專利名稱：：一種用于潮間帶膜海綿幼蟲人工收集培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及海洋生物，是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用人工方法誘導(dǎo)含有胚胎海綿釋放海綿幼蟲，收集并培育幼蟲的技術(shù)，具體地說是建立一種在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工收集培育海綿幼蟲的方法，是一種用于潮間帶膜海綿幼蟲人工收集培育方法。
背景技術(shù)：
：海綿被認(rèn)為是海洋中最具有開發(fā)潛力的藥源生物，從海綿提取出來的次級代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤、抗真菌、甚至抗HIV的活性，因此海綿藥物開發(fā)成為近年來海洋藥物開發(fā)的熱點(diǎn)。但是海綿藥物在開發(fā)過程中遇到了藥源供給不足的瓶頸，即無足夠的海綿量來提取一定數(shù)量的活性物質(zhì)供藥物深入研究之用，使得一些藥物僅停留在臨床實(shí)驗(yàn)階段無法繼續(xù)下去。人們嘗試用多種方法去解決這一問題但都有難解決的關(guān)鍵技術(shù)，例如海綿細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，目前還沒有建立可以連續(xù)傳代的細(xì)胞系；化學(xué)合成價(jià)格昂貴、步驟復(fù)雜、實(shí)際可行性太低；目前普遍認(rèn)為海綿工廠化人工養(yǎng)殖被認(rèn)為是可解決"藥源供給不足問題"的較有希望的方式之一。但是工廠化養(yǎng)殖目前還處于實(shí)驗(yàn)室階段，生物量增殖較小，而且不能達(dá)到人工可控條件下海綿外植體的連續(xù)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)的種源始終需要向海洋要海綿，即采集野外自然海域海綿外植體人工培養(yǎng)，不斷地采集會造成海綿資源的枯竭和生態(tài)環(huán)境的破壞。海洋無脊椎動物的有性生殖是個(gè)體數(shù)量迅猛增加的最理想的方式，野外條件下由于被捕食和環(huán)境條件的影響而使幼體存活率很低。目前國內(nèi)對于海綿幼蟲的研究還沒有，國外對于海綿幼蟲的研究很多，但大多都是關(guān)于幼蟲形態(tài)、行為、組織學(xué)、生態(tài)學(xué)方面的研究，幼蟲在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的收集和培育也有少量報(bào)道，幼蟲附著成活率低，生長沒有具體的數(shù)據(jù)，對于海綿幼蟲人工收集、培育的系統(tǒng)性方法還未有報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是針對潮間帶海綿有性生殖幼蟲的收集和培育方法，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工可控條件下培養(yǎng)少量帶胚胎海綿組織塊，人工誘導(dǎo)海綿釋放幼蟲，然后培育幼蟲發(fā)育成小海綿。減少幼蟲死亡率，收獲大量幼體。然后以小海綿為種源，進(jìn)行人工養(yǎng)殖，為實(shí)現(xiàn)海綿人工養(yǎng)殖的育種問題打下基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的是提供一套有效且操作簡單，可對潮間帶膜海綿幼蟲進(jìn)行人工可控條件下收集培育的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種用于潮間帶膜海綿幼蟲人工收集培育方法，在實(shí)驗(yàn)室人工營造的環(huán)境下培育潮間帶含有胚胎海綿，收集并培育海綿幼蟲；將在潮間帶秋季采集的、含有成熟胚胎的海綿(稱為母體海綿)帶回實(shí)驗(yàn)室，用天然清潔海水清洗，然后固定在載體上，放入培養(yǎng)器中培養(yǎng)，投喂藻類餌料，幼蟲開始釋放后，放入附著基，讓幼蟲附著，改變營養(yǎng)條件下進(jìn)行幼蟲培養(yǎng)，幼蟲發(fā)育為幼海綿。所述載體可為玻璃片、塑料板、石塊、珊瑚焦石或陶瓷，海綿選擇細(xì)線固定；母體海綿在培育過程中光照強(qiáng)度為0—5000k;母體海綿在培育過程中溫度條件為12—25°C，通氣量為0.2-1.5升空氣/每升海水分鐘；附著基材質(zhì)可為玻璃、塑料、石頭或珊瑚砂；海綿培養(yǎng)密度2-15%。m/v，培養(yǎng)水體溶氧濃度5-9mg/L，保持培養(yǎng)水體內(nèi)的NH/濃度低于lmg/L;投喂餌料藻類食物時(shí)濃度2X104—2X105CdlS/ml;藻類為叉鞭金藻、新月菱形藻、亞心形扁藻、小球藻、角毛藻或鹽藻；在幼蟲釋放完成后，幼蟲附著后的培育營養(yǎng)條件為，培養(yǎng)海水中金藻0.2-1X104個(gè)/ml，光合細(xì)菌0.1-100ppm，硅0.1-60taiol/L，F(xiàn)e3+0.1-5taiol/L。方法原理海綿具有有性生殖和無性生殖的特點(diǎn)，利用海綿有性生殖產(chǎn)生幼蟲的特點(diǎn)在野外海綿生殖季節(jié)采集海綿組織塊，在人工營造的適宜條件下培育母體海綿，誘導(dǎo)幼蟲釋放，收集幼蟲，并培育幼蟲發(fā)育成小海綿。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1.技術(shù)相對完整。本發(fā)明首次對潮間帶膜海綿幼蟲在可控條件下收集和培育給出一套相對完整方法；是一種在實(shí)驗(yàn)室中對含有胚胎的潮間帶膜海綿進(jìn)行人工誘導(dǎo)釋放、收集和培育幼蟲的新技術(shù)。2.簡單易操作。本發(fā)明母體海綿選擇、溫度控制、光照控制、附著基選擇等均非常簡單，容易達(dá)到要求。3.應(yīng)用廣泛。本發(fā)明可用于人工可控條件下收集培育海綿有性生殖幼蟲；為解決海綿人工養(yǎng)殖的種源問題提供基礎(chǔ)，為海綿研究的國際難點(diǎn)一一海綿細(xì)胞培養(yǎng)，研究細(xì)胞分化增殖提供借鑒。總之，本發(fā)明可提供人工條件下培育潮間帶膜海綿含有胚胎外植體，收集培育幼蟲的方法。技術(shù)相對較完整、操作簡便，在室內(nèi)可控培育海綿幼蟲，為解決海綿工廠化養(yǎng)殖的種源問題提供了初步方法，從而為解決海綿藥物開發(fā)的"藥源供給不足問題"提出一種新途徑，具有廣泛應(yīng)用前景。圖1為繁茂膜海綿幼蟲形態(tài)圖，A浮游階段肉眼形態(tài)圖，B附著后發(fā)育成小海綿顯微鏡下形態(tài)圖；圖2為繁茂膜海綿幼蟲顯微鏡下形態(tài)圖；圖3為繁茂膜海綿幼蟲附著l天內(nèi)顯微鏡下形態(tài)圖；圖4為母體海綿在22"C通氣培養(yǎng)，光照和暗培養(yǎng)幼蟲釋放情況圖；圖5為母體海綿在不同溫度通氣培養(yǎng)條件下釋放幼蟲情況圖；圖6為幼蟲附著在珊瑚砂(A)和石塊上(B)圖。具體實(shí)施方式4下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的方法與結(jié)果進(jìn)行說明，本發(fā)明使用購買深海水作為養(yǎng)殖海水，用于母體海綿、海綿幼蟲和幼蟲附著后幼海綿的培養(yǎng)及餌料藻類的培養(yǎng)；肉眼每天觀察計(jì)數(shù)釋放幼蟲數(shù)量，計(jì)算平均每克濕重海綿釋放幼蟲數(shù)量；幼蟲尺寸小時(shí)用顯微鏡下標(biāo)尺計(jì)算，大時(shí)采用標(biāo)尺對比照相方式獲得。一種用于潮間帶膜海綿幼蟲收集培育方法，實(shí)驗(yàn)室人工營造海綿生長的環(huán)境，在適宜條件下誘導(dǎo)幼蟲釋放，收集并培育幼蟲。具體步驟，將生長在潮間帶的膜海綿采集后，立即放入盛海水的小桶里，帶回實(shí)驗(yàn)室用干凈海水清洗，然后將海綿固定于載體上，放入培養(yǎng)器中通氣培養(yǎng)，控溫、控光培養(yǎng)，投喂餌料藻類作為食物，肉眼見幼蟲釋放后，在培養(yǎng)器底部放置附著基讓幼蟲附著，密度合適時(shí)將附著基取出，適宜溫度營養(yǎng)條件下培育具體操作過程為1)海邊潮間帶采集母體海綿時(shí)間應(yīng)選擇海綿胚胎成熟時(shí)期，顏色鮮艷，表面相對干凈的海綿，采集后在基底層肉眼可見胚胎，采集后立即將海綿置于盛海水的小桶里；2)海綿帶回實(shí)驗(yàn)室后，用天然清潔海水清洗1-3次，至海水內(nèi)無顏色及可見胚胎既可，然后將海綿固定于載體上，置于培養(yǎng)器內(nèi)，通氣培養(yǎng)；3)母體海綿培養(yǎng)過程中需要水流，水流不能太強(qiáng)，影響幼蟲釋放后在水體內(nèi)的行為；4)母體海綿培育過程中，光照強(qiáng)度范圍可控制在0-50001x以內(nèi)；5)母體海綿培育過程中，培育溫度需要控制在15-25"C范圍內(nèi)；6)母體海綿培育過程中，隨時(shí)觀察是否有幼蟲釋放，一旦發(fā)現(xiàn)幼蟲釋放后，立即放入附著基，待附著密度合適時(shí)，及時(shí)取出，適宜條件下培養(yǎng);7)幼蟲在附著基上附著后，在溫度范圍為15-25。C條件下，營養(yǎng)為金藻0.2-1X10Vml，光合細(xì)菌O.l-lOOppm，硅0.1-60Pmol/L，鐵0.1-5taiol/L的條件下培育，幼蟲發(fā)育為小海綿。實(shí)施例1大連地區(qū)繁茂膜海綿在秋季9-10月份體內(nèi)胚胎成熟，2006年9月份采集帶胚胎繁茂膜海綿組織塊，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)清洗固定于玻璃載體上，12L玻璃缸暫養(yǎng)1天，然后置于1L玻璃缸內(nèi)，氣石通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)水溫22士0.5。C，分別設(shè)置光照50001x和暗培養(yǎng)2種條件，投喂金藻，濃度2X107ml。每天換水一次，早晚投喂2次。培養(yǎng)第一天即觀潮到幼蟲釋放，鮮艷桔黃色幼蟲脫離母體后在水中游泳，幼蟲大小在200-300陶之間。實(shí)驗(yàn)中光照和暗培養(yǎng)母體都能夠釋放幼蟲，釋放時(shí)間持續(xù)17天，每天釋放幼蟲數(shù)量不同。幼蟲釋放情況見圖4.實(shí)施例22006年9月份采集帶胚胎繁茂膜海綿組織塊，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)清洗后固定于玻璃載體上，然后置于1L玻璃缸內(nèi)，無光照、氣石通氣培養(yǎng)，設(shè)置水溫為14士0.5。C、18±0.5。C與25±0.5°C2個(gè)溫度條件，投喂金藻，濃度2X10'Vml。每天換水一次，早晚投喂1次。考察幼蟲釋放情況。不同溫度下母體都能夠釋放幼蟲，實(shí)驗(yàn)第一天同樣觀察到幼蟲釋放，但是不同溫度下母體釋放幼蟲持續(xù)時(shí)間和數(shù)量不同14±0.5'C母體釋放幼蟲持續(xù)12天，18±0.5。C下培養(yǎng)母體釋放幼蟲持續(xù)22天，25士0.5。C條件下持續(xù)6天，不同溫度下母體釋放幼蟲數(shù)量見圖5。收集母體海綿釋放幼蟲，置于1L或10L玻璃缸內(nèi)靜水培養(yǎng)，放置附著基于玻璃缸底，幼蟲能夠于附著在塑料波紋板、珊瑚砂、石塊及玻璃缸底上(圖6)。實(shí)施例3取附著于透明塑料波紋板上14天左右的海綿幼蟲，顏色桔黃色，大小為407.5士79.9tai，附著時(shí)溫度18±0.5°C。選取叉鞭金藻、光合細(xì)菌、硅和鐵在不同濃度下的不同組合作為營養(yǎng)成分，投喂幼海綿。培養(yǎng)溫度為22士0.5。C升溫后恒溫。幼海綿在不同食物組合下尺寸變化見表1。投喂不同濃度的四種營養(yǎng)成分幼海綿都能夠生長，但是濃度不同，幼海綿在短期內(nèi)尺寸變化不同。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1.一種用于潮間帶膜海綿幼蟲人工收集培育方法，其特征在于將在潮間帶秋季采集的、含有成熟胚胎的海綿帶回，用天然清潔海水清洗，然后固定在載體上，放入培養(yǎng)器中培養(yǎng)，投喂藻類餌料，幼蟲開始釋放后，放入附著基，讓幼蟲附著，改變營養(yǎng)條件下進(jìn)行幼蟲培養(yǎng)，幼蟲發(fā)育為幼海綿。2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述載體可為玻璃片、塑料板、石塊、珊瑚焦石或陶瓷，海綿選擇細(xì)線固定。3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于母體海綿在培育過程中光照強(qiáng)度為0—50001x;母體海綿在培育過程中溫度條件為12—25"，通氣量為0.2-1.5升空氣/每升海水分鐘。4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述附著基材質(zhì)可為玻璃、塑料、石頭或珊瑚砂。5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于海綿培養(yǎng)密度2-1554m/v，培養(yǎng)水體溶氧濃度5-9mg/L，保持培養(yǎng)水體內(nèi)的NH/濃度低于lmg/L;投喂餌料藻類食物時(shí)濃度2X104—2X105cells/ml。6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述藻類為叉鞭金藻、新月菱形藻、亞心形扁藻、小球藻、角毛藻或鹽藻。7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在幼蟲釋放完成后，幼蟲附著后的培育營養(yǎng)條件為，培養(yǎng)海水中金藻0.2-1XI04個(gè)/1111，光合細(xì)菌0.1-100ppm，硅0.1隱60她ol/L，F(xiàn)e3+0.1-5l^mol/L。全文摘要本發(fā)明涉及一種潮間帶膜海綿在實(shí)驗(yàn)室條件下人工收集培育其有性生殖幼蟲的方法，將含有成熟胚胎海綿在潮間帶采集后，帶回實(shí)驗(yàn)室，用海水清洗后固定在載體上，放入培養(yǎng)器培育，投喂餌料藻類作為主體食物。母體海綿在人工營造的環(huán)境下能夠釋放幼蟲，幼蟲經(jīng)歷浮游期后附著在選擇性附著基上，在適宜食物和溫度條件下能夠發(fā)育成小海綿。本發(fā)明為海綿人工養(yǎng)殖的種源問題提供了一條新的技術(shù)，為解決海綿藥物開發(fā)的“藥源供給不足問題”提出一種新途徑，具有廣泛應(yīng)用前景。文檔編號A01K61/00GK101322477SQ200710011680公開日2008年12月17日申請日期2007年6月13日優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日發(fā)明者孫黎明,衛(wèi)張,張喜昌,翊曲,薛凌云申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所