專利名稱：適宜機械化收獲的矮桿緊湊型油菜的育種設計及鑒定方法
技術領域：
本發明屬于油菜育種技術領域，具體涉及一種適宜機械化收獲的矮桿緊湊型油菜的育種 設計、篩選及鑒定方法。
背景技術：
隨著經濟的發展，農作物種植上的勞動力及相關的栽培管理等成本投入5顯增加，選育 高產優質，特別是適應機械化收獲的新品種是降低生產成本、提高經濟效益的一個方面，開 發新的栽培方法等是增強經濟效益的另一個方面。顯然，培育理想的作物新品種是農作物增 產、增收，促進農業生產發展的首選方法，而新品種的培育與合理的育種方法及特異基因資 源的發掘、利用等密切相關。傳統的常規育種技術主要依賴于雜交后代的自交重組及人工選 擇，這不僅需要有很大的分離群體、可靠的環境條件，而且需要準確的篩選技術及較長的試 驗周期。現代轉基因技術及分子標記輔助育種技術雖然可以對特定的植物群體進行改良，但 改良的目標性狀數量有限。
長期以來，自然選擇及進化等使油菜形成了植株比較高大，分枝及角果比較分散等特點。 這些特點使得油菜不利于進行機械化、規模化操作以降低生產成本。為便于油菜能夠實現機 械化收獲，目前人類對油菜進行的遺傳改良主要在于抗裂角、矮化選擇等方面。但由于油菜 為無限花序，花期較長(一般持續l個月左右)，使得油菜莖、枝上不同層次的角果成熟時間 不能一致，常常下部角果已經成熟變黃，而上部角果仍未能成熟(青色)，為能夠進行脫粒， 加拿大等國家的做法是成熟期先將油菜機械化割倒，經過幾天后熟再進行機械化脫粒，顯然 這增加了油菜生產成本。但是，即便如此，這些國家的油菜種植成本仍比完全依賴于人工的 中國低40%以上。發現并培育株型緊湊、花期較短、結莢層集中、抗裂角等新型油菜品種以
適應機械化操作是國內外油菜遺傳改良的發展趨勢。此外，由于具有上述特點，這類品種無 疑也有利于抗病、抗倒，有利于高密度種植，有利于油菜的增產增收。
知識產權保護及農作物種苗市場等常常需要進行品種、特異新型材料的鑒別。通常可用 于農作物品種鑒別的方法主要有形態學標記法、生化標記法和分子標記鑒定法等。前兩種方 法是比較經典的方法，但由于這兩類標記數量很少，易受環境影響，且具有組織特異性，在 作物品種數量日益增多及人們對作物產品品質等要求円益嚴格的情況下，這兩種方法的應用
范圍及能力日顯不足。分子標記技術是二十世紀八十年代以來發展起來的、基于物種DNA 指紋特征的標記技術。這類標記不易受環境影響，且理論上數量可以是無限的。由于不同遺 傳材料具有不同特征的分子指紋，因此分子標記可以用于品種的鑒別。目前'RFLP、 SSR、 AFLP、 SCAR等標記技術己用于水稻、小麥、玉米、油菜等作物DNA指紋分析及品種(雜 種)鑒定。迄今為止尚未見到適宜機械化收獲的矮桿緊湊型油菜的育種設計、篩選及鑒定方法的報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種選育矮桿緊湊型油菜的育種技術以及提供應用改育種技術選 育獲得矮桿緊湊型油菜的鑒定方法。利用該育種方法培育適應高密度種植、適應機械化收獲 的油菜品種，以解決當前油菜生產中面臨的突出高種植成本問題。
本發明通過以下技術方案實現
一種適宜機械化收獲的矮桿緊湊型油菜的育種設計方法，包括歩驟
U)以甘藍型油菜5148-2(該品系于2006年1月18 R保藏在中國典型培養物保藏中心， 保藏編號為CCTCC-P200601,專利申請號200610018257.5)為母本，加拿大GRakow教授 提供的人工合成黃籽油菜DH系YN90-101參見文獻Dargl J Somers等.Identification of molecular markers associated with linoleic acid desaturation in 5nxss!.ca wapws. Theoretical and Applied Genetics, 1998， 96(6-7》897-903; Dargl J Somers等.Identification of a major gene and RAPD markers for yellow seed coat colour in Srass!'ca "apws. Genome, 2001, 44: 1077-1082為父 本進行雜交，得到雜種F,;
(2) 于油菜開花期取雜種F,植株主花序和上部分枝花序上幼蕾，用常規方法，通過酒 精和升汞消毒、研磨破碎、離心提取小孢子，加入秋水仙堿以誘變并加倍染色體，進行小孢 子培養見文獻余風群等.提高甘藍型油菜小孢子胚狀體成苗率的某些培養因素研究.作物 學報，1997， 23 (2): 165-168，獲得雙單倍體(DH)分離群體；
(3) 對雙單倍體(DH)分離群體進行多年(三年)、多點(兩個試驗點湖北武漢，甘 肅和政)田間表型特征鑒定，考察株高、分枝特性、花序長度、角果數量、生育期共五個主 選性狀，獲得矮桿、株型緊湊、分枝及主花序短小簇生、花期集中、結莢層緊密的矮桿緊湊 型油菜品種。
(4) 利用分子標記方法對歩驟(3)的矮桿緊湊型油菜品種進一步鑒定。 其中，表性特征的鑒定方法如下。
選擇株高為100cm左右；主花序有效長度為8cm左右，結角數量為40個左右，平均結 角密度每厘米5個左右； 一次分枝數約為5個左右，平均每個分枝長度為10 cm左右，結角 數為12個左右；無二次分枝；全株角果總數為100個左右；結角層長度為20 cm左右；開花 期為15天左右；同期角果成熟度為100%,植株冠幅小于0.013平方米(即長江流域JH常栽 培條件下每666.7平方米種植密度可以達到50000株以上)，若鑒定的油菜品種形態特征特性 與對照矮桿緊湊型油菜品種相似，表明該品種為矮桿緊湊型油菜或其衍生后代；若存在差異， 表明該材料為異品種。
分子標記鑒定方法包括如下歩驟 (1)選取待測品種(材料)及對照(矮桿緊湊型油菜)植物幼嫩葉片，-70^保存葉片總DNA的提取采用改良的SDS法進行見文獻李佳等. 一種有效提取油菜葉片總DNA 的方法.華中農業大學學報，1994, 13(5): 521-523；DNA純化采用苯酚-氯仿-異戊醇法見文 獻:J.薩姆布魯克等著.分子克隆實驗指南(第二版).北京:科學出版社,1998, pp954-956; 純化后的DNA-2(TC保存以用于分子鑒定。
(2)以待測品種及對照DNA為模版，進行SSR擴增見文獻沈金雄等.甘藍型油菜 SSR、 ISSR標記的遺傳多樣性及其與雜種表現的關系.中國農業科學,2004, 37(4): 477-483， 并對擴增產物進行電泳分離、銀染鑒定見文獻陸光遠等.應用于油菜研究的簡便銀染AFLP 標記技術的構建.華中農業大學學報,2001, 20: 413-415。若待測品種的全部9對SSR引物擴 增的帶型與對照矮桿緊湊型油菜帶型完全相同，表明該材料為矮桿緊湊型油菜或其衍生后代； 若存在差異，表明該材料為異材料。
更具體的技術方案由以下所述
1、油菜小孢子培養方法
在油菜開花期取雜種F,主花序和上部分枝花序上2.8 3.8 mm的花蕾，放入已滅菌的小 燒杯中，加入70%酒精消毒1 min，再用0.1%升汞消毒10 min，然后用無菌水沖洗3次，每 次5min。取消毒好的花蕾放入試管中，加入1 ml的BsGu(含B5基本成分，蔗糖濃度為13%， pH為5.8)培養液，用玻棒碾成勻漿，經300目雙層尼龍網過濾，用10 ml的離心管收集濾 液，1000rpm離心5min，去上清液，加入B5G13培養液懸浮小孢子，再離心，重復3次。去 上清液，用含50mg/L秋水仙堿的NLNu培養液(含NLN基本成分，附加13%蔗糖，pH5.8) 懸浮小孢子，并分裝于150ml三角瓶中(每瓶40-45個花蕾，20 25ml培養液)，用滅菌的 尼龍紙封口 ，在32°C黑暗條件下培養48 h后用不含秋水仙堿的NLN13培養液稀釋，分裝于cp75 培養皿(每皿約5-6個花蕾，7.5ml培養液)，并轉移至25'C黑暗條件下培養，當肉眼可見胚 狀體時(約需2周)，換成搖床培養(25°C，黑暗)，轉速為60卬m。小孢子培養約3周后， 胚狀體轉移至固體BsG2 (含B5基本成分，附加2%蔗糖，瓊脂7.5g， pH 5.8)培養基上，置 于25'C下光照培養室(光照強度為30001ux)培養16h，進行分化成苗，成苗后用固體BsG2 培養基繼代培養越夏，適時移栽至大田。
2、 SSR擴增及產物電泳分離、銀染技術 (1) SSR擴增
以-20。C保存的待測油菜材料品種及對照(矮桿緊湊型油菜)DNA為模板，以下列反應 體系進行PCR擴增25 ng.W1樣本總DNA 2 10 mmol丄-1 dNTPs 0.2 pl， 10x擴增緩沖液 (MBI公司產品)1 5 U T叫酶(MBI公司產品)0.1 pl， 25 mmol.L" Mg2+ 0.8 pl， 50 ，1" 引物(上下游引物混合液)0.5 pl， ddH20 5.4 ^l，總體積10pl。 PCR熱循環程序為
95°C 2min; 1個循環；
94。C lmin; 60°C 30s，每循環降0.5。C; 72'C 45s; IO個循環； 94'C lmin; 55°C 30s; 72°C 45s; 36個循環;72 °C 10min， 1個循環； 常溫保存。
取出擴增產物放置于4"C冷藏保存備用。
本發明中利用的9對SSR引物如下
上游引物5， TTG AAG TAG TTG GAG TAA TTG GAG G 3 ，
下游引物5'CAG CAG CCA CAA CCTTAC G 3，；
上游引物5'TGGATG AAA GCATCAACG AG 3，
下游引物5' ATC AAT CAA CAC AAG CTG CG 3';
上游引物5 ， GTG TGC AGG AAA CGA TGT TC 3 ，
下游引物5 ， GGG AGT TTG AAG AG A AAG CG 3';
上游引物5' CTTTGT GGT GGG TAG TGG 3，
下游引物5， ACT TAG CCT CAA TAC GGT CTT 3，；
上游引物5' AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3'
下游引物5' ACC TCC ATT GTG TCT GAT 3，；
上游引物5， ACG GTG CCG AAT CTC AAC G 3'
下游引物5， AAA TGG GTC AC A GCC GAG AA 3，；
上游引物5，CCC GTC AAC CAA ATC AC A 3 ，
下游引物5 ， CGC AAG GTT GTT ATC TAA TC 3';
上游引物5， TCT CAA AAG GAT ATG CGT GAA 3，
下游引物5' C AA AAC TC A TC A GGG TTG TAG 3 ，；
上游引物5' AAG CGC GCA TAA CTA CAC 3'
下游引物5'AAC ACT GCT CCT TTC CCT 3'。 (2)擴增產物的電泳分離
用去污粉等清潔劑將玻璃板徹底洗凈并晾干，用無水乙醇擦拭干凈待用。在長玻璃板 (38x32.5cm)上用光滑的試紙均勻涂抹2 ml硅化液(AMRESCO公司產品)，在短玻璃板 (38x30.5cm)上均勻涂布1 ml反硅化液(95%乙醇，0.5%冰乙酸，2 ^反硅化劑)，10 min 后用沾有無水乙醇的試紙輕輕擦洗，除去多余的硅化液和反硅化液并晾干。然后將長、短玻 璃涂布有硅化液、反硅化液面朝內，以厚0.4mm的塑料邊條隔開裝配好電泳系統，并用底板 封閉其下方。迅速混勻50 ml變性凝膠液(含6%丙烯酰胺'7mol/L尿素'0.5xTBE緩沖液) 及200 nl 10%過硫酸鈸和20 TEMED，用注射器將混合液從底板中間小孔緩緩注入'最后 于上部插入梳子并加壓保護，凝聚大約2 h即可電泳。
取下底板，將其垂直固定于電泳槽底座上，上槽和下槽分別加入500ml 0.5xTBE緩沖液， 拔出梳子，接通電源穩壓1 500V電泳預熱30min，電泳所用儀器為Sequi-Gen sequencing cell (Bio-Rad,USA)。預熱完成后，將梳齒朝下插入梳子，并沖洗點樣孔。取出步驟(1)中4'C冷藏保存的擴增產物，加入等體枳的變性上樣緩沖液(內含98%去 離子甲酰胺，10mmol/LEDTA, 0.005%二甲苯青FF， 0.005。/。溴酚藍)，95。C變性3min后立 即冰浴冷卻，上樣后穩壓1 500 V電泳40~60 min，待二甲苯青FF于1/3~1/2膠板處終止電泳。 (3)凝膠銀染、顯影
電泳完畢后，小心剝下膠板，用10%冰醋酸溶液(1L)固定30min或至二甲苯青FF藍 色消失為止，然后用ddH20漂洗膠板2次，每次5 —10min。再用0.1%硝酸銀溶液(1L。含 1-2 ml甲醛)染色30min，取出用ddH20迅速漂洗10 15s，然后用預冷的3%無水碳酸鈉溶 液(1L。含1-2 ml甲醛，2mg/L硫代硫酸鈉)顯色，輕輕搖動至條帶清晰可見，迅速取出放 回固定液(10%冰乙酸)中停止顯影，再用ddH20漂洗l-5min，室溫下自然晾干。 本發明的有益效果
本發明與背景技術相比，具有的有益效果是建立了快速有效的油菜設計育種技術體系， 并以此培育出適應高密度種植及機械化收獲的矮桿緊湊型油菜育種材料，其利用將有利于降 低油菜種植成本；建立了科學、準確、客觀、實用的油菜材料鑒定技術體系，為保護油菜育 種產權、新品種登記、鑒別和檢測油菜材料的真實性、規范油菜種子經營市場等提供了技術 保障。


圖l:矮桿緊湊型油菜的育種設計方法流程圖。 圖2:矮桿緊湊型油菜形態圖。 圖3:油菜與普通油菜的區別。
圖4:引物上游引物5'CTTTGTGGTGGGTAGTGG3，，下游引物5'ACTTAG CCT CAATACGGTCTT3'擴增圖譜，其中箭頭所指為矮桿緊湊型油菜。
具體實施例方式
實施例l:矮桿緊湊型油菜育種設計與選育
(1) 雜交試驗以華中農業大學選育的甘藍型油菜5148-2 (該品系于2006年1月18 日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC-P200601 ，專利申請號 200610018257.5)為母本，加拿大G Rakow教授提供的人工合成黃籽油菜DH系YN90-101參見文獻Dargl J Somers等.Identification of molecular markers associated with linoleic acid desaturation in Z 譜w'co Theoretical and Applied Genetics, 1998, 96(6-7): 897-903: Dargl〗
Somers,等.Identification of a major gene and RAPD markers for yellow seed coat colour in 份aM化fl"op肌Genome, 2001,44: 1077-1082為父本進行雜交，得到雜種F,。秋季將親本和 雜種F,種植于田間，雜種F,種植30株左右(2行〕。
(2) 建立雙單倍體(DH)群體對歩驟(1)得到的F,植株主花序和上部分枝花序上 幼蕾的花粉進行小孢子培養見文獻余風群等.提高甘藍型油菜小孢子胚狀體成苗率的某 些培養因素研究.作物學報，1997， 23(2): 165-168，利用秋水仙堿進行染色體加倍和誘變，得到331個雙單倍體(簡稱DH)系群體。
(3)獲得矮桿緊湊型油菜對331個DH系群體種植于田間進行株型、株高、分枝數、 主花序長度、主花序結角密度、全株角果總數、生育期等性狀鑒定，發現編號為06-6585的 材料這些性狀表現與其它材料不同，進行多點(湖北武漢、甘肅和政)、多年(2003-2006年) 鑒定，株型、株高、分枝及主花序、結莢層、開花期等性狀十分穩定。這些性狀具體表現為-. 株高100cm左右(60-120cm，普通油菜180cm左右)；主花序有效長度8cm左右(6-12cm)， 結角40個左右(30-80個)，平均結角密度每厘米5個左右(普通油菜主花序有效長度普遍 30cm以上，結角密度一般不超過1.5個/厘米)； 一次有效分枝5個左右(3-10個)，每個平均 長度10cm左右，結角12個左右(普通油菜一次有效分枝7-15個，平均每個結角40個左右)； 無二次分枝(普通油菜一般有二次分枝)；全株角果總數平均IOO個左右(普通油菜大多400 個左右)；結角層20cm左右(普通油菜超過40cm);開花期10-15天(普通油菜30天左右)； 角果成熟期基本一致(普通油菜上下層角果成熟不一致)。正常栽培條件下，本發明培育的矮 桿緊湊型油菜種植密度可超過50000株/畝(植株冠幅小于0.013平方米，普通油菜不超過15000 株/畝)。
實施例2:矮桿緊湊型油菜的鑒定
(1) 形態鑒定鑒定方法參照前述《發明內容》的記載。由于矮桿緊湊型油菜株型緊湊， 矮桿，主花序及分枝短小簇生，開花期集中，結莢層緊密，成熟期一致(附圖2),與普通油
菜(附圖3)區分十分明顯。因此，株型形態性狀等是鑒別矮桿緊湊型油菜及其衍生后代的
特征性狀，利用形態性狀可以鑒別矮桿緊湊型油菜及其衍生后代。
(2) 分子標記鑒定
①用于分子標記鑒定的油菜品種均來自于中國公開報道和應用的油菜品種，主要包括
浙雙3號、華雙3號、滬油17號、中雙7號、中雙9號、湘油15號、陜油8號、蘇油3號、 寧油12號、豫油2號、甘油5號、新華8號、安康勝利油菜、華黃1號、云油8號、中油低 芥1號、農村27號、青油2號、萬油17號、川油11號等待測油菜品種及矮桿緊湊型油菜植 株的幼嫩葉片，提取油菜幼嫩葉片總DNA;提取方法參考SDS法進行；DNA純化采用苯酚
-氯仿-異戊醇法參見文獻J.薩姆布魯克等著.分子克隆實驗指南(第二版).北京科學出
版社,1998， pp954-956；純化后的DNA-2(TC保存以用于分子鑒定。
②以①中提取的待測品種DNA為模版，以下列反應體系進行PCR擴增25 ng^—1樣本 總DNA2 pi, lOmmol'L" dNTPs 0.2 pl， l()x擴增緩沖液1 ^1， 5 U 7i g酶0.1 pl， 25 mmol-U1 Mg2+0.8^1， 50ng卞r1引物(上下游引物混合液)0.5^1， ddH20 5.4^1，總體積10 pl。 PCR
熱循環程序為
95 °C 2min; 1個循環；
94°C lmin; 60。C 30s'每循環降0.5。C; 72°C 45s; 10個循環;94°C lmin; 55°C 30s; 72°C 45s; 36個循環；
72 。C 10min， 1個循環；
常溫保存。
取出擴增產物放置于4'C冷藏保存備用。 用于矮桿緊湊型油菜分子鑒定的9對SSR引物如下 上游引物5， TTG AAG TAG TTG GAG TAATTG GAG G 3' 下游引物5， CAG CAG CCA CAA CCT TAC G 3'; 上游引物5， TGG ATG AAA GCA TCA ACG AG 3' 下游引物5， ATC AAT CAA CAC AAG CTG CG 3，； 上游引物5， GTG TGC AGG AAA CGA TGT TC 3' 下游引物5 ， GGG AGT TTG AAG AGAAAGCG3，； 上游引物5' CTT TGT GGT GGG TAG TGG 3 ， 下游引物5' ACT TAG CCT CAA TAC GGT CTT 3' ， 上游引物5' AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3' 下游引物5'ACC TCCATT GTG TCT GAT3，； 上游引物5'ACG GTG CCG AAT CTC AAC G 3， 下游引物5， AAA TGG GTC ACA GCC GAG AA 3'; 上游引物5' CCC GTC AAC CAA ATC ACA 3， 下游引物5 ， CGC AAG GTT GTT ATC TAA TC 3'; 上游引物5' TCT CAA AAG GAT ATG CGT GAA 3' 下游引物5' CAA AAC TCA TCA GGG TTG TAG 3 ，； 上游引物5' AAG CGC GCA TAA CTA CAC 3' 下游弓1物5， AAC ACT GCT CCT TTC CCT 3，。
③用去污粉等清潔劑將玻璃板徹底洗凈并晾干，用無水乙醇擦拭干凈待用。在長玻璃板 (38x32.5cm)上用光滑的試紙均勻涂抹2 ml硅化液(AMRESCO公司產品)，在短玻璃板 (38x30.5cm)上均勻涂布1 ml反硅化液(配方95%乙醇，0.5。/。冰乙酸，2 ^反硅化劑)， lOmin后用沾有無水乙醇的試紙輕輕擦洗，除去多余的硅化液和反硅化液并晾干。然后將長、 短玻璃涂布有硅化液、反硅化液面朝內，以厚0.4mm的塑料邊條隔開裝配好電泳系統，并用 底板封閉其下方。迅速混勻50 ml變性凝膠液(含6%丙烯酰胺，7mol/L尿素，0.5><TBE緩 沖液)及200 nl 10%過硫酸鉸和20 td TEMED，用注射器將混合液從底板中間小孔緩緩注入， 最后于上部插入梳子并加壓保護，凝聚大約2 h即可電泳。
取下底板，將其垂直固定于電泳槽底座上，上槽和下槽分別加入500ml0.5xTBE緩沖液， 拔出梳子，接通電源穩壓1 500V電泳預熱30min，電泳所用儀器為Sequi-Gen sequencing cell (Bio-Rad,USA)。預熱完成后，將梳齒朝下插入梳子，并沖洗點樣孔。取出步驟②中4TT冷藏保存的擴增產物，加入等體積的變性上樣緩沖液(98%去離子甲酰 胺，10mmol/LEDTA， 0.005%二甲苯青FF， 0.005%溴酚藍)，95。C變性3 min后立即冰浴冷 卻，上樣后穩壓1 500 V電泳40-60 min，待二甲苯青FF于1Z3 1/2膠板處終止電泳。
④電泳完畢后，小心剝下膠板，用10%冰醋酸溶液(1L)固定30min或至二甲苯青FF 藍色消失為止，然后用ddH20漂洗膠板2次，每次5 10min。再用0.1%硝酸銀溶液(1L。 含1-2 ml甲醛)染色30 min,取出用ddH20迅速漂洗10 15s，然后用預冷的3%無水碳酸 鈉溶液(1L。含l-2ml甲醛，2mg/L硫代硫酸鈉)顯色，輕輕搖動至條帶清晰可見，迅速取 出放回固定液(10%冰乙酸)中停止顯影，再用d膽20漂洗l-5min，室溫下自然晾干，備用。 比較待測品種SSR擴增帶型與矮桿緊湊型油菜的帶型(附圖4)，若9對SSR引物擴增 的帶型與矮桿緊湊型油菜完全相同，表明該品種為矮桿緊湊型油菜或其衍生后代，若存在差 異，則為異品種。
權利要求
1、選育適應于高密度種植和機械化收獲的矮桿緊湊型油菜的方法，其步驟如下(1)以保藏編號為CCTCC-P200601的甘藍型油菜品種5148-2為母本，以加拿黃籽油菜DH系品種YN90-1016為父本進行雜交，得到雜種F1；(2)于油菜開花期取雜種F1植株主花序和上部分枝花序上大小為2.8-3.8mm的幼蕾提取小孢子，以50mg/L的秋水仙堿加倍染色體48小時，通過小孢子培養獲得雙單倍體(DH)分離群體；(3)對步驟(2)的分離群體進行三年、每年兩個試驗點田間表型特征鑒定，選擇株高、分枝特性、花序長度、角果數量、生育期五個主選性狀與普通油菜存在差異的表型為矮桿、株型緊湊、分枝及主花序短小簇生、花期集中和結英層緊密的油菜變異類型材料，得到矮桿緊湊型油菜品種；(4)利用分子標記方法對步驟(3)的矮桿緊湊型油菜品種進一步鑒定。
2、根據權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述的分子標記鑒 定步驟如下 (1 )選取待測品種及對照為矮桿緊湊型油菜的植物幼嫩葉片，用SDS法提 取葉片總DNA,采用苯酚-氯仿-異戊醇法純化總DNA以進行PCR鑒定； (2)以步驟(1)中提取的待測品種DNA為模版，按照下列反應體系進行 SSR擴增25 ng.^r1樣本總DNA2 pi, 10 mmol.U1 dNTPs 0.2 pi, lOx擴增緩沖 液1 pi, 5 U 7h《酶0.1 pl， 25 mmol-i;1 Mg2+ 0.8 pi, 50 ng卞r1引物(上下游引 物混合液)0.5^, ddH20 5.4^，總體積10 pl。 PCR熱循環程序為 95 °C 2min; 1個循環； 94。C lmin; 60。C 30s,每循環降0.5。C; 72°C 45s; IO個循環； 94。C lmin; 55°C 30s; 72°C 45s; 36個循環； 72 。C lOmin， 1個循環； 常溫保存； (3)擴增產物加入等體積的變性上樣緩沖液，95。C變性3 min后立即冰浴 冷卻，然后在預先制好的丙烯酰胺變性凝膠板上加樣，再在1 500V穩壓條件下電泳40~60 min后終止電泳；(4 )小心剝下膠板，經過冰醋酸固定、ddH20漂洗、硝酸銀溶液染色、ddH20 漂洗、無水碳酸鈉溶液顯影、冰乙酸停影、ddH20漂洗等過程，將分離的DNA 指紋用于鑒定；(5)比較待測品種SSR擴增帶型與矮桿緊湊型油菜的帶型的差異；用于矮桿緊湊型油菜SSR鑒定的引物如下上游引物〗 下游引物f上游引物 下游引物TTG A AG TAG TTG GAG TAA TTG GAG G 3， CAG CAG CCA CAA CCT TAC G 3，；TGG ATG AAA GCA TCA ACG AG 3， ATC AAT CAA CAC AAG CTG CG 3，上游引物5， GTG TGC AGG AAA CGA TGT TC 3，下游引物5' GGGAGTTTGAAGAGAAAGCG3';上游引物5， CTT TGT GGT GGG TAG TGG 3'下游引物5' ACT TAG CCT CAA TAC GGT CTT 3';上游引物5， AAT TTA AAC CTC ATT TTC TTC 3'下游引物5' ACC TCC ATT GTG TCT GAT 3';上游引物5， ACG GTG CCG AAT CTC AAC G 3，下游引物5' AAA TGG GTC ACA GCC GAG AA 3';上游引物5， CCCGTCAACCAAATCACA3'下游引物5' CGC AAG GTT GTT ATC TAA TC 3，；上游引物5， TCT CAA AAG GAT ATG CGT GAA 3，下游引物5， CAA AAC TCA TCA GGG TTG TAG 3'上游引物5' AAG CGC GCA TAA CTA CAC 3'下游引物5' AAC ACT GCT CCT TTC CCT 3'。
全文摘要
本發明屬于油菜育種領域。公開了一種適應高密度種植和機械化收獲的新型矮桿緊湊型油菜的選育及鑒定方法。以華中農業大學選育的保藏號為CCTCC-P200601的油菜品種5148-2和加拿大人工合成的黃籽油菜DH系YN90-1016為親本雜交，得到F₁。開花期選用F₁植株主花序和上部分枝上大小在2.8-3.8mm的花蕾，用秋水仙堿加倍染色體，小孢子培養獲得雙單倍體分離群體。對分離群體進行多年多點田間表型特征鑒定，選擇株高、分枝特性、花序長度、角果數量、生育期五個主選性狀與普通油菜存在差異的表型為矮桿、株型緊湊、分枝及主花序短小簇生、花期集中和結莢層緊密的油菜變異類型材料，得到矮桿緊湊型適于機械化收獲的油菜新品種。本發明還公開了分子鑒定方法。
文檔編號C12Q1/68GK101292626SQ20081004809
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月19日 優先權日2008年6月19日
發明者傅廷棟, 劉志文, 靜 文, 斌 易, 李新華, 軍 楊, 沈金雄, 涂金星, 漆麗萍, 馬朝芝 申請人:華中農業大學