專利名稱：麻瘋樹輻射誘變的復合處理方法
技術領域：
本發明屬于植物輻射誘變處理技術領域，具體涉及一種麻瘋樹輻射誘變的復合處 理方法。
背景技術：
麻瘋樹生長快，適應性強，耐干旱瘠薄，種子含油量高、品質好，是目前最有發 展潛力的生物質能源樹種之一。其產業的發展得到了國際上一些政府、國際組織、研 究機構和企業的廣泛關注和重視。國內外研究表明培育出高產、優質的麻瘋樹品種是 該產業能更好發展的重要因素之一。因此，為了滿足該產業對優良品種的需要，研究 開發快速、高效的品種培育及育種材料創新技術具有重要意義。
植物育種從技術方面大體可分為雜交育種、選擇育種、生物技術育種和輻射誘變 育種等。其中雜交育種和生物技術育種要獲得優良品種一般需要長達數年或數十年的
研究，不僅過程漫長，且能否成功也無法預料。選擇育種方法是在現有資源基礎上選 擇出優良品種，其花費時間雖然相對較短，但卻要受到遺傳變異范圍窄的限制。
輻射育種技術是利用射線誘發生物遺傳性的改變，并經人工選擇培育新的優良品 種的技術。該技術具有打破性狀連鎖、實現基因重組、突變頻率高、突變類型多、變
異性狀穩定和方法簡便等特點。輻射誘變育種應用的射線源有y射線、x射線、e射
線、中子、激光和無線電波等。處理材料包括植物的種子、花粉、無性繁殖器官、組 織培養物(愈傷組織)和活體植株。由于輻射育種能提高變異頻率，加速育種進程，大 幅度改良植物的某些性狀，變異范圍廣，因而可創造人類需要的變異類型，從中選擇
培育出優良的生物品種。近年來，在園林植物育種中利用Co60-Y射線照射培育出不少 新品種(種子，2008年，第27巻，第12期，63-67頁)。目前，全世界通過輻射誘變 育成的植物品種達到2271個(現代農業科技，2008年，第13期，14-15頁)。雖然輻 射誘變育種技術有諸多優點，但在人們多年研究中也發現其還是存在一些明顯的缺陷 有利變異少，須大量處理材料；誘變的方向和性質不能控制；改良數量性狀效果較差， 具有一定的盲目性。
麻瘋樹育種研究開展較晚，種質資源改良滯后，野生資源利用研究進展緩慢，有研究者曾經開展過麻瘋樹種間雜交，但沒有獲得優良品種(Genetic Resources and Crop Evolution, 2003， 50:75-82)。目前，麻瘋樹輻射育種研究的報道也較少，主要是對 麻瘋樹種子的60Co- y射線輻射敏感性及半致死劑量進行了研究，其結果表明麻瘋樹種 子半致死劑量在130-200Gy,其中未見有種子產量高、含油率高的優良株系的研究報道 (南方醫科大學學報2009年，29: 506-508)。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術存在的不足，提供一種麻瘋樹輻射誘變的復合處理 方法。
本發明提供的麻瘋樹輻射誘變的復合處理方法，是將成熟帶殼的麻瘋樹種子先用 60Co-y射線輻射處理，然后取出其中的種胚在培養基中進行組織培養，其后用紫外線 照射種胚，最后繼代到培養基中繼續培育至長出麻瘋樹組培苗即可移栽至大田種植。
以上方法具體是按以下步驟和條件進行處理
(1) 用1. 0-2. 0Gy/min劑量率的60Co- y射線輻射處理1-2小時；
(2) 將輻射處理后剝去種殼的種仁放入消毒液中消毒，用無菌水沖洗4-7次，再 用無菌水浸泡24-48小時后，在無菌條件下取出種仁并吸干表面的水份，剝出帶有兩 片白色子葉的種胚，并接種在pH為5. 8-6. 0的MS培養基中培養10-24小時；
(3) 將組織培養中的種胚用250-290nm波長范圍的紫外線照射24-72小時后，繼 代到pH為5.8-6.0的培養基MS+生長素+細胞分裂素中，在溫度為26-30'C，光照度 2000LX,光照時間10 14h/d的組培室內繼續培育10-20天即可。
上述方法所述的消毒液為質量濃度0.1-0. 5%的氯化汞溶液或體積濃度70%乙醇溶 液與質量濃度0.1-0. 5%氯化汞溶液或質量濃度10%次氯酸鈉溶液。當選用質量濃度 0.1-0. 5%的氯化汞溶液消毒時，處理8-15分鐘。當選用乙醇溶液和氯化汞溶液組合消 毒時，先用體積濃度70%的乙醇溶液消毒處理20秒，然后再用質量濃度為0.1 0. 5% 的氯化隸溶液消毒處理7-10分鐘。當選用質量濃度10%次氯酸鈉溶液消毒時，處理 25-30分鐘。
上述方法所述的生長素為質量濃度0.1-0.2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、 B引哚乙酸(IM)或a-萘乙酸(NM)中的任一種。
上述方法所述的細胞分裂素為質量濃度0.1-0. 2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)。 本發明具有以下積極效果
1、由于本發明在充分利用60Co-y射線核輻射對麻瘋樹基因組改變的基礎上，通過組織培養對60Co- y輻射進行緩沖，并選擇輻射相對柔和的紫外線在種胚萌動時進行 照射，因而激發了麻瘋樹體內的調節機制，不僅與以往報道的單純用60Co-y射線核輻 射處理其它植物的誘變率(通常在1%以下)相比，大大增加了 (最高增加至8%)，且 部分處理方案還可形成有利的變異，使有利變異率可達1. 33%,從而拓寬了麻瘋樹種質 資源，為麻瘋樹高產、優質品種的選育奠定了基礎，可大大推動麻瘋樹生物能源產業 的原料生產。
2、 由于本發明提供的復合誘變技術在處理麻瘋樹種子時在多年對麻瘋樹生長環境 分析的基礎上，利用60Co-y核輻射技術，采取復合誘變處理技術對麻瘋樹進行輻射， 因而能提高有利變異率，克服輻射育種中有利變異少的缺點。
3、 由于本發明采用了復合誘變技術處理麻瘋樹種子，因而可得到種子含油率和產 量均高的優良株系，其中采用1.5 Gy/min劑量率的Co60-y射線處理120分鐘，組織 培養24小時，250-290nm波長紫外線照射48小時，與對照組相比其后代種子含油率平 均提高2%、單株種子產量提高8%。
具體實施例方式
下面給出實施例以對本發明作進一步說明，但所給出的實施例不能理解為對本發 明保護范圍的限制，因而本專業的技術人員根據上述本發明的內容和設計思想所作出 的非本質的改進和調整也應屬于本發明的保護范圍。
另外，值得說明的是為了保證原初材料具有相同的遺傳背景，便于分析誘變率， 以下實施例所用種子都是在同一棵樹采集的成熟麻瘋樹種子。其中取一部分，不做任 何處理，與處理過的種子種植在同一地塊種植作對照組。觀察各處理種子的植株性狀 變化，種子產量和含油率，同時利用該植株的擴增片段長度多態性分子標記(ALFP) 來檢測處理組與對照組基因差異，從而確定輻射后種子和種胚的植株是否發生變異， 進而計算出該處理的誘變率(誘變率=變異植株數/處理種子數><100%),當處理組植株 比對照組植株的麻瘋樹種子含油率高3%以上或種子單株產量高7%以上時，確定為麻瘋 樹的有利變異，計算出有利變異率(有利變異率=有利變異植株數/處理種子數乂100%)。 種子含油率參考國標GB/T 14488.1-2008進行測定；單株種子產量采用收獲單株種子, 30'C下烘48小時統一稱重測量。
實施例1
將采集的成熟麻瘋樹種子用1.0Gy/min劑量率的60Co- y射線輻射處理1小時；將 剝去種殼的種仁先放入體積濃度70%的乙醇中消毒處理20秒，然后放入質量濃度0.1%的氯化汞溶液中消毒處理15分鐘，取出用無菌水沖洗4次，再用無菌水浸泡24小時 后，在無菌條件下取出種仁并吸干表面的水份，剝出帶有兩片白色子葉的種胚，并接 種在pH為5. 8的MS培養基中培養10小時；將組織培養中的種胚用250-290nm波長范 圍的紫外線照射24小時后，繼代到含質量濃度0. lmg/L的2, 4-D 、質量濃度0. 2mg/L 的6-BA ，且pH為5. 8的培養基MS中，在溫度為26°C ，光照度2000LX，光照時間10h/d 的組培室內繼續培育15天即可。
通過本發明方法處理的種子的后代變異率為1. 33%，后代平均單株產量增加1.1%。
實施例2
將采集的成熟麻瘋樹種子用1. 5Gy/min劑量率的60Co- Y射線輻射處理1. 5小時； 將剝去種殼的種仁先放入體積濃度70%的乙醇中消毒處理20秒，然后放入質量濃度 0.5%的氯化汞溶液中消毒處理8分鐘，取出用無菌水沖洗4次，再用無菌水浸泡48小 時后，在無菌條件下取出種仁并吸干表面的水份，剝出帶有兩片白色子葉的種胚，并 接種在pH為5.9的MS培養基中培養20小時；將組織培養中的種胚用250-290nm波長 范圍的紫外線照射48小時后，繼代到含質量濃度0. 2mg/L的2, 4-D 、質量濃度0. 2mg/L 的6-BA ，且pH為5. 8的培養基MS中，在溫度為26°C ，光照度2000LX，光照時間12h/d 的組培室內繼續培育10天即可。
通過本發明方法處理的種子的后代變異率2%，后代平均單株產量增加1. 2%。
實施例3
將采集的成熟麻瘋樹種子用1. 5Gy/min劑量率的60Co- Y射線輻射處理2小時;將 剝去種殼的種仁放入質量濃度0. 3%的氯化汞溶液中消毒處理10分鐘，取出用無菌水沖 洗7次，再用無菌水浸泡30小時后，在無菌條件下取出種仁并吸干表面的水份，剝出 帶有兩片白色子葉的種胚，并接種在pH為6.0的MS培養基中培養24小時；將組織培 養中的種胚用250-290nm波長范圍的紫外線照射48小時后，繼代到含質量濃度0. 2mg/L 的2， 4-D 、質量濃度0. lmg/L的6-BA ，且pH為5. 9的培養基MS中，在溫度為27°C， 光照度2000LX,光照時間14h/d的組培室內繼續培育10天即可。
通過本發明方法處理的種子的后代變異率跳，有利變異率1. 33%,后代平均種子 含油率增加2%,后代平均單株產量增加8%。
實施例4
將采集的成熟麻瘋樹種子用1. 5Gy/min劑量率的60Co-Y射線輻射處理1. 5小時； 將剝去種殼的種仁放入質量濃度0.1%的氯化汞溶液中消毒處理12分鐘,取出用無菌水沖洗5次，再用無菌水浸泡24小時后，在無菌條件下取出種仁并吸干表面的水份，剝 出帶有兩片白色子葉的種胚，并接種在pH為6.0的MS培養基中培養18小時；將組織 培養中的種胚用250-290nm波長范圍的紫外線照射72小時后，繼代到含質量濃度 0. lmg/L的2， 4-D 、質量濃度0. lmg/L的6-BA ，且pH為6. 0的培養基MS中，在溫度 為27'C，光照度2000LX，光照時間14h/d的組培室內繼續培育10天即可。
通過本發明方法處理的種子的后代變異率2. 67%,后代平均種子含油率增加2%。
實施例5
將采集的成熟麻瘋樹種子用2. OGy/min劑量率的60Co- Y射線輻射處理1小時；將 剝去種殼的種仁放入質量濃度0.5%的氯化汞溶液中消毒處理10分鐘，取出用無菌水沖 洗5次，再用無菌水浸泡48小時后，在無菌條件下取出種仁并吸干表面的水份，剝出 帶有兩片白色子葉的種胚，并接種在pH為5.8的MS培養基中培養20小時；將組織培 養中的種胚用250-290nm波長范圍的紫外線照射24小時后，繼代到含質量濃度0. lmg/L 的IM、質量濃度0. 2mg/L的6-BA ,且pH為6. 0的培養基MS中，在溫度為28°C,光 照度2000LX，光照時間14h/d的組培室內繼續培育15天即可。
通過本發明方法處理的種子的后代變異率2. 67%，后代平均單株產量增加1. 2%。
實施例6
將采集的成熟麻瘋樹種子用1. OGy/min劑量率的60Co- Y射線輻射處理2小時；將 剝去種殼的種仁放入質量濃度10%的次氯酸納溶液中消毒處理8分鐘，取出用無菌水沖 洗6次，再用無菌水浸泡36小時后，在無菌條件下取出種仁并吸干表面的水份，剝出 帶有兩片白色子葉的種胚，并接種在pH為5.8的MS培養基中培養20小時；將組織培 養中的種胚用250-290nm波長范圍的紫外線照射24小時后，繼代到含質量濃度0. 2mg/L 的IM、質量濃度0. lmg/L的6-BA ，且pH為5. 9的培養基MS中，在溫度為29'C,光 照度2000LX，光照時間12h/d的組培室內繼續培育20天即可。
通過本發明方法處理的種子的后代變異率1. 33%，后代平均單株產量增加1. 2%。
實施例7
將采集的成熟麻瘋樹種子用2. OGy/min劑量率的60Co- Y射線輻射處理1. 5小時； 將剝去種殼的種仁放入質量濃度10%的次氯酸納溶液中消毒處理10分鐘，取出用無菌 水沖洗6次，再用無菌水浸泡48小時后，在無菌條件下取出種仁并吸干表面的水份， 剝出帶有兩片白色子葉的種胚，并接種在pH為5.9的MS培養基中培養24小時；將組 織培養中的種胚用250-290nm波長范圍的紫外線照射24小時后，繼代到含質量濃度0. lmg/L的NM、質量濃度0. lmg/L的6-BA ，且pH為5.8的培養基MS中，在溫度為 30°C，光照度2000LX,光照時間12h/d的組培室內繼續培育20天即可。
通過本發明方法處理的種子的后代變異率4.67%，有利變異率1.33%，后代平均種 子含油率增加5. 2%。
實施例8
將采集的成熟麻瘋樹種子用2. OGy/min劑量率的60Co- y射線輻射處理2小時；將 剝去種殼的種仁放入質量濃度10%的次氯酸納溶液中消毒處理15分鐘，取出用無菌水 沖洗7次，再用無菌水浸泡24小時后，在無菌條件下取出種仁并吸干表面的水份，剝 出帶有兩片白色子葉的種胚，并接種在PH為5.9的MS培養基中培養18小時；將組織 培養中的種胚用250-290nm波長范圍的紫外線照射48小時后，繼代到含質量濃度 0. 2mg/L的NM、質量濃度0. 2mg/L的6-BA ，且pH為6. 0的培養基MS中，在溫度為 30°C,光照度2000LX，光照時間12h/d的組培室內繼續培育20天即可。
通過本發明方法處理的種子的后代變異率1. 33%,后代平均種子含油率增加2%。
權利要求
1、一種提高麻瘋樹誘變率的輻射誘變復合處理方法，該方法是將成熟帶殼的麻瘋樹種子先用60Co-γ射線輻射處理，然后取出其中的種胚在培養基中進行組織培養，其后用紫外線照射種胚，最后繼代到培養基中繼續培育至長出麻瘋樹組培苗即可移栽至大田種植。
2、 根據權利要求1所述的提高麻瘋樹誘變率的輻射誘變復合處理方法，該方法具 體是按以下步驟和條件進行處理(1) 用1. 0-2.0Gy/min劑量率的60Co- Y射線輻射處理1-2小時；(2) 將輻射處理后剝去種殼的種仁放入消毒液中消毒，用無菌水沖洗4-7次，再 用無菌水浸泡24-48小時后，在無菌條件下取出種仁并吸干表面的水份，剝出帶有兩 片白色子葉的種胚，并接種在pH為5. 8-6. 0的MS培養基中培養10-24小時；(3) 將組織培養中的種胚用250-290nm波長范圍的紫外線照射24-72小時后，繼 代到pH為5.8-6.0的培養基MS+生長素+細胞分裂素中，在溫度為26-3CTC，光照度 2000LX,光照時間10-14h/d的組培室內繼續培育10-20天即可。
3、 根據權利要求2所述的提高麻瘋樹誘變率的輻射誘變復合處理方法，該方法所 述的消毒液為質量濃度0.1-0.5%的氯化汞溶液或體積濃度70%乙醇溶液與質量濃度 0.1-0. 5%氯化汞溶液或質量濃度10%次氯酸鈉溶液。
4、 根據權利要求3所述的提高麻瘋樹誘變率的輻射誘變復合處理方法，該方法中 用質量濃度0.1-0. 5%的氯化汞溶液消毒處理8-15分鐘。
5、 根據權利要求3所述的提高麻瘋樹誘變率的輻射誘變復合處理方法，該方法中 用體積濃度70%的乙醇溶液先消毒處理20秒，然后再用質量濃度為0.1 0. 5%的氯化 汞溶液消毒處理7-IO分鐘。
6、 根據權利要求3所述的提高麻瘋樹誘變率的輻射誘變復合處理方法，該方法中 用質量濃度10%的次氯酸鈉溶液消毒處理25-30分鐘。
7、 根據權利要求2-6中任一項所述的提高麻瘋樹誘變率的輻射誘變復合處理方法， 該方法所述的生長素為質量濃度0.1-0.2mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚乙酸或a-萘乙酸中的任一種。
8、 根據權利要求2-6中任一項所述的提高麻瘋樹誘變率的輻射誘變復合處理方法,該方法所述的細胞分裂素為質量濃度0.1-0. 2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤。
9、根據權利要求7所述的提高麻瘋樹誘變率的輻射誘變復合處理方法，該方法所 述的細胞分裂素為質量濃度0.1-0. 2mg/L的6-節氨基腺嘌呤。
全文摘要
本發明公開提高麻瘋樹誘變率的輻射誘變復合處理方法，該方法是將成熟帶殼的麻瘋樹種子先用60Co-γ射線輻射處理，然后取出其中的種胚在培養基中進行組織培養，其后用紫外線照射種胚，最后繼代到培養基中繼續培育至長出麻瘋樹組培苗即可移栽至大田種植。由于本發明在充分利用60Co-γ射線核輻射對麻瘋樹基因組改變的基礎上，通過組織培養對60Co-γ輻射進行緩沖，并選擇輻射相對柔和的紫外線在種胚萌動時進行照射，因而激發了麻瘋樹體內的調節機制，大大提高了誘變率，使有利變異率可達1.33％，從而拓寬了麻瘋樹種質資源，為麻瘋樹高產、優質品種的選育奠定了基礎。
文檔編號A01H1/06GK101606485SQ20091005999
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月15日 優先權日2009年7月15日
發明者軍 吳, 琳 唐, 鶯 徐, 王勝華, 放 陳 申請人:四川大學