專利名稱：油菜雄性不育細胞質nau3a的育種方法
技術領域：
本發明公開了一種甘藍型油菜細胞質及其特征線粒體DNA序列，屬于遺傳工程 領域和植物育種領域。具體地講，涉及十字花科植物的雜種優勢利用，為十字花科 植物雜交種選育提供新型不育細胞質細胞質。
背景技術：
細胞質雄性不育可以應用于雜交種生產，效益巨大，已經為人們普遍認可。細 胞質雄性不育系用于配置雜交種，可提高油菜菜籽產量15%以上，也可可顯著提高 十字花科蔬菜的產量。
目前，在油菜乃至十字花科植物中，主要應用細胞質雄性不育主要是polima CMS、陜2A 、 OguCMS (參見劉平武等，甘藍型油菜pol CMS育性恢復基因的 分子標記中國油料作物學報，2007, 29 (1): 14—19.)。
polima CMS是傅廷棟教授于1972年在甘藍型油菜品種波里馬中發現19株天然 細胞質雄性不育株，后將穩定下來的不育系稱poli服CMS(簡稱polCMS)，其恢復 基因位于A組染色體上，為一對顯性基因。PolCMS不存性也受溫度的影響，依其 保持系細胞核基因的不同，可分為高溫不育、低溫不宵和穩定不育3種類型。通過 篩選，獲得缺乏溫度敏感基因的保持系，可育成不宵性穩定的polcms系。polCMS 目前的應用面最廣。
陜2ACMS是李殿榮(1980)于1976年在甘藍型油菜品種間復交組合(574-3/(豐收 4號+7207混合授粉)]后代中發現的半不育株，后經連續回交轉育得到穩定不育系陜 2A，其恢復基因為1對顯性基因。陜2A與pol CMS具有共同的保持系和恢復系， 由其配制的三系雜種"秦油2號"是國際上第一個通過品種審定、并大面積用于生 產的甘藍型三系雜交種。
Ogu CMS是由0gura(1968)在閂本蘿卜Raphanus sativas L.群體中發現天然雄性 不育，選育得到的系統。法國Bannerot等(1977)采用連續回交的方法將這種胞質分 別轉育到甘藍型油菜和甘藍中，得到油菜蘿卜質雄性不育系。oguCMS不育性穩定， 所有甘藍型油菜品種均是它的保持系，其恢復基因存在于歐洲的蘿卜品種中。Ogu CMS生產的雜交油菜已經在英、法等國商品化生產。
目前，全世界已經報導的油菜不育細胞質有22種以上，但是應用較多的細胞質 主要是POLCMS。目前油菜CMS利用中還是存在一些問題，主要是①油菜CMS 育性不穩定問題；②應用的CMS細胞質比較單一，讓人不禁想起單一細胞質可能 造成的生產損失。因此，發掘新的油菜CMS系統仍然具有十分重要的意義。我們在油菜原生質體融合后代中，發現不育株，通過雜交和回交，獲得了 NAU3A 型細胞質雄性不育系；鑒定分子線粒體DNA，證明NAU3A不育系是由線粒體重組 得到的新型不育系。

發明內容
技術問題本發明的目的在于公開一種細胞質雄性不育NAU3A，該不育胞質是通 過原生質體融合后代選育而得到的。油菜及十字花科雜種優勢利用中，存在不育細 胞質單一，育性不穩定等問題，本發明的細胞質雄性不育為解決細胞質單一問題提 供了新手段，可用于油菜及其十字花科雜種優勢利用。
技術方案
上述NAU3A雄性不育細胞質，屬于新型細胞質雄性不育類型，可用于甘藍型油菜、 白菜等十字花科植物的雜種優勢利用。通過雜交、回交等育種方式，育成NAU3A細 胞質的雄性不育系。
NAU3A不育系的線粒體DNA中含有如下mtDNA重組序列(SEQ ID No. 1):
ATGA
該序列編碼的重組蛋白序列(SEQIDNo.2)為:
LFR
有益效果
1、 本發明的目的在于公開一種細胞質雄性不育NAU3A，該不育胞質是通過原生 質體融合后代選育而得到的。
2、 油菜及十字花科雜種優勢利用中，存在不育細胞質單一，育性不穩定等問題。 本發明人提供的細胞質是經過線粒體基因組重組而獲得的，該重組類型不同于已經大面積應用了 20年的POLIMA不育胞質類型(pol)，該不育胞質的應用將 有利于解決不育細胞質單一的問題。而且該細胞質雄性不育類型的不育性比較 徹底，易于培育徹底穩定不育系。
3、 本發明人提供的不育胞質是線粒體基因組重組的結果利用具有NAP型胞質 的可育親本原生質體融合，獲得融合雜種；由于遺傳的異質性，導致線粒體DNA 重組，從而可得到的不育胞質。線粒體DNA的分子實驗證明了這個結論。本發 明的細胞質雄性不育不同于NAP型細胞質雄性不育，NAP型細胞質的恢復系是 NAU3A的保持系；也不同于POLIMA型細胞質雄性不育系，POLIMA型不育 系的線粒體編碼ORF224蛋白，導致雄性不育，而本發明的不育胞質編碼重組 型ORF222R3蛋白。從利用的角度看，NAP細胞質的利用價值不大，而本發明 的NAU3A細胞質利用價值很大。
4、 本發明人提供的不育胞質可以通過種間雜交，轉移到白菜、甘藍等十字花科物 種中去，為這些十字花科物種的雜種優勢利用，提供細胞質雄性不育，因此應 用可以很廣泛。 ，
5、 研究中，通過基因表達分析，發現NAU3A的重組型基因OT F22Z^在穩定不 育系中表達大，而在可育雜交組合中該重組型基因表達量低，說明該基因與雄 性不育的形成有關。
具體實施例方式
實施例1
以播娘蒿(D"cwm/w'a"TO; /z/a)葉片和甘藍型油菜("o/ ^)子葉為 材料提取原生質體，采用PEG"高pH、高鈣附加DMSO融合方法，液體淺層靜 置培養，研究影響播娘蒿與甘藍型油菜原生質體融合的因素，獲得了 19株再生植 株。結果表明4 %纖維素酶+ 0.5 %離析酶+5 mmol/L MES酶解10h和1 %纖維 素酶+ 0.2%離析酶+3 mmol/L MES酶解14h分別適合獲得高產率播娘蒿與油菜 原生質體；30%PEG + 0.3mol/L葡萄糖+ 50 mmol/L CaC12 2H20 + 15%DMSO 獲得了 10%的融合率；改良B5培養基的原生質體培養效果較好；每次添加不同 的新鮮培養基和添加MES對于防止褐化具有很好的效果；適宜分化培養基為MS + 4.0 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA + 5.0mg/L AgN03;適宜生根培養基為MS + 0.1mg/L IBA + 0.1mg/L NAA。
甘藍型油菜與播娘蒿的原生質體融合獲得的再生植株移栽到田間后，對其進 行了形態學、細胞學及花粉活力觀察。雜種植株生長緩慢、在葉型、葉片缺刻、 葉緣裂痕、莖桿分枝處顏色、花蕾初期顏色等形態學上表現出播娘蒿的特征，開 花期和成熟期相對較晚；雜種植株花比油菜花小，花粉活力低，結實率低。在融 合雜種中出現了 7個不育株，用甘藍型油菜與融合雜種進行雜交和回交研究。
5實施例2
利用原生質體融合技術所獲得的融合雜種中，出現了不育株。用不育株了與 NAU3B雜交，進一步從雜交F1開始選擇徹底不育株與NAU3A回交，經過5代回 交，得到穩定的不育系NAU3A。 NAU3A的不育性在年份間表現穩定不育。通過測 交，已經找到恢復系，實現了三系配套，為雜種優勢利用提供了新的授粉控制系統。 研究開創了細胞質方法，通過該方法從融合雜種至回交一代，均發現細胞質重組； 基因克隆的研究表明，回交一代以后細胞質mtDNA保持穩定，不再發生重組。
NAU3A是通過原生質體融合獲得的一系列重組細胞質的中的一個。本發明中， 選育不育胞質的方法體系中，結合了 mtDNA重組方法以及和育種選擇方法，最后 通過細胞質鑒定，得到了優良的不育細胞質。
實施例3
利用NAU3A不育胞質與白菜(5m^/ca"印^ )品種"上海青"雜交，Fl代 仍然表現為不育，而NAP型胞質的甘藍型油菜與上海青雜交后，Fl有花粉量基本 正常，說明NAU3A不育胞質可以轉移到油菜近緣中去，為雜種優勢利用提供新手 段。
實驗例4
選用甘藍型油菜雄性不育細胞質NAU3A的新鮮幼嫩黃化葉片為材料，提取線粒 體DNA。依據數據庫中M4尸細胞質雄性不育高度相關的w/222設計引物
上游引物Pl: 5'-TCATCGAAATAGATCGAGTA-3，；
下游引物P2: 5'-TTATGAGCTAGATAAAGCTACT -3，；
以基因組DNA為模板,擴增目的基因。PCR反應條件優化后為94。C預變性5 min 后；94。C變性30s， 54。C退火45s， 72。C延伸60s, 32個循環;72'C再延伸10 min。擴 增出了一條600 700bp大小的特異條帶。PCR回收產物連接到PGT克隆載體上，轉 化到大腸桿菌TOP10中，以來自目的片段上的引物序列為引物，進行PCR擴增鑒定 目的片段。對此目的片段進行測序，結果表明特異片段大小為669bp，具有起始密 碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)。丌放閱讀框完整。但是序列出現了重組，與NAP 型細胞質的ORF222不同，且具有這種重組序列的不存胞質與NAP型的"恢復系和 保持系"關系也不同。 實驗例5:
以油菜NAU3A為材料，分別從其根、莖、葉、花蕾以及花等組織中，提取總 RNA，采用隨機引物反轉錄cDNA第一條鏈，以cDNA第一條鏈為模板，采用RT-PCR 技術，檢測油菜NAU3A不同組織的差異表達情況。
內參基因a"&的引物序列
actinF: 5'-CGCCGAGCGGGAAATCGTC陽3，actinR: 5，-GGAAAGTGCTGAGGGATGC-3，。
以真核生物中組成性表達的基因￡iUa為內標，對cDNA第一鏈進行半定量分 析，五F7a的PCR擴增程序為95°C2min; 94。C45s， 55°C45s, 72°Clmin， 24個 循環；72°C，延伸10min。結果表明基因在不育系的根、莖、葉、花蕾以及花中 都有表達，但在花器官和莖中的表達較高，均屬于組成型表達；在可育雜交組合中 表達量低。說明不育性可能與Oi F222有關。
綜上所述，本發明人利用原生質體融合技術，得到了不育株，由不育株的雜交 和回交后代得到穩定不育系NAU3A，其細胞質經過分子鑒定，證明為新型雄性不 育胞質，在ORF222區域得到了重組型DNA序列和基因及其編碼蛋白。本發明人 提供了一種新型雄性不育授粉控制系統，為油菜乃至油菜的十字花科近緣種的雜種 優勢利用提供了新方法。
本發明涉及的序列及記號分列如下:
(1) SEQ ID NO. 1的信息
(i) 序列特征
(A) 長度669 bp
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓撲結構線性
(ii) 分子類型核苷酸
(iii) 序列描述SEQIDNO. 1
(2) SEQ ID NO. 2的信息
(i) 序列特征
(A) 長度222 a.a
(B) 類型氨基酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓撲結構線性
(ii) 分子類型蛋白質
(iii)序列描述SEQIDNO.2
(3) SEQ ID NO. 3的信息
(i)序列特征
(A)長度20b
7(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓撲結構線性
(ii) 分子類型核苷酸
(iii) 序列描述SEQIDNO. 3
(4) SEQ IDN0.4的信息
(i)序列特征
(A) 長度22b
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓撲結構線性
(ii) 分子類型核苷酸
(iii)序列描述SEQIDN0.4
(5) SEQ ID NO. 5的信息
(i) 序列特征-
(A) 長度19b
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓撲結構線性
(ii) 分子類型核苷酸
(iii) 序列描述SEQIDN0.5
(6) SEQ ID NO. 6的信息
(i) 序列特征-
(A) 長度19b
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈 (D沐撲結構線性
(ii) 分子類型核苷酸
(iii) 序列描述SEQIDN0.6序列表
〈110>南京農業大學
〈120〉油菜雄性不育細胞質NAU3A的育種方法
<130> NAU3A
<140> 2009-7-6
<141> 2009-07-06
〈150> 2009-6-30
〈151〉 2009-06-30
<160> 6
<170〉 Patentln version 3.5
〈210> 1
<211> 669
〈212〉 DNA
〈213> Brassica napus
<400〉 1
atgcctcaac tttactttct c taaaac t ac catcgt3C肪 ctcatgttcg atttttggga gatggcgtcg ggcgcggaat agccgagtgc gccctcgtcg cggtacctag tttcgatga
<210> 2
<211> 222
<212> PRT
〈213> Brassica
<400> 2 Met Pro
tggataaatt cacttatttt tcacaattct tctggttatg ccttttcttc 60
atattttcat atgcaatgat ggagatggag tacttgggat cagcagaatt 120
ggaaccaact gctttcacac tggggtaaga ccatccagag caagctaaag 180
gtaagttcgg ggtcttagcg ttcgccacgc gctatttctt ggtggaaaag 240
tggtcccaaa aatgcggcta gctatatatc taatatatgg.tttgaatttt 300
ttaaatgggg gttgctagga aatgagatat ttcagttcgg cgtcggacca 360
cgcccccagc tctagatctc aacgagcgcc cgccactgca tcttttgtac 420
gctcatatgc tagcgcatat tcggatgttg agagttccga ctctcaacaa 480
aagagataac ccgtgaccta gagggtaagc atgatatcgc gcggcgtc幼 540
atatcatgaa gtgggaggtc aggagcttgg atcaccactt ccgggtcttt 600
etccgtctgcg agattcgaag agagccaagg tgaacgaaat actcga/tcta 660
669
rispus
Gin Leu
1
Cys
Uu Phe Phe 20 Gly 5
Phe
Lys Phe Thr Tyr
Thr Phe Tyr
Gly Val Leu 35
Trp Gly Lys Thr
Ser
His 50 Phe
lie Ser Arg lie 40 Gin
lie 25 Leu
Phe
10
Phe
Lys 65
Leu Met Phe Val
Gly Val Leu Ala 70 Pro
lie 55 Phe
Lys Lys Ala Thr Arg
Ser
Gly Leu Asn Phe 100
Val 85 lie
Phe
Lys Met Arg
Gly lie Lys 105
Leu
90
Trp
Ser
lie
Leu
Leu
Tyr
75
Ala
Gly
Gin
Cys
Arg
Lys
60
Phe
lie
Leu
Phe
Asn
Asn
45
His
Leu
Tyr
ILeu
Phe Trp 15
Asp Gly 30
Gin Leu
Arg Thr
Val Glu
Leu lie 95
Gly Asn 110
Leu
Asp
Leu
Ser
Lys
80
Tyr
Glu
9lie Phe Gin Phe Gly Val Gly Pro Asp Gly Val Ala
115 120 Asp Leu Asn Glu Arg Pro Pro Leu His Leu Leu Tyr 130 135 140
Ser Tyr Ala Ser Ala Tyr Ser Asp Val Glu Ser Ser 145 150 155
Ser Arg Val Gin Glu lie Thr Arg Asp Leu Glu Gly
165 170 Ala Arg Arg Gin Ala Leu Val Asp lie Met Lys Trp
180 185 Leu Asp His His Phe Arg Val Phe Arg Tyr Leu Asp
195 200 Ser Lys Arg Ala Lys Val Asn Glu lie Leu Asp Leu
215 220
Pro Pro Ala Leu 125
Gly Ala Glu Cys
Asp Ser Gin Gin 160
Lys His Asp lie 175
Glu Val Arg Ser 190
Arg Leu Arg Asp 205
Phe Arg
Lys 210 〈210> 3 〈211> 20 <212> DNA
〈213〉 Brassica n聊s 〈400> 3
tcatcgaaat agatcgagta 20 <210> 4 <211> 22 〈212〉 DNA
<213> Brassica n印us <400> 4
ttatgagcta gataaagcta ct 22 <210> 5 <211> 19 <212> DNA
<213> Brassica n即us 〈400〉 5
cgccgsgcgg g幼stcgtc 19 〈210> 6 〈211> 19 〈212〉 DNA
<213> Brassica n抑us <400> 6
ggaaagtgct g鄉gatgc 19
權利要求
1.一種細胞質雄性不育胞質NAU3A利用原生質體融合技術，通過雜交和回交育種方法，得到甘藍型油菜細胞質雄性不育系和保持系，分別命名為NAU3A和NAU3B
2. 權力要求1所述的細胞質雄性不育系的線粒體DNA具有通過原生質體融合得到 的重組DNA序列Oi F222i 丄其核苷酸序列SEQ ID No. 1為-.
3. 權利要求2所述的一種重組型Oi F222/ 3基因的編碼蛋白序列SEQ ID No. 2為:
全文摘要
本發明公開了一種甘藍型油菜雄性不育細胞質NAU3A的創建方法和特征，屬于遺傳工程領域和植物育種領域。利用甘藍型油菜原生質體技術，獲得了融合后代，從融合后代中發現了不育株；利用NAU3B保持系與該不育株雜交和回交，得到了穩定不育系NAU3A。提取NAU3A不育系的線粒體DNA，并且利用PCR技術克隆鑒定不育胞質，得到NAU3A不育系的線粒體DNA的一個特征序列SEQ ID NO.1和其編碼氨基酸序列SEQ ID NO.2。本發明的細胞質和特征基因序列為首次報導。NAU3A細胞質可廣泛應用十字花科植物的雜種優勢利用，具有很好的應用前景。
文檔編號A01H5/00GK101647398SQ200910031820
公開日2010年2月17日 申請日期2009年7月14日 優先權日2009年7月14日
發明者姜淑慧, 張麗君, 張鳳啟, 張紅生, 杜同慶, 田琳琳, 管榮展, 秀 鄭, 陳健美 申請人:南京農業大學