專利名稱：一種添加苦瓜的雞腿蘑液體發酵工藝及發酵產品的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物發酵領域，具體的說本發明涉及一種添加苦瓜的雞腿磨液體深層發酵工藝，該工藝包括以雞腿蘑為出發菌株，進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養和添加苦瓜的發酵培養。本發明還涉及由該工藝制備的添加了苦瓜的雞腿蘑深層發酵液。本發明的工藝解決了雞腿蘑大規模液體培養的難題，大大提高了發酵液的活性，對于雞腿蘑的產業開發具有重要的意義。
背景技術：
雞腿蘑(Coprinus comatus)，又名雞腿菇、毛頭鬼傘，其肉質細嫩，鮮美可口。雞腿蘑還含有20種氨基酸，其中包括8種人體必需的氨基酸。經常食用有助于消化、增加食欲和治療痔瘡的作用。我國傳統醫學對其藥性有過不少記載“甘、平、無毒”，“主小兒寒熱癇”(《別錄》)，“和醋敷腫毒、惡瘡”(《本草拾遺》)。
據載，雞腿蘑熱水提取物對小白鼠肉瘤180和艾氏癌抑制率分別為100％和90％。另據阿斯頓大學報道，雞腿蘑含有治療糖尿病的有效成分，能明顯降低血糖濃度，是糖尿病人食療選擇的理想菇種。
雞腿蘑發展潛力很大，已被確定為聯合國糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)要求的新的菌類進行推廣。雞腿蘑在我國的發展很快，目前已初具規模，前景十分廣闊。
從60年代起，德國、捷克斯洛伐克和英國的食用菌研究人員就開始了雞腿蘑的馴化工作。近年荷蘭、法國等相繼栽培成功。目前一些國家已開始大規模商業化栽培。根據已掌握的資料，目前國外對雞腿蘑的研究主要集中在幾個方面①對于環境的意義，它可富集環境中的鉛，因此可作為環境污染的指示植物，它還可以將環境中的汞甲基化，減少汞的危害；②環境中散布的雞腿蘑和過敏癥及哮喘病的關系；③雞腿蘑的酒精提取液對肝損壞的抑制作用，以及雞腿蘑的子實體和菌絲體的提取液抗誘變的作用；④雞腿蘑是纖維素酶的良好來源，它所分泌的纖維素酶活力較高。此外，國外有學者研究利用雞腿蘑來轉化生產利福霉素。
近些年國內對雞腿蘑的研究主要集中于它的馴化栽培、營養成分分析等方面，對于雞腿蘑的液體培養國內也有研究和報道。由于雞腿蘑多糖的醫療功效，一些學者從培養基、培養條件和糖類等營養因子對雞腿蘑胞外多糖的影響進行了深入的研究，但未見有關大規模雞腿蘑深層發酵的報道，而在雞腿蘑發酵培養基中添加中藥也未見報道。
對于雞腿蘑的降血糖功能，山東大學的王玉萍等進行了富鉻雞腿蘑菌絲體發酵液降血糖作用的研究，證明了其發酵液開發成預防和治療糖尿病的保健品和(或)藥品的可能性；韓春超等人進行了雞腿蘑發酵液與釩酸鈉協同抑制小鼠血糖升高作用的研究，結果表明，雞腿蘑釩酸鈉溶液能抑制小鼠血糖的升高。
苦瓜(Momordica charantia L.；Bitter Melon)別名錦荔枝、癩葡萄、涼瓜、紅羊，是葫蘆科苦瓜屬蔓性一年生蔬菜，喜溫怕寒，在我國南方栽培歷史悠久。苦瓜營養價值高，嫩果中含有豐富的礦物質、氨基酸和多種維生素。此外，苦瓜也是一種傳統的中藥材，關于苦瓜的記載最早始于明代《滇南本草》，以后又有許多記載。《本草綱目》曰“去邪熱，解勞乏，清心明目。”苦瓜性苦寒，具有清熱解毒，滋養強壯等功效。
目前，雞腿蘑主要以子實體的形式在市場上銷售，而有關雞腿蘑的保健品也只局限于其子實體粉末。而目前也尚無添加苦瓜的雞腿磨大規模液體深層發酵工藝方面的論文和專利報道。
本發明人經過深入的研究提供了一種雞腿蘑大規模深層發酵工藝，以及由該工藝獲得的雞腿蘑發酵液，該發酵液在藥物和/保健品的制備方面具有廣闊的前景，例如可用于制備預防和治療糖尿病、癌癥等疾病的藥物和/或保健品，特別適用于制備預防和/或治療糖尿病的藥物和/或保健品。

發明內容
本發明的目的是提供了一種雞腿蘑大規模液體深層發酵工藝，其特征是在所述的發酵工藝中添加了中藥苦瓜。
本發明的液體深層發酵工藝包括以雞腿蘑為出發菌株，進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養和發酵培養，其特征在于在所述的一級種子培養和發酵培養中添加了苦瓜物質，所述的苦瓜物質是由普通的苦瓜經過預處理后獲得的。
具體地，在本發明添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝中，所述搖瓶培養的培養基組成為(單位為克/升)葡萄糖15～35，玉米粉10～20，麩皮5～10，酵母膏1～4，玉米漿2～5，KH2PO4 2～4，MgSO4 3～6，加水至適當體積，起始pH值為5.8～7.0；搖瓶培養的培養條件是培養溫度22～30℃，轉速120～160轉/分鐘，培養時間120～140小時。
本發明添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝中，所述擴大培養的培養基組成為(單位為克/升)葡萄糖15～35，玉米粉10～20，麩皮5～10，KH2PO4 2～4，MgSO4 3～6，加水至適當體積，起始pH值為5.8～7.0；擴大培養的培養條件是接種量5～10％(體積百分比)，培養溫度22～30℃，轉速120～160轉/分鐘，培養時間90～96小時。
本發明添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝中，所述一級種子培養的培養基組成為(單位為克/升)葡萄糖15～30，玉米粉15～25，麩皮5～10，苦瓜物質0～7.5，KH2PO4 2～4，MgSO4 1～3，加水至適當體積，起始pH值為5.8～7.0；一級種子培養的培養條件是接種量5～10％(體積百分比)，培養溫度22～30℃，攪拌速率90～150轉/分鐘，通風量1∶0.3～1v/v/m，培養時間80～90小時。
本發明添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝中，所述發酵培養的培養基組成為(單位為克/升)葡萄糖10～20，玉米粉10～20，麩皮5～10，苦瓜物質5～20，KH2PO4 2～4，MgSO4 1～3，加水至適當體積，pH值為6.0～7.0；發酵培養的培養條件是接種量5～10％(體積百分比)，培養溫度22～30℃，攪拌速率90～125轉/分鐘，通風量1∶0.3～0.8v/v/m，培養時間90～120小時。
由本發明添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝所得到的發酵液的菌絲體干重可達7～10克每升，對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率可達93～98％。
蛋白質非酶糖基化是指葡萄糖與蛋白質的游離氨基酸進行的一系列非酶促反應，它是糖尿病患者體內的一種非正常的生理生化反應，最終形成糖基化末端產物(advanced end-products，AGEs)，造成蛋白質結構改變、功能降低和老化，引起糖尿病慢性并發癥。而糖尿病慢性并發癥是糖尿病患者致殘和死亡的主要原因。因此，非酶糖基化(AGEs)的抑制率可作為糖尿病治療效果的指示參數之一。
在本發明的雞腿磨深層發酵工藝中，苦瓜的添加量對雞腿蘑的發酵有一定的影響。當苦瓜添加量過大時會抑制雞腿蘑的生長，從而抑制了有效物質的產生；當添加量適中時可以促進雞腿蘑有效物質的產生。但具體的影響機理還需要進一步研究。以發酵培養階段為例，當培養基中苦瓜的添加量小于5克/升克/升時對發酵基本沒有影響，而當培養基中苦瓜的添加量大于20克/升時則會抑制雞腿蘑的生長，從而也會影響到發酵液的功效。因此，在發酵培養階段，苦瓜物質的添加量以5～20克/升為宜，優選7.5-12.5克/升。
本發明添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝中，所述發酵培養工藝適于在500～2000L的發酵罐中進行發酵。
更具體地，本發明的發酵工藝通過以下步驟來實現(1)取出雞腿蘑菌種的斜面菌種接入新配制的斜面培養基中，培養溫度22～30度，培養時間140～240小時；(2)將步驟1中的斜面菌種轉接入裝有上述搖瓶培養基的三角瓶中，22～30度培養，轉速120～160轉每分鐘，培養時間120～140小時，然后進行搖瓶擴大培養；(3)將步驟2中的搖瓶菌種按5～10％的接種量轉接入裝有上述搖瓶擴大培養基的三角瓶中進行擴大培養，22～30℃培養，轉速120～160轉每分鐘，90～96小時后轉接入一級種子罐進行培養；(4)將步驟3中的搖瓶菌種按5～10％的接種量轉接入裝有上述一級種子培養基的種子罐中，22～30℃培養，種子罐壓力0.05Mpa，攪拌速率90～150轉每分鐘，通風量1∶0.3～1v/v/m，培養80～90小時后接入發酵罐進行發酵；和(5)將種子罐中的菌種按5～10％的接種量轉接入裝有上述發酵培養基的發酵罐中，22～30℃培養，發酵罐壓力0.05Mpa，攪拌速率90～125轉每分鐘，通風量1∶0.3～0.8v/v/m，培養90～120小時。
其中所述的斜面培養基配方為土豆培養基，該培養基在多種教科書和論文中均有表述，這里不再詳細列出其組成；所述的搖瓶培養基、一級種子培養基和發酵培養基如上文所述。
本發明所使用的雞腿蘑菌種可選用任意一種雞腿蘑菌種，例如可購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)的CGMCCNo.5.156，CGMCC No.5.252和CGMCC No.5.258。
本發明步驟2中的搖瓶培養基與三角瓶容積之比可以是3∶10左右。
本發明步驟3中的擴大培養基與三角瓶容積之比可以是3∶10左右。
當本發明步驟4中的一級種子罐的容積為50～100L時，其中裝有的一級種子培養基的量相應為30～70L。
當本發明步驟5中的發酵罐的容積為500～2000L時，其中裝有的發酵培養基的量相應為300～1400L。
本發明的工藝適于在500～2000L的發酵罐規模進行的發酵培養工藝，結合本領域的基本知識可以進一步根據生產需要擴大發酵規模。
本發明一級種子培養和發酵培養中所使用的苦瓜物質由普通苦瓜經過預處理后獲得，其可以是固體，或者是漿狀物的形式。所述的苦瓜物質可通過下述二種預處理方法制備(1)將苦瓜切片去籽，在60℃左右烘干后粉碎，得到苦瓜的干物質；或(2)將苦瓜去籽后打碎勻漿，得到苦瓜的漿狀物。
所得到的苦瓜干物質和漿狀物均可直接由于發酵工藝，當以漿狀物的形式使用時，其使用量按相應的干物質重量計算。
本發明的另一目的是提供了一種由本發明的雞腿蘑深層發酵工藝制備的雞腿蘑深層發酵液，以及由該發酵液制備的固體產品和其它形式的產品，例如發酵液的上清液，或上清液的濃縮物等。該產品的特征是在所述產品的發酵工藝中添加了中藥苦瓜。所述的苦瓜以本發明特定的苦瓜物質的形式加入，所述苦瓜物質是由前文所述方法制備的。
本發明的雞腿蘑發酵液為淡黃色到棕色的，有一定粘度的液體，其中的菌絲體為淡黃色，菌絲體的干重可達7～10克每升，該發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率高達93％以上，例如可以達到93％～98％。本發明的雞腿蘑固體發酵產品是從淡黃色到棕褐色的固體。所述的固體發酵產品是由發酵液經過下述方法獲得將發酵液離心分離，在固形物(主要為菌絲)中加水，高壓破碎，均質，然后冷凍干燥獲得發酵液的固體產物。
本發明雞腿蘑發酵液的上清液可以通過將發酵液離心分離獲得。上清液的濃縮物可以通過將上清液濃縮至一定的體積后獲得。
本發明的各種雞腿蘑深層發酵產品均可用于制備預防和/或治療糖尿病、癌癥等疾病的藥物和/或保健品，特別適用于制備預防和/或治療糖尿病的藥物和/或保健品。
本發明的發酵工藝解決了雞腿蘑大規模液體培養的難題，同時由于在發酵培養基中加入中藥苦瓜，在發酵過程中雞腿蘑與苦瓜之間發生生物轉化，大大提高了發酵液的活性，使雞腿蘑發酵產品更具有實際應用價值。通常，單純雞腿蘑發酵液其體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率僅為65～70％，而本發明添加了苦瓜的雞腿磨發酵液的體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率可達到93％以上。因此，本發明的產品和方法對于雞腿蘑的產業開發具有重要的意義，同時也為中藥的開發提供了一種新的途徑。
本發明的另一目的是提供了本發明添加苦瓜的雞腿磨深層發酵液的應用，根據雞腿蘑已經公開的性能，可以將所述的發酵液制成具有相應功能的藥物和/或保健品。例如，可將該發酵液應用于預防和/或治療糖尿病的藥物和/或保健品的制備，或將其應用于預防和/或治療癌癥的藥物和/或保健品的制備。以上所述的藥物和/或保健品可以以液體和/或固體的形式存在，可以制備成口服液，口服膠囊、口服片劑、肌肉注射和/或固體靜脈注射的針劑。
在將本發明的發酵液由于制備任一藥物和/或保健品時，其制備方法和/或制備中所用的輔料可采用藥物和/或保健品制備領域中常規的的方法和材料，制成常規的藥物和/或保健品形式。
具體實施例方式
為了進一步闡述本技術所涉材料及施工工藝，給出了下述實施例。但是，這些實施例不以任何方式限制本發明的范圍。
制備實施例1苦瓜固體干粉的制備將新鮮苦瓜切片去籽，在60℃左右烘干后粉碎，過40目篩，得到苦瓜干粉。使用時直接以干粉的形式添加。
制備實施例2苦瓜漿狀物的制備將新鮮苦瓜去籽后用組織搗碎機打碎勻漿，使用前測定其干物質含量，添加時按與其相當的干物質重量計算。
實施例1雞腿蘑發酵液的制備在新鮮的斜面培養基中接入雞腿蘑菌絲體，雞腿蘑菌種是CGMCCNo.5.252(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)，培養溫度25.5℃，待菌絲體長滿斜面后，將斜面菌種接入裝有75mL搖瓶培養基的250mL三角瓶中(共5瓶)，于25.5℃、150轉/分鐘搖床培養130小時。其中所述搖瓶培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖25，玉米粉15，麩皮7.5，酵母膏3，玉米漿3，KH2PO4 3，MgSO4 4，起始pH值為6.3。
將上述搖瓶菌種接入裝有150mL擴大培養基的500mL三角瓶中(共24瓶)，接種量為每500mL三角瓶接入11mL搖瓶種子，于25.5℃、150轉/分鐘搖床培養93小時。其中所述擴大培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖20，玉米粉15，麩皮8，KH2PO4 3，MgSO4 4.5，起始pH值為6.3。
將上述擴大培養的菌種3600mL接入裝有44.9L一級種子培養基的75L種子罐中，種子罐中發酵液的總體為48.5L；維持罐溫25.5℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率120轉每分鐘，通風量1∶0.6 v/v/m，發酵時間85小時。其中種子罐中的一級種子培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖20，玉米粉20，麩皮8，KH2PO4 3，MgSO4 2，起始pH值為6.3。
然后將48.5L一級種子菌種接入裝有600L發酵培養基的1000L發酵罐中，發酵罐中發酵液的總體為648.5L。維持罐溫25.5℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率100轉每分鐘，通風量1∶0.5 v/v/m，發酵時間96小時。其中發酵罐中的發酵培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖15，玉米粉15，麩皮7.5，苦瓜固體干粉12.5，KH2PO4 3，MgSO4 2，起始pH值為6.4。
最終獲得的發酵液菌絲體的干重為9克/升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達96.7％。
發酵液菌絲體干重和發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測試方法如下發酵液菌絲體干重的測定方法取100ml發酵液，離心(3000r/min)20分鐘，沉淀物用水洗滌3次，收集菌絲體，于60℃烘干至恒重，稱重后得菌絲體干重。
發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測定方法1]體外非酶糖基化系統將BSA(牛血清白蛋白)(10mg/mL)、己二醛(12mg/mL)和NaN3(疊氮化鈉)(2mg/mL)溶于pH7.4、0.2mol/L的PBS(磷酸緩沖液)中。
2]體外非酶糖基化發酵液干預實驗取1ml上述PBS溶液，干預組加入1ml發酵液、以加1ml蒸餾水的未干預組為空白，震蕩混勻，37℃避光孵育15天，而后定容至10ml待測。
3]AGEs的測定及抑制率的計算采用Hitachi Fluorescence Spectrophotometer 650-60型熒光分光光度計，激發波長370nm，狹長5nm，發射波長440nm，狹長6nm。
發酵液對非酶糖基化反應的抑制作用以抑制率表示，計算公式如下 實施例2雞腿蘑發酵液的制備此實施例所用的菌種與實施例1相同。
在新鮮的斜面培養基中接入雞腿蘑菌絲體，培養溫度22℃，待菌絲體長滿斜面后，將斜面菌種接入裝有75mL搖瓶培養基的250mL三角瓶中(共3瓶)，22℃、120轉每分鐘搖床培養140小時。然后將此搖瓶菌種接入裝有150mL擴大培養基的500mL三角瓶中(共10瓶)，接種量為每500mL三角瓶接入15mL搖瓶種子，22℃、120轉每分鐘搖床培養96小時。然后將此擴大培養的菌種1500mL接入裝有28.5L一級種子培養基的50L種子罐中，種子罐中發酵液的總體為30L；維持罐溫22℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率90轉每分鐘，通風量1∶1 v/v/m，發酵時間90小時。最后將30L一級種子菌種接入裝有320L發酵培養基的500L發酵罐中，發酵罐中發酵液的總體為350L；維持罐溫22℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率90轉每分鐘，通風量1∶0.8 v/v/m，發酵時間120小時。
由上述方法獲得的發酵液菌絲體的干重為7.5克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達93.0％。
本實施例使用的各種培養基的配方如下搖瓶培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖15，玉米粉10，麩皮5，酵母膏1，玉米漿2，KH2PO4 2，MgSO4 3，起始pH值為5.8。
擴大培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖15，玉米粉10，麩皮5，KH2PO4 2，MgSO4 3，起始pH值為5.8。
一級種子培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖15，玉米粉15，麩皮5，KH2PO4 2，MgSO4 1，起始pH值為5.8。
發酵培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖10，玉米粉10，麩皮5，苦瓜固體干粉5，KH2PO4 2，MgSO4 1，起始pH值為6.0。
發酵液菌絲體干重和發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測試方法同實施例1。
實施例3雞腿蘑發酵液的制備此實施例所用的菌種與實施例1相同。
在新鮮的斜面培養基中接入雞腿蘑菌絲體，培養溫度30℃，待菌絲體長滿斜面后，將斜面菌種接入裝有75mL搖瓶培養基的250mL三角瓶中(共3瓶)，30℃、160轉每分鐘搖床培養120小時。然后將此搖瓶菌種接入裝有300mL擴大培養基的1000mL三角瓶中(共12瓶)，接種量為每1000mL三角瓶接入15mL搖瓶種子，30℃、160轉每分鐘搖床培養90小時。然后將此擴大培養的菌種3600mL接入裝有66.4L一級種子培養基的100L種子罐中，種子罐中發酵液的總體為70L；維持罐溫30℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率90轉每分鐘，通風量1∶0.3v/v/m，發酵時間80小時。最后將70L一級種子菌種接入裝有1330L發酵培養基的2000L發酵罐中，發酵罐中發酵液的總體為1400L；維持罐溫30℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率125轉每分鐘，通風量1∶0.3v/v/m，發酵時間90小時。
由上述方法獲得的發酵液菌絲體的干重為7.0克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達94.0％。
本實施例中所使用的各種培養基的配方如下搖瓶培養基的配方為(單位為克每升)葡萄糖35，玉米粉20，麩皮10，酵母膏4，玉米漿5，KH2PO4 4，MgSO4 6，起始pH值為7.0。
擴大培養基的配方為(單位為克每升)葡萄糖35，玉米粉10，麩皮10，KH2PO4 4，MgSO4 6，起始pH值為7.0。
一級種子培養基的配方為(單位為克每升)葡萄糖30，玉米粉25，麩皮10，苦瓜固體干粉7.5，KH2PO4 4，MgSO4 3，起始pH值為7.0。
發酵培養基的配方為(單位為克每升)葡萄糖20，玉米粉20，麩皮10，苦瓜固體干粉20，KH2PO4 4，MgSO4 3，起始pH值為6.7。
發酵液菌絲體干重和發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測試方法同實施例1。
實施例4雞腿蘑發酵液的制備此實施例所用的菌種與實施例1相同。
在新鮮的斜面培養基中接入雞腿蘑菌絲體，培養溫度26℃，待菌絲體長滿斜面后，將斜面菌種接入裝有75mL搖瓶培養基的250mL三角瓶中(共4瓶)，26℃、150轉每分鐘搖床培養136小時。然后將此搖瓶菌種接入裝有300mL擴大培養基的1000mL三角瓶中(共18瓶)，接種量為每1000mL三角瓶接入24mL搖瓶種子，26℃、150轉每分鐘搖床培養94小時。然后將此擴大培養的菌種5.25L接入裝有47.25L一級種子培養基的75L種子罐中，種子罐中發酵液的總體為52.5L；維持罐溫26℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率125轉每分鐘，通風量1∶0.5 v/v/m，發酵時間80小時。最后將52.5L一級種子菌種接入裝有547.5L發酵培養基的1000L發酵罐中，發酵罐中發酵液的總體為600L；維持罐溫26℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率100轉每分鐘，通風量1∶0.5 v/v/m，發酵時間108小時。
由上述方法獲得的發酵液菌絲體的干重為10.0克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達98.0％。
本實施例中所使用的各種培養基的配方如下搖瓶培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖25，玉米粉20，麩皮10，酵母膏2，玉米漿4，KH2PO4 3，MgSO4 3，起始pH值為6.0。
擴大培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖20，玉米粉20，麩皮5，KH2PO4 3，MgSO4 4，起始pH值為6.0。
一級種子培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖20，玉米粉20，麩皮5，苦瓜固體干粉3，KH2PO4 2，MgSO4 3，起始pH值為6.5。
發酵培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖20，玉米粉20，麩皮5，苦瓜漿狀物10，KH2PO4 2，MgSO4 2，起始pH值為6.5。
發酵液菌絲體干重和發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測試方法同實施例1。
實施例5雞腿蘑發酵液的制備此實施例所用的菌種與實施例1相同。
在新鮮的斜面培養基中接入雞腿蘑菌絲體，培養溫度28℃，待菌絲體長滿斜面后，將斜面菌種接入裝有75mL搖瓶培養基的250mL三角瓶中(共3瓶)，28℃、135轉每分鐘搖床培養128小時。然后將此搖瓶菌種接入裝有150mL擴大培養基的500mL三角瓶中(共10瓶)，接種量為每500mL三角瓶接入15mL搖瓶種子，28℃、140轉每分鐘搖床培養92小時。然后將此擴大培養的菌種1500mL接入裝有28.5L一級種子培養基的50L種子罐中，種子罐中發酵液的總體為30L；維持罐溫28℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率130轉每分鐘，通風量1∶0.4v/v/m，發酵時間84小時。最后將30L一級種子菌種接入裝有270L發酵培養基的500L發酵罐中，發酵罐中發酵液的總體為300L；維持罐溫28℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率120轉每分鐘，通風量1∶0.35 v/v/m，發酵時間96小時。
由上述方法獲得的發酵液菌絲體的干重為9.1克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達96.8％。
本實施例中所使用的各種培養基的配方如下搖瓶培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖15，玉米粉18，麩皮10，酵母膏4，玉米漿3，KH2PO4 3，MgSO4 5，起始pH值為6.8。
擴大培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖30，玉米粉12，麩皮7，KH2PO4 3.5，MgSO4 5，起始pH值為6.2。
一級種子培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖28，玉米粉22，麩皮9，，KH2PO4 3.5，MgSO4 1.5，起始pH值為6.4。
發酵培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖18，玉米粉18，麩皮5，苦瓜漿狀物12.5，KH2PO4 2.5，MgSO4 1.5，起始pH值為6.8。
發酵液菌絲體干重和發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測試方法同實施例1。
實施例6雞腿蘑發酵液的制備此實施例所用的菌種與實施例1相同。
在新鮮的斜面培養基中接入雞腿蘑菌絲體，培養溫度28℃，待菌絲體長滿斜面后，將斜面菌種接入裝有75mL搖瓶培養基的250mL三角瓶中(共5瓶)，26℃、130轉每分鐘搖床培養132小時。然后將此搖瓶菌種接入裝有300mL擴大培養基的1000mL三角瓶中(共14瓶)，接種量為每1000mL三角瓶接入25mL搖瓶種子，26℃、150轉每分鐘搖床培養92小時。然后將此擴大培養的菌種4200mL接入裝有55.8L一級種子培養基的100L種子罐中，種子罐中發酵液的總體為60L；維持罐溫24℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率110轉每分鐘，通風量1∶0.8v/v/m，發酵時間80小時。最后將60L一級種子菌種接入裝有1140L發酵培養基的2000L發酵罐中，發酵罐中發酵液的總體為1200L；維持罐溫24℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率100轉每分鐘，通風量1∶0.6v/v/m，發酵時間110小時。
由上述方法獲得的發酵液菌絲體的干重為9.5克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達97.3％。
本實施例中所使用的各種培養基的配方如下搖瓶培養基與實施例2相應培養基配方相同，但起始pH值為7.0。
擴大培養基與實施例3相應培養基配方相同，但起始pH值為6.8。
一級種子培養基的起始pH值為6.5，其配方為在實施例5相應培養基配方的基礎上添加苦瓜漿狀物5克/升。
發酵培養基的起始pH值為6.2，其配方為在實施例5相應培養基配方的基礎上添加苦瓜漿狀物15克/升。
發酵液菌絲體干重和發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測試方法同實施例1。
實施例7雞腿蘑發酵液的制備此實施例所用的菌種與實施例1相同。
在新鮮的斜面培養基中接入雞腿蘑菌絲體，培養溫度22℃，待菌絲體長滿斜面后，將斜面菌種接入裝有75mL搖瓶培養基的250mL三角瓶中(共5瓶)，26℃、130轉每分鐘搖床培養132小時。然后將此搖瓶菌種接入裝有300mL擴大培養基的1000mL三角瓶中(共14瓶)，接種量為每1000mL三角瓶接入25mL搖瓶種子，26℃、150轉每分鐘搖床培養92小時。然后將此擴大培養的菌種4200mL接入裝有55.8L一級種子培養基的100L種子罐中，種子罐中發酵液的總體為60L；維持罐溫24℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率11 0轉每分鐘，通風量1∶0.8v/v/m，發酵時間80小時。最后將60L一級種子菌種接入裝有1140L發酵培養基的2000L發酵罐中，發酵罐中發酵液的總體為1200L；維持罐溫24℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率100轉每分鐘，通風量1∶0.6v/v/m，發酵時間110小時。
由上述方法獲得的發酵液菌絲體的干重為8.2克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達94.9％。
本實施例中所使用的各種培養基的配方如下搖瓶培養基的起始pH值為5.8，其余同實施例3中相應的培養基配方。
擴大培養基的起始pH值為6.2，其余同實施例2中相應的培養基配方。
一級種子培養基的起始pH值為6.5，其配方為在實施例4相應培養基配方的基礎上，不添加苦瓜固體3克/升，而是相應的添加苦瓜漿狀物2克/升。
發酵培養基的起始pH值為6.7，其配方為在實施例4相應培養基配方的基礎上添加苦瓜漿狀物9克/升。
發酵液菌絲體干重和發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測試方法同實施例1。
實施例8～14雞腿蘑發酵液的制備實施例8-14所用的雞腿蘑菌種為CGMCC No.5.156，具體實施條件分別與實施例1～7中的實施條件相同，發酵液菌絲體干重和發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測試方法同實施例1。所得結果為實施例8獲得的發酵液菌絲體的干重為9.2克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達97.0％。
實施例9獲得的發酵液菌絲體的于重為7.3克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達93.2％。
實施例10獲得的發酵液菌絲體的干重為7.2克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達95.3％。
實施例11獲得的發酵液菌絲體的干重為9.5克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達97.0％。
實施例12獲得的發酵液菌絲體的干重為9.5克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達96.6％。
實施例13獲得的發酵液菌絲體的干重為10克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達97.6％。
實施例14獲得的發酵液菌絲體的干重為7.8克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達94.4％。
實施例15～21雞腿蘑發酵液的制備實施例15～21所用的雞腿蘑菌種CGMCC No.5.258，其實施條件分別與實施例1～7中的實施條件相同，發酵液菌絲體干重和發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測試方法同實施例1。所得結果為實施例15獲得的發酵液菌絲體的干重為8.7克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達96.6％。
實施例16獲得的發酵液菌絲體的干重為7.4克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達93.0％。
實施例17獲得的發酵液菌絲體的干重為7.2克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達95.8％。
實施例18獲得的發酵液菌絲體的干重為10克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達97.8％。
實施例19獲得的發酵液菌絲體的干重為9.8克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達98.0％。
實施例20獲得的發酵液菌絲體的干重為9.2克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達96.9％。
實施例21獲得的發酵液菌絲體的干重為8.8克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達95.6％。
實施例22固體發酵產物的制備將實施例1所得到的發酵液于3000轉/分鐘離心，在得到的固形物中加水，高壓破碎，均質，然后冷凍干燥獲得固體的發酵產物，產物為棕褐色粉末。
實施例23發酵液上清液的制備將實施例1所得到的發酵液于3000轉/分鐘離心，獲得的上清液。所得到的濃縮產物為黃色的，有一定粘度但粘度不大的液體。
實施例24發酵液濃縮物的制備將實施例1所得到的發酵液于3000轉/分鐘離心，獲得的上清液，將所得到的上清液濃縮5倍后得到濃縮物。所得到的濃縮錯誤為棕色的，有一定粘稠度的液體。
實施例25固體發酵產物的制備將實施例1所得到的發酵液于3000轉/分鐘離心，獲得的上清液，將所得到的上清液濃縮5倍后冷凍干燥，獲得固體的發酵產物，為棕黃色粉末。
以上已詳細描述了本發明的實施方案，對本領域技術人員來說很顯然可以做很多改進和變化而不會背離本發明的基本精神。所有這些變化和改進都在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝，其特征在于以雞腿蘑為出發菌株，進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養和添加苦瓜物質的發酵培養。
2.根據權利要求1所述的添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝，其中所述搖瓶培養的培養基組成為(單位為克/升)葡萄糖15～35，玉米粉10～20，麩皮5～10，酵母膏1～4，玉米漿2～5，KH2PO42～4，MgSO43～6，加水至適當體積，起始pH值為5.8～7.0；搖瓶培養的培養條件是培養溫度22～30℃，轉速120～160轉/分鐘，培養時間120～140小時。
3.根據權利要求1所述的添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝，其中所述擴大培養的培養基組成為(單位為克/升)葡萄糖15～35，玉米粉10～20，麩皮5～10，KH2PO42～4，MgSO43～6，加水至適當體積，起始pH值為5.8～7.0；擴大培養的培養條件是接種量5～10％(體積百分比)，培養溫度22～30℃，轉速120～160轉/分鐘，培養時間90～96小時。
4.根據權利要求1所述的添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝，其中所述一級種子培養的培養基組成為(單位為克/升)葡萄糖15～30，玉米粉15～25，麩皮5～10，苦瓜物質0～7.5，KH2PO42～4，MgSO41～3，加水至適當體積，起始pH值為5.8～7.0；一級種子培養的培養條件是接種量5～10％(體積百分比)，培養溫度22～30℃，攪拌速率90～150轉/分鐘，通風量1∶0.3～1v/v/m，培養時間80～90小時。
5.根據權利要求1所述的添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝，其中所述發酵培養的培養基組成為(單位為克/升)葡萄糖10～20，玉米粉10～20，麩皮5～10，苦瓜物質5～20，KH2PO42～4，MgSO41～3，加水至適當體積，pH值為6.0～7.0；發酵培養的培養條件是接種量5～10％(體積百分比)，培養溫度22～30℃，攪拌速率90～125轉/分鐘，通風量1∶0.3～0.8v/v/m，培養時間90～120小時。
6.根據權利要求4或5所述的添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝，其中所述的苦瓜物質為苦瓜經過預處理后獲得的物質，所述的預處理方法是將苦瓜切片去籽，在60℃左右烘干后粉碎，使用時作為干物質直接加入；或者將苦瓜去籽后打碎勻漿，以漿液的形式使用，其量按干物質計算。
7.根據權利要求1-6任意一項所述的添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝，其中所得到的發酵液的菌絲體干重達7～10克/升，對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率為93～98％。
8.添加苦瓜的雞腿磨深層發酵液，其特征在于所述發酵液是由權利要求1-7任意一項的發酵工藝獲得的。
9.添加苦瓜的雞腿磨固體發酵產物，其特征在于該固體發酵產物是由權利要求8的發酵液經離心、加水、高壓破碎、均質，然后冷凍干燥后獲得的。
10.權利要求8的雞腿蘑發酵液或權利要求9的雞腿蘑固體發酵產物在制備預防和/或治療糖尿病和癌癥的藥物和/或保健品中的應用。
全文摘要
本發明涉及生物發酵領域，具體的說本發明涉及一種添加苦瓜的雞腿磨深層發酵工藝，以及由該工藝獲得的發酵產品。該工藝的特征在于以雞腿蘑為出發菌株，進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養和添加苦瓜的發酵培養。本發明的工藝解決了雞腿蘑大規模液體培養的難題，同時由于在發酵培養基中加入了中藥苦瓜，在發酵過程中與雞腿蘑發生生物轉化，大大提高了發酵液的活性，對雞腿蘑的產業開發具有重要的意義。本發明的發酵液為淡黃色至棕色液體，菌絲體呈淡黃色。發酵液菌絲體的干重為7～10克每升，發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率高達93～98％。
文檔編號A01G1/04GK1669391SQ20051006828
公開日2005年9月21日 申請日期2005年5月8日 優先權日2005年5月8日
發明者章克昌, 丁重陽, 王 鋒, 徐柔 申請人:章克昌