合株繼承了兩親本的菌蓋不易碎、子實體單生的優良形狀，認為是理想的目的融合株。分子生物學標記:經過RAPD實驗，有8種隨機引物能擴增出三菌株基因組DNA，其中引物4種引物擴增效果最好，相對多態性更豐富，重復性更高，穩定性佳，擴增出DNA條帶大小在20(T2000bp之間。四種引物對白靈菇擴增出27條譜帶，杏鮑菇19條譜帶，融合株19條譜帶，比較電泳圖譜發現，融合株既有與白靈菇同源片段，又有與杏鮑菇相同片段，融合株與親本間均存在同源序列。本發明公開的白靈菇和杏鮑菇原生質體融合方法與現有技術相比所具有的積極效果在于:
(I)本發明首次通過白靈菇和杏鮑菇原生質體融合篩選出兼有菌蓋不易碎、子實體單生的雙親優良特性的新菌株，為選育兩種性狀互補的屬內種間融合目標的新菌株提供了一種有效的融合方法。(2)該白靈菇與杏鮑菇原生質體融合育種有別于傳統人工誘變育種，采用雙滅活的標記方法，能有效提高融合選育目的新菌株的成功概率，該技術可重復性較強，且方式屬于非轉基因育種方式，更有利于食品質量安全。


:
圖1白靈菇原生質體熱滅活涂板后再生的結果；
圖2杏鮑菇原生質體紫外滅活后涂板后再生的結果；
圖3再生培養基上再生的融合株BXf菌落；
圖4融合株BXf與雙親菌株頡頏反應 圖5融合株BXf與雙親菌株菌落形態比較(左:白靈菇沖:杏鮑菇，右:融合株BXf) 圖6引物S18(左)、S24(右)引物 擴增的RAI3D指紋圖譜；
圖7引物S33(左)、S37(右)引物擴增的RAI3D指紋圖譜；
圖8出菇試驗子實體形態(左:白靈菇；中:杏鮑菇，右:融合株BXf)。
具體實施例方式為了簡單和清楚的目的，下文恰當的省略了公知技術的描述，以免那些不必要的細節影響對本技術方案的描述。以下結合較佳實施例，對本發明做進一步的描述，下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為本技術領域現有的常規方法；所使用額材料、試劑等如無特殊說明均可從商業途徑購買得到。特別加以說明的是:其中白靈菇、杏鮑菇均為天津地區主要栽培種類，由天津師范大學蕈菌研究所提供，對外有售。白靈菇與杏鮑菇具體信息可見相關食用菌雜志及專業資料介紹。溶壁酶購于廣東碧德生物科技有限公司；蝸牛酶購于北京鼎國生物技術有限責任公司；本發明所用到的原料除特別說明外均為分析純，均可從市面試劑公司購買。實施例1
(I)取PDA綜合培養基上生長旺盛菌絲體前端，接種于裝有白靈菇液體培養基IOOmL三角瓶中，裝瓶量為50mL，每瓶接3 4塊0.5cm的菌塊，25°C靜置暗培養5 11 d ;無菌條件下挑取菌絲體，無菌濾紙吸干水分，即得到白靈菇新鮮的菌絲體。(2)取新鮮的白靈菇與杏鮑菇菌絲體，以0.1g濕重加Iml酶液比例進行酶解，其中白靈菇菌絲體原生質體酶解溫度34°C酶解時間3h，杏鮑菇菌絲體原生質體酶解溫度34°C解時間2h，本發明所述的白靈菇菌絲體酶解:以2ml 0.6mol/L MgSO4.7H20為滲透壓穩定劑，在Iml 1.50%溶壁酶與Iml 1.00%蝸牛酶作用下酶解；杏鮑菇的菌絲體酶解:以
0.6mol/L蔗糖為滲透壓穩定劑，配制Iml 2.00 %溶壁酶與1.00%蝸牛酶作用下酶解；(3)酶解完畢后，采用裝有孔徑10微米無菌濾網注射器過濾，去除菌絲殘片，6000r/min離心IOmin獲得原生質體沉淀,再將原生質體沉淀經0.6mol/L鹿糖滲透壓穩定劑重懸，再次6000r/min離心洗滌棄上清，分別用0.6mol/L蔗糖為滲透壓穩定劑調節濃度至IO5 個/ml。(4)取5ml IO5個/ml白靈菇原生質體采用55°C水浴處理30min ;取5ml IO5個/ml杏鮑燕原生質體紫外滅活采用15W紫外燈下IOcm處垂直照射5min ；
(5)分別將純化滅活后白靈菇與杏鮑菇原生質體懸浮于0.6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑中，調節濃度至IO5個/ml，按照懸液體積比1:1混合，3000r/min離心棄上清，沉淀中逐滴加入 30% PEG6000 與 IOml 50 mmol/L Ca2+混合溶液，28°C水浴融合 30min ;
(6)將處理好的原生質體懸液4000r/min離心15min,棄上清液；再用0.6mol/L鹿糖滲透壓穩定劑洗滌2次，盡可能去除PEG。(7)將融合處理好的原生質體沉淀用0.6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑稀釋至IO5個/ml，然后取0.1ml稀釋液涂布在0.6mol/L甘露醇再生培養基上，25°C暗培養7 15d，定期觀察菌落生長情況，待出現菌落時，及時挑出再生菌落轉接備份及獲得融合株。(8)融合株鑒定:通過對顏頏實驗、菌落表型、菌絲形態、出燕試驗,并結合RAPD分子生物學標記對融合株進行多角度綜合驗證。所述的PDA綜合培養基配方:馬鈴薯20.00%(浸提液)、棉籽皮20.00 %(浸提液)、葡萄糖 2.00 %、KH2PO4 0.30 %、MgSO4.7H20 0.15 %、Vbi 微量、瓊脂 1.60 %，先將馬鈴薯、棉籽皮加水煮沸30min過濾，濾液中再加入其它藥品完全溶解后，121°C滅菌30min，pH自然。所述的白靈菇液體培養基配方:葡萄糖2.00%、馬鈴薯20.00 % (浸提液)、酵母粉
0.35 %、蛋白胨 0.20 %、KH2PO4 0.30 %、MgSO4.7H20 0.15 %，VB10.001 %，pH 自然。所述的杏鮑菇液體培養基配方:葡萄糖2.00 %、麥芽糖2.00 %、麩皮0.20% (浸提液)、酵母粉 0.30 %、KH2PO4 0.30 %、MgSO4.7H20 0.15 %，VB10.001 %，pH 自然。所述的融合株再生培養基配方:葡萄糖2.00%、麥芽糖2.00 %、酵母粉0.35 %、蛋白胨 0.20 %,KH2PO4 0.30 %,MgSO4.7H20 0.15 qAVB10.001 %, 0.6 mol/L 甘露醇，pH 自然。(9)結合附圖對所出現的情況加以分析說明
實驗結果如附圖廣8所示。附圖1中，白靈菇原生質體熱滅活后涂板再生，在再生平板上沒有菌落出現，說明原生質體已經徹底滅活；附圖2杏鮑菇原生質體紫外滅活后涂板再生也無再生菌落出現，同樣說明原生質體已經滅活徹底；附圖3中再生菌落為融合株再生的菌落，初期培養l(T20d后平板出現白色扁平菌落，然后漸漸展開，菌絲纖細，顏色較暗。附圖4在三菌株交界處形成明顯的頡頏線。從背面看白靈菇和融合株BXf都有色素沉淀，可以推斷融合株BXf跟親本存在區別；附圖5白靈菇(左)菌絲體粗壯而稀疏，潔白，菌落長勢不均勻，生長不同步，菌落邊緣不整齊。杏鮑菇(中)菌絲體細而密，顏色潔白，長勢均勻，可以觀察到輪紋，融合株BXf(右)菌落均為規則圓形，顏色潔白，三菌株之間有明顯差異。附圖6^7 RAPD實驗，有8種隨機弓I物能擴增出三菌株基因組DNA，其中引物4種引物擴增效果最好，相對多態性更豐富，重復性更高，穩定性佳，擴增出DNA條帶大小在20(T2000bp之間。四種引物對白靈菇擴增出27條譜帶，杏鮑菇19條譜帶，融合株BXf 19條譜帶，比較電泳圖譜發現，融合株基因譜帶既有與白靈菇同源片段，又有與杏鮑菇相同片段，融合株與親本間均存在同源序列，又存在特有擴增片段 ；附圖8顯示白靈菇(左圖)子實體形狀馬蹄形，單生，整個菇體潔白，厚實，菌蓋扁而大，邊緣向內卷曲，菌柄粗而肥厚，下部稍細；杏鮑菇(中圖)子實體保齡球形狀，多群生或叢生，菇體酥脆，菌蓋灰褐色，相對于白靈菇來說較小，在生長初期呈半球形，成熟時呈淺凹圓形，表面平滑，菌柄呈棍棒球莖狀，表面平滑，顏色潔白。融合株BXf (右圖)整個菇體類似于白靈菇，菌蓋顏色為淺灰色，與杏鮑菇相同，而且較親本不易破碎，菌柄顏色稍微發黃；經過一系列的比較得出:融合株繼承了兩親本的菌蓋不易碎、子實體單生的優 良形狀。
權利要求
1.一種白靈菇和杏鮑菇原生質體的融合方法，其特征在于將白靈菇和杏鮑菇的菌絲體經酶解制備純化后的原生質體，以白靈菇原生質體熱滅活、以杏鮑菇原生質體紫外滅活作為標記，采用PEG介導的化學融合方法，將白靈菇和杏鮑菇原生質體融合，并通過頡頏實驗、菌落表型、菌絲形態、出菇試驗，并結合RAPD (隨機擴增片段多態性)綜合驗證得融合株； 所述的酶解液是白靈菇菌絲體酶解液以O. 6mol/L MgSO4 ·7Η20為滲透壓穩定劑，配制Iml I. 50% (質量體積比)溶壁酶與I. 00%蝸牛酶為混合酶解液；杏鮑菇的菌絲體酶解液以O. 6mol/L蔗糖為滲透壓穩定劑，配制Iml 2. 00 %溶壁酶與I. 00%蝸牛酶為混合酶解液； 所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合分別將純化后白靈菇與杏鮑菇原生質體懸浮于O.6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑中，調節濃度至IO5個/ml，按照原生質體懸液體積比1:1混合,3000r/min離心IOmin棄上清,O. 6mol/L鹿糖滲透壓穩定劑重懸沉淀后逐滴加入等體積30% (質量體積比)PEG6000與50 mmol/L Ca2+混合溶液，28°C水浴融合30min。
2.權利要求I所述白靈菇與杏鮑菇原生質體的融合方法，其特征在于它是按如下的步驟進行 (O白靈菇與杏鮑菇菌絲體制備； (2)原生質體的制備白靈菇原生質體制備采用液體靜置培養7d的菌絲體，以O.6mo I/L MgSO4 · 7H20為滲透壓穩定劑，在I. 50%溶壁酶與I. 00%蝸牛酶混合酶液作用下酶解；杏鮑菇原生質體制備采用液體靜置培養Ild的菌絲體，以O. 6mol/L蔗糖為滲透壓穩定齊[J，在2. 00%溶壁酶與I. 00%蝸牛酶混合酶液作用下酶解； (3)原生質體純化將步驟(2)所述酶液過濾去除菌絲殘片，6000r/min離心獲得原生質體沉淀，再將原生質體沉淀經O. 6mol/L鹿糖滲透壓穩定劑重懸,再次6000r/min離心洗滌棄上清，分別用O. 6mol/L蔗糖為滲透壓穩定劑調節濃度至IO5個/ml (4)原生質體滅活標記白靈菇原生質體采用55°C熱滅活標記處理30min;杏鮑菇原生質體采用紫外滅活采用15W紫外燈下IOcm處垂直照射5min標記處理； (5)雙親原生質體融合分別將純化滅活后白靈菇與杏鮑菇原生質體懸浮于O.6mol/L鹿糖滲透壓穩定劑中，調節濃度至IO5個/ml,按照懸液體積比1:1混合，3000r/min離心棄上清，沉淀中逐滴加入30% PEG6000 (聚乙二醇)與50 mmol/L Ca2+混合溶液，28°C水浴融合 30min ； (6)將步驟(4)處理好的原生質體懸液4000r/min離心15min,棄上清液；再用O.6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑洗滌2次，去除PEG ； (7)融合株再生將步驟(5)處理好的原生質體沉淀用O.6mol/L蔗糖滲透壓穩定劑稀釋至IO5個/ml，然后取O. Iml稀釋液涂布在O. 6mol/L甘露醇再生培養基上，25°C暗培養7 15d，定期觀察菌落生長情況，待出現菌落時，及時挑出再生菌落轉接備份及獲得融合株。
3.根據權利要求2所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合的方法，其特征在于步驟(I)所述的白靈菇與杏鮑菇菌絲體制備是指取PDA綜合培養基上生長旺盛的兩親本菌絲體前端，分別接種于裝有白靈菇和杏鮑菇液體培養基IOOmL三角瓶中，裝瓶量為50mL，每瓶接31塊O.5cm的菌塊，于25°C靜置、暗培養5 11 d ;無菌條件下挑取菌絲體，無菌濾紙吸干水分，即得到白靈菇與杏鮑菇新鮮的菌絲體。
4.根據權利要求2所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合的方法，其特征在于步驟(2)所述酶解是以O. Ig菌絲體(濕重)加入Iml酶解液比例進行酶解反應。
5.根據權利要求2所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合的方法，其特征在于步驟(2)白靈菇菌絲體原生質體酶解溫度34°C，酶解時間3h，杏鮑菇菌絲體原生質體酶解溫度34°C，酶解時間2h。
6.根據權利要求2所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合的方法，其特征在于步驟(4)取濃度IO5個/ml的白靈菇原生質體5ml，采用55°C水浴熱滅活處理30min ;取IO5個/ml的杏鮑菇原生質體5ml，采用15W紫外燈下IOcm處垂直照射5min。
7.根據權利要求2所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合的方法，其中步驟(7)所述的甘露醇再生培養基葡萄糖2. 00%、麥芽糖2. 00 %、酵母粉O. 35 %、蛋白胨O. 20 %,KH2PO4 O. 30%、MgSO4 · 7H20 O. 15 %，VB1O. 001 %,O. 6 mol/L 甘露醇，pH 自然。
8.根據權利要求I所述白靈菇與杏鮑菇原生質體融合的方法，其中融合株綜合驗證，指的是采用頡頏實驗、菌落表型、菌絲形態、出菇試驗，并結合RAPD (隨機擴增片段多態性)分子生物學標記的方法。
全文摘要
本發明提供了一種白靈菇和杏鮑菇原生質體的融合方法，其特征是將白靈菇和杏鮑菇菌絲細胞酶解制備原生質體，以白靈菇原生質體熱滅活、以杏鮑菇原生質體紫外滅活作為標記，采用PEG介導的化學融合方法，將白靈菇和杏鮑菇原生質體融合，并通過頡頏實驗、菌落表型、菌絲形態、出菇試驗，并結合RAPD(隨機擴增片段多態性)綜合驗證融合株。本發明有效把白靈菇和杏鮑菇原生質體融合獲得具有菌蓋不易碎、子實體單生特性的新菌株，為原生質體融合選育目的菌株提供了一種有效方法。
文檔編號C12N15/04GK103255127SQ20131013415
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月18日 優先權日2013年4月18日
發明者郭成金, 劉西周 申請人:天津師范大學