專利名稱：多倍體香石竹種質的培育方法
技術領域：
本發明涉及一種多倍體植物的育種方法，尤其是涉及一種利用2η配子和胚培養培育多倍體香石竹種質的方法，屬于植物遺傳育種技術領域。
背景技術：
多倍體植物因其花大、花色濃艷、莖桿粗壯等特點而具有重要的觀賞價值。此外， 多倍體也是克服遠緣雜交當代不孕和遠緣雜種不結實的一個重要方法。2η配子雜交被認為是目的性狀基因漸滲非常有效的途徑，有利于不同倍性的種質滲入和基因流動，且雜交后代具有更廣泛的遺傳變異，雜交后代的性狀也很穩定。因此，利用2η配子創新具有高度雜合性和豐富遺傳異質性的多倍體雜種群體具有重要的意義。香石竹(Dianthus Caryophyllus Lirm)，又名麝香石竹、康乃馨，為多年生草本植物。它具有品位高、色彩豐富、芳香、花期長、裝飾效果好等特點，是目前世界上應用最普遍的花卉之一，是世界重要切花種類之一，也是中國、云南省最重要的出口花卉之一。香石竹父母本不同倍性間雜交獲得的合子胚往往在早期發育階段就敗育或退化，降低了育種效率。而通過離體培養可使胚在適宜的離體培養條件下獲得再生植株。因此，用離體培養來挽救胚的方法，在植物育種中具有十分重要的理論與實踐意義。

發明內容
為解決香石竹遺傳背景狹窄，種質資源大都為二倍體，同時不同倍性香石竹品種雜交過程出現受精前的不親和性，導致胚敗育或退化等問題，本發明提供一種利用2η配子和胚培養技術創新多倍體香石竹種質資源的方法。本發明提供的是這樣一種多倍體香石竹種質的培育方法，其特征在于經過下列步驟
Α.選擇四倍體種質作為母本，二倍體種質作為父本，在盛花期去雄并套袋，7 14天后進行人工授粉，授粉15 45天后去袋剝取子房；
B.將步驟A剝取的子房進行消毒處理后，切開并剝取白色的胚珠，將胚珠接種在下列胚培養基上MS+0. 01 0. 6mol/L的NAA，在光照強度為1500 20001x，光照時間為8 12小時/天，溫度為23 27°C條件下，培養20 60天，使白色的胚珠長大變成黑色的種子；
C.將步驟B的黑色種子的種皮切開，剝取白色的胚，繼續在下列胚培養基中 MS+0. 01 0. 6mol/L的NAA，在光照強度為1500 20001x，光照時間為8 12小時/天， 溫度為23 27°C條件下，培養20 60天；
D.將步驟C所得的成活的胚接種在下列繼代培養基上MS+0.05 0.5mg/L的 ΒΑ+0. 01 0. 3mg/L的NAA，在光照強度為1500 20001x，光照時間為8 12小時/天，溫度為22 的條件下，培養20 40天，即得到多倍體香石竹植株。所述步驟A中的四倍體種質為柱頭親合性較強的四倍體種質，且柱頭的最佳可授期為柱頭彎曲，頂端卷曲，同時柱頭上布滿絨毛；所述步驟A中的二倍體種質是與四倍體種質具有互補優良性狀且產生2η配子的二倍體種質，2η配子的產生頻率為大于或等于 0.01%，人工授粉時選擇剛散粉的父本花粉，此時采集的花粉量大、花粉活力高。所述步驟B的消毒處理是用體積濃度為70%的酒精消毒20 60s，再用質量濃度為0. 1 0. 2%的升汞消毒20 60min，無菌水沖洗3 4次。本發明具有下列優點和效果人工理化誘變的多倍體，存在嵌合體較高，誘變效率較低、處理易產生危害等缺點；而通過2η配子雜交結合胚培養技術獲得的多倍體，可克服由于體細胞加倍等無性多倍化而導致的雜種育性和生活力下降的問題，且是目的性狀基因漸滲非常有效的途徑，有利于不同倍性的種質滲入和基因流動，雜交后代具有更廣泛的遺傳變異，雜交后代的性狀也很穩定。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步描述。實施例1
Α.選擇多頭香石竹種質資源“紫蝴蝶”Οη4χ=60)為母本，其花色、花形獨特，生育期短，且組培苗繁殖能力強，繁殖系數高，但育性低，抗病性弱，為枯萎病易感品種；以單瓣選擇系NHlO (2η=2χ=30)為父本，其具有很高育性，產量高，抗病性強，2η配子產生頻率大于 0. 01%，在盛花期，母本去雄并套袋，套袋后10天，母本柱頭彎曲，頂端卷曲，同時柱頭上布滿絨毛時，采集剛散粉的父本花粉，此時花粉量大、花粉活力高，進行人工授粉，授粉15天后去袋剝取子房；
B.將步驟A剝取的子房，用體積濃度為70%的酒精消毒30s，再用質量濃度為0.2%的升汞消毒40min，無菌水沖洗3次，切開并剝取白色的胚珠，將胚珠接種于下列胚培養基上 MS+0. 01mol/L的NAA，在光照強度為20001x，光照時間為8小時/天，溫度為25°C條件下， 培養30天，白色的胚珠長大變成黑色的種子；
C.將步驟B的黑色種子的種皮切開，剝取白色的胚，繼續于下列胚培養基中 MS+0. 01mol/L的NAA，在光照強度為20001x，光照時間為8小時/天，溫度為25°C條件下， 培養40天；
D.將步驟C所得的成活的胚接種在下列繼代培養基上MS+0.5mg/L的BA+0. 3mg/L的 NAA，在光照強度為20001x，光照時間為8小時/天，溫度為25°C的條件下，培養30天，即得到多倍體香石竹植株。胚的成苗率為1. 8%，獲得一棵植株，染色體倍性鑒定為四倍體。實施例2
A.選擇多頭香石竹種質資源“紫蝴蝶”Οη4χ=60)為母本，其花色、花形獨特，生育期短，且組培苗繁殖能力強，繁殖系數高，但育性低，抗病性弱，為枯萎病易感品種；以單瓣選擇系NHlO (2η=2χ=30)為父本，其具有很高育性，產量高，抗病性強等特點，2η配子產生頻率大于0. 01%,在盛花期，母本去雄并套袋，待套袋后12天，母本柱頭彎曲，頂端卷曲，同時柱頭上布滿絨毛時，采集剛散粉的父本花粉，此時花粉量大、花粉活力高，進行人工授粉，授粉 21天后去袋剝取子房
B.將步驟A剝取的子房，用體積濃度為70%的酒精消毒60s，再用質量濃度為0.2%的升汞消毒30min，無菌水沖洗3次，切開并剝取白色的胚珠，將胚珠接種于下列胚培養基上 MS+0. 2mol/L的NAA，在光照強度為20001x，光照時間為10小時/天，溫度為25°C條件下， 培養40天，使白色的胚珠長大變成黑色的種子；
C.將步驟B的黑色種子的種皮切開，剝取白色的胚，繼續于下列胚培養基中 MS+0. 2mol/L的NAA，在光照強度為20001x，光照時間為10小時/天，溫度為25°C條件下， 培養50天；
D.將步驟C所得的胚接種在下列繼代培養基上MS+0.3mg/L的BA+0. lmg/L的NAA，在光照強度為20001x，光照時間為10小時/天，溫度為25°C的條件下，培養25天，即得到多
倍體香石竹植株。胚的成苗率為1. 3%，獲得一棵植株，染色體倍性鑒定為四倍體。實施例3
A.選擇多頭香石竹種質資源“紫蝴蝶”Οη4χ=60)為母本，其花色、花形獨特，生育期短，且組培苗繁殖能力強，繁殖系數高，但育性低，抗病性弱，為枯萎病易感品種；以單瓣選擇系NH14(2n=h=30)為父本，其具有很高育性，產量高，抗病性強等特點，2η配子產生頻率大于0. 01%,在盛花期，母本去雄并套袋，待套袋后7天，母本柱頭彎曲，頂端卷曲，同時柱頭上布滿絨毛時，采集剛散粉的父本花粉，此時花粉量大、花粉活力高，進行人工授粉，授粉45 天后去袋剝取子房；
B.將步驟A剝取的子房，用體積濃度為70%的酒精消毒20s，再用質量濃度為0.1%的升汞消毒60min，無菌水沖洗4次，切開并剝取白色的胚珠，將胚珠接種于下列胚培養基上 MS+0. 6mol/L的NAA，在光照強度為15001x，光照時間為12小時/天，溫度為23°C條件下， 培養20天，使白色的胚珠長大變成黑色的種子；
C.將步驟B的種子皮切開，剝取白色的胚，繼續于下列胚培養基中MS+0.6mol/L的 NAA，在光照強度為15001x，光照時間為12小時/天，溫度為27°C條件下，培養20天；
D.將步驟C所得的胚接種在下列繼代培養基上MS+0.05mg/L的BA+0. 0lmg/L的NAA， 在光照強度為15001x，光照時間為12小時/天，溫度為的條件下，培養20天，即得到多倍體香石竹植株。胚的成苗率為2. 3%，獲得一棵植株，染色體倍性鑒定為四倍體。實施例4
A.選擇多頭香石竹種質資源“紫蝴蝶”Οη4χ=60)為母本，其花色、花形獨特，生育期短，且組培苗繁殖能力強，繁殖系數高，但育性低，抗病性弱，為枯萎病易感品種；以單瓣選擇系ΝΗ14 (2η=2χ=30)為父本，其具有很高育性，產量高，抗病性強等特點，2η配子產生頻率大于0. 01%,在盛花期，母本去雄并套袋，待套袋后14天，母本柱頭彎曲，頂端卷曲，同時柱頭上布滿絨毛時，采集剛散粉的父本花粉，此時花粉量大、花粉活力高，進行人工授粉，授粉 30天后去袋剝取子房；
B.將步驟A剝取的子房，用體積濃度為70%的酒精消毒40s，再用質量濃度為0.1%的升汞消毒20min，無菌水沖洗4次，切開并剝取白色的胚珠，將胚珠接種于下列胚培養基上 MS+0. 4mol/L的NAA，在光照強度為18001x，光照時間為9小時/天，溫度為27°C條件下，培養60天，使白色的胚珠長大變成黑色的種子；
C.將步驟B的種子皮切開，剝取白色的胚，繼續于下列胚培養基中MS+0.2mol/L的NAA，在光照強度為18001x，光照時間為12小時/天，溫度為23°C條件下，培養60天；
D.將步驟C所得的胚接種在下列繼代培養基上MS+0. 2mg/L的BA+0. 2mg/L的NAA，在光照強度為18001x，光照時間為8小時/天，溫度為22°C的條件下，培養40天，即得到多倍體香石竹植株。 胚的成苗率為2. 6%，獲得一棵植株，染色體倍性鑒定為四倍體。
權利要求
1.一種多倍體香石竹種質的培育方法，其特征在于經過下列步驟A.選擇四倍體種質作為母本，二倍體種質作為父本，在盛花期去雄并套袋，7 14天后進行人工授粉，授粉15 45天后去袋剝取子房；B.將步驟A剝取的子房進行消毒處理后，切開并剝取白色的胚珠，將胚珠接種在下列胚培養基上MS+0. 01 0. 6mol/L的NAA，在光照強度為1500 20001x，光照時間為8 12小時/天，溫度為23 27°C條件下，培養20 60天，使白色的胚珠長大變成黑色的種子；C.將步驟B的黑色種子的種皮切開，剝取白色的胚，繼續在下列胚培養基中 MS+0. 01 0. 6mol/L的NAA，在光照強度為1500 20001x，光照時間為8 12小時/天， 溫度為23 27°C條件下，培養20 60天；D.將步驟C所得的成活的胚接種在下列繼代培養基上MS+0.05 0. 5mg/L的 ΒΑ+0. 01 0. 3mg/L的NAA，在光照強度為1500 20001x，光照時間為8 12小時/天，溫度為22 的條件下，培養20 40天，即得到多倍體香石竹植株。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟A中的四倍體種質為柱頭親合性較強的四倍體種質，且柱頭的最佳可授期為柱頭彎曲，頂端卷曲，同時柱頭上布滿絨毛； 所述步驟A中的二倍體種質是與四倍體種質具有互補優良性狀且產生2η配子的二倍體種質，2η配子的產生頻率為大于或等于0. 01%，人工授粉時選擇剛散粉的父本花粉。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟B的消毒處理是用體積濃度為70%的酒精消毒20 60s，再用質量濃度為0. 1 0. 2%的升汞消毒20 60min，無菌水沖洗3 4次。
全文摘要
本發明提供一種多倍體香石竹種質的培育方法，通過產生2n配子的二倍體種質作為父本與四倍體母本雜交，在盛花期，母本去雄并套袋，7～14天后進行人工授粉，授粉15～45天后去袋剝取子房；對子房消毒處理后，切開并剝取白色的胚珠，將胚珠接種在胚培養基上培養，使白色的胚珠長大變成黑色的種子，切開種皮，剝取白色的胚，繼續在胚培養基上培養，再在繼代培養基上培養，得多倍體香石竹植株。本發明成功將二倍體的有利基因及雜合性導入四倍體栽培種中，并克服胚敗育難題，極大地豐富香石竹遺傳育種基因庫，是目的性狀基因漸滲非常有效的途徑，有利于不同倍性的種質滲入和基因流動，雜交后代具有更廣泛的遺傳變異，雜交后代的性狀也很穩定。
文檔編號A01H4/00GK102217545SQ20111014143
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月27日 優先權日2011年5月27日
發明者周旭紅, 張顥, 桂敏, 王慧敏, 王繼華, 莫錫君, 陳敏 申請人:云南省農業科學院花卉研究所