專利名稱：一種白及多倍體植株的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種白及多倍體植株的培育方法。
背景技術(shù)：
白及為蘭科植物白及(Bletilla sfriata(Thunb.)Reiehb.f.)的干燥塊莖，具有收斂止血，消腫生肌等功效，用于治療咯血，吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂等癥。白及不僅藥用價值高，而且極具觀賞價值，是我國現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)和化妝品工業(yè)的重要原材料。近年來，隨著我國中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，白及在臨床上的應用范圍不斷擴大，白及的用藥需求急劇增加。但白及種子非常細小且無胚乳，因此在自然條件下很難萌發(fā)和生長，實生苗的栽培較為困難，僅靠分株繁殖，而白及分株繁殖周期長，繁殖效率低，而且耗種量大，很難滿足大量栽培的需要。白及正面臨著資源難以滿足市場的嚴峻現(xiàn)實。白及種質(zhì)的好壞是影響白及產(chǎn)量重要的因素。因此，加強白及優(yōu)良品種的選育至關(guān)重要。多倍體植物在自然界中是普遍存在的，由于它們在生理上較普通植物有更強的適應性和遺傳上有較大的可塑性，使得育種學家自20世紀30年代開始就熱衷于多倍體誘導育種的研究。目前多倍體誘導育種工作在農(nóng)作物、果樹、蔬菜、花卉等領(lǐng)域廣泛開展，取得了很好的成績，如目前多倍體馬鈴薯、西瓜等都已經(jīng)投入到生產(chǎn)應用中，已經(jīng)帶來了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。藥用植物多倍體育種工作開展得也比較早，自從1937年布萊克斯里用秋水仙素處理曼佗羅獲得多倍體，半個多世紀以來，育種學家對多種藥用植物進行了多倍體育種的研究，培育了許多高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種，現(xiàn)今，已在卷葉貝母、青蒿、金銀花、羅勒、丹參、紫錐菊、黃芪等藥用植物上誘導成功。藥用植物多倍體具有以下的優(yōu)點:1.生物廣量提聞藥用植物大多以收獲根、莖、葉等營養(yǎng)器官為主，具有巨大性的特點，藥用植物可以利用其優(yōu)勢來提高藥材產(chǎn)量。川黃柏同源四倍體較原植物葉子寬大而厚實，莖桿粗壯；四倍體決明種子比二倍體決明種子增重70% ；S.Amiri等研就表明多倍體曼陀羅葉片寬大，植株干重、葉綠素含量較原植物聞。2.抗逆性提高多數(shù)的多倍體對外界環(huán)境條件具有較強的適應性，多倍體植株莖桿粗壯故能較好的抗倒伏有的還有抗旱、抗病、抗寒等特性。例如張笑藝對不同倍性的盾葉薯蕷進行高溫抗性研究，測定葉片內(nèi)與高溫脅迫相關(guān)的各項生理指標，表明四倍體盾葉薯蕷對高溫脅迫具有更好的耐受性。3.藥用活性成分含量高藥用植物的多倍體育種一方面要提高產(chǎn)量，另一方面應使藥用植物內(nèi)的化學藥效成分含量明顯增加，并且可增添新的藥效成分。例如，有研究表現(xiàn)盾葉薯蕷的同源四倍體中有效成分薯蕷皂苷的含量比原植物高1.2倍左右；隨著生物技術(shù)的發(fā)展，藥用植物的多倍體育種工作也取得了較大的進展，獲得了一些多倍體新品種，以其速 生、優(yōu)質(zhì)、高抗逆性等特性在生產(chǎn)上取得了較好效果。藥用植物多倍體育種拓寬了種質(zhì)資源，防止了由于長期的栽培而導致的藥用植物品種退化。可以預見，生物技術(shù)在中藥材品種改良方面具有很好的應用前景，將隨著人類對其應用價值認識的提高，以及有關(guān)新技術(shù)方法的應用，從而帶動未來藥用植物的可持續(xù)、高效發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的提供一種白及多倍體植株的制備方法，利用該方法可以獲得具有四倍體特征的白及植株，且操作簡單，適合規(guī)模化生產(chǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種白及多倍體植株的培育方法，所述方法包括:(I)將消毒后的白及種子抖入秋水仙素溶液中，黑暗條件下培養(yǎng)6 8d后，離心、洗漆去除秋水仙素；所述秋水仙素溶液中秋水仙素濃度為0.1 0.4%(w/w),pH5.8 6.2,溶劑為1/2MS或MS培養(yǎng)液，其中還可添加0.lmg/L-1.0mg/L的6-芐氨基嘌呤；白及種子可直接對蒴果進行消毒，也可將蒴果中的種子取出后進行消毒；(2)將秋水仙素處理過的白及種子轉(zhuǎn)接到白及種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，先于培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)5 6d，再移至培養(yǎng)室， 培養(yǎng)溫度23 27°C，光照度2000 25001x，光照12h/d，培養(yǎng)三個月得到多倍體白及幼苗；所述白及種子萌發(fā)培養(yǎng)基組成如下:1-萘乙酸0.2 0.5mg/L, pH5.8 6.2，溶劑為 1/2MS 或 MS 培養(yǎng)液；(3)將上述培養(yǎng)得到的白及幼苗，挑選出莖變粗、葉片加厚、葉色加深的植株，轉(zhuǎn)接到白及增殖培養(yǎng)基中進行穩(wěn)定擴繁，選取2 3代性狀穩(wěn)定的植株進行多倍體的鑒定；所述白及增殖培養(yǎng)基組成如下:6_節(jié)氨基嘌呤1.0 2.0mg/L, 1-萘乙酸0.1 0.5mg/L,pH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養(yǎng)液；(4)鑒定為多倍體的植株轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，即獲得白及多倍體植株的幼苗；所述生根壯苗培養(yǎng)基組成如下:1-萘乙酸0.5 0.6mg/L，香蕉汁(香蕉去皮切片加水煮，按照重量最后定容后過濾即為香蕉汁，約300g香蕉定容至1L)5 10%(v/v)，PH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養(yǎng)液。幼苗在生根壯苗培養(yǎng)基中待根長到2cm以上時，打開瓶蓋，至于室溫下培養(yǎng)2 4天后，取出小苗，洗去根部培養(yǎng)基，栽入營養(yǎng)土中，澆透水，并用塑料薄膜覆蓋一周后去除地膜，定期進行澆水施肥等管理，直至長成白及四倍體植株，塊莖巨大，故稱為巨莖白及(參見圖5)。步驟(I)所述消毒方法可如下:取白及蒴果，用洗衣粉浸泡8 lOmin，自來水沖洗5 5min,然后用75%乙醇消毒2 3min,無菌水沖洗,0.1%升萊消毒15 20min,無菌水沖洗，無菌吸水紙將蒴果表面殘留的水吸干，消毒后的白及蒴果切開即獲得消毒后的白及種子。步驟(I)所述消毒方法如下:白及蒴果切開，取白及種子，加入75%乙醇，IOs后立即加入無菌水，離心或過濾，取白及種子加入0.1%升汞溶液，5min后加入無菌水，離心或過濾，取白及種子用無菌吸水紙上吸干，即得消毒后的白及種子。具體可如下:直接取白及種子，每100 200mg的種子中加入0.5 Iml的75%乙醇，IOs后立即加入30 50ml的無菌水，1000 1500rpm離心2 5min使種子沉淀,去除液體,或者用無菌濾膜過濾出白及種子，之后加入0.5 Iml的0.1%升萊溶液,5min后加入,30 50ml的無菌水，1000 1500rpm離心2 5min使種子沉淀，去除液體，或者用無菌濾膜過濾出白及種子，無菌吸水紙上將殘留的水吸凈，可得無菌白及種子。多倍體的鑒定方法如下:于上午8 9時取組培苗植株的根尖，立即將材料放進
0.002mol/L8-0H喹啉溶液，在4°C下預處理4 6h，蒸餾水清洗3遍，在4°C下，卡諾氏液(冰醋酸:無水乙醇體積比=1:3，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配)在4°C下固定24h，蒸餾水漂洗3次，每次lOmin，用l.0mol/L的鹽酸常溫解離15 20min，至除根尖外根段透明呈黃色時為宜，將根尖置于蒸餾水中低滲處理約30min或更長時間，用改良苯酚品紅溶液和醋酸洋紅溶液進行染色，30min后壓片，壓至根尖分開成云霧狀，鏡檢觀察2n=4X=64 (圖1)，作為普通白及2n=2X=32，故可確定獲得的植株為四倍體植株。多倍體的鑒定染色體中流式分析的具體內(nèi)容如下:(a)細胞核提取液的配制組成為15mM Tris ；80mM KCl ；20mM NaCl ；20mMEDTA-Na2巰基乙醇；4mMMgCl2.6H20 ；0.l%TritonX-100 ；PH7.5。(b)制備RNA酶及染色液將RNA 酶 A 溶于 lOmmol/L Tris-HCl (pH7.5)、15mmol/L NaCl 中，配成 lOmg/mL的溶液，于100°c水浴中加熱15min，緩慢冷卻至室溫后分裝成小份，保存于-20°c中。碘化丙錠(propidium iodide, PI)及RNase (DNase-free)加入到細胞核提取液中，使其終濃度為lOOiig/ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。(C)處理材料及結(jié)果分析取白及多倍體葉片以及普通白及葉片各Ig左右，加入1.8ml冰浴預冷的細胞核提取液，在培養(yǎng)皿里用銳利的眼 科剪快速將其剪碎，以二倍體白及葉片作對照。然后經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過濾至1.5ml離心管中，4°C條件下，IOOOrpm離心5min,吸取上清液200 300 U I,加入等體積上述染色液，懸起，暗處染色5-15min,進行流式細胞儀檢測及軟件分析,發(fā)現(xiàn)對照組即普通白及含2C DNA，多倍體白及含4C DNA (圖2)，進一步表明本發(fā)明所得到的白及多倍體植株為四倍體植株。按照本發(fā)明方法得到的白及四倍體幼苗，其特征如下:與二倍體白及相比，葉片明顯變厚，顏色變深，整個植株形態(tài)上明顯比二倍體白及粗大(圖3)，4X 100倍鏡下單個視野氣孔數(shù)目為5±0.907 (二倍體14±4.90)，保衛(wèi)細胞長和寬分別為2.111±0.231、1.867±0.239 (二倍體白及保衛(wèi)細胞長和寬分別為1.414±0.408、1.083±0.427)(圖4)。在本發(fā)明中，MS培養(yǎng)液配方舉例如下:大量元素母液:NH4N0316.5g ；MgS04 7H203.7g ；KH2PO41.7g ；KN0319g,加水溶解，定容至500ml ；鈣鹽母液:CaCl23.32g，加水溶解，定容至500ml ；微量元素母液:K10.0415g ;Na2Mo04 2H200.0125g ;H3B030.31g ;CuSO4 5H200.00125g ；MnS04 H2O0.845g ；CoCl2 6H200.00125g ；ZnSO4 7H200.43g，加水溶解，定容至500ml ；鐵鹽母液:EDTA二鈉 3.725g，加 100ml 水加熱溶解，F(xiàn)eSO4 7H202.785g，加 100ml水溶解后兩者混勻，加水配成500ml ；維生素母液:鹽酸吡哆醇(VB6) 0.025g ;鹽酸硫胺素(VBl) 0.025g ;煙酸0.025g,甘氨酸0.lg，加水溶解，定容至500ml ；
配ILMS培養(yǎng)液:取大量元素母液50ml，鈣鹽母液50ml，微量元素母液10ml，維生素母液IOml,鐵鹽母液5ml,加肌醇0.1g,鹿糖或白砂糖20 30g,蒸懼水定容至1L。1/2MS指溶液中所含的大量元素和鈣鹽為MS的一半，其他不變。本發(fā)明所獲得的多倍體白及植株具有能顯著提高單個塊莖的重量，植株形態(tài)特征為:株高40 70cm，花葶長35 50cm，葉5片，葉距3 7cm，頂葉長40 _55cm，寬7 IOcm,最寬葉寬8 12cm, 45 55cm。花序著花數(shù)13 17枚,蒴果長3 5cm,直徑0.7
1.5cm。蒴果平均重1200 1800mg,最大蒴果重2300mg,單個塊莖重50 120g,直徑5 15cm0本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明利用白及種子為材料獲得的白及多倍體植株，具有顯著的多倍體特征，且制備方法簡單，對白及新品種的培育工作具有重要的指導意義，本發(fā)明獲得的白及多倍體具有較高的應用價值。


圖1為實施例1步驟4)染色體計數(shù)結(jié)果，a為二倍體白及，b為四倍體白及(即本發(fā)明制備的多倍體植株)，4X 100倍鏡下觀察并拍照；圖2為實施例1步驟4)流式分析結(jié)果，a為二倍體白及，b為本發(fā)明所制備的四倍體植株；圖3為實施例1步驟5)生 根壯苗后得到的植株，a為本發(fā)明所制備的植株，b為二倍體白及植株；圖4為實施例1步驟5)得到的白及多倍體幼苗的氣孔大小結(jié)果，左邊為二倍體白及，右邊為本發(fā)明得到的多倍體白及植株，4X40倍鏡下單個視野中的氣孔數(shù)目和大小。圖5為實施例1步驟6 )中的白及塊莖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:實施例1:I)取白及蒴果一個,用洗衣粉浸泡IOmin,用自來水沖洗5min。然后用75%乙醇消毒2min，無菌水沖洗，0.1%升汞消毒15min，無菌水將殘留的升汞沖洗干凈，無菌吸水紙將蒴果表面殘留的水吸干；2)將白及蒴果切開，取蒴果中的種子接入0.1%秋水仙素溶液中(以1/2MS為溶劑)，黑暗條件下培養(yǎng)7d。處理完畢后，IOOOrpm離心Imin使種子沉淀，取種子，用無菌蒸餾水洗滌三次，得到初步萌發(fā)的白及種子；3)將上述秋水仙素處理過的白及種子轉(zhuǎn)接到MS+0.2mg/Ll-萘乙酸的培養(yǎng)基中，放在培養(yǎng)箱進行暗培養(yǎng)5d，再移至培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度(25±2)°C，光照度2000 25001x，光照12h/d，培養(yǎng)三個月得到多倍體白及幼苗；4)將上述培養(yǎng)得到的白及幼苗，挑選出莖變粗、葉片加厚、葉色加深等外觀形態(tài)特征的植株，轉(zhuǎn)接到MS+1.0mg/L6-節(jié)氨基嘌呤+0.lmg/Ll-萘乙酸的培養(yǎng)基中進行穩(wěn)定擴繁，相同培養(yǎng)基中續(xù)代培養(yǎng)2 4代，2 3代后若性狀仍穩(wěn)定，則進行多倍體的鑒定；
具體步驟為:于上午8 9時取多倍體以及普通白及組培苗植株的根尖，立即將材料放進0.002mol/L8-0H喹啉溶液，在4°C下預處理4 6h，蒸餾水清洗3遍，在4°C下，卡諾氏液(冰醋酸:無水乙醇=1:3，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配)在4°C下固定24h，蒸餾水漂洗3次，每次lOmin，用1.0mol/L的鹽酸常溫解離15 20min，至除根尖外根段透明呈黃色時為宜，將根尖置于蒸餾水中低滲處理約30min或更長時間，用改良苯酚品紅溶液和醋酸洋紅溶液進行染色，30min后壓片，壓至根尖分開成云霧狀，鏡檢觀察多倍體植株2n=4X=64，普通白及植株2n=2X=32，確定所得到的為四倍體植株。進一步進行流式分析，主要方法步驟為:取白及多倍體葉片以及普通白及葉片各Ig左右，加入1.8ml冰浴預冷的細胞核提取液，在培養(yǎng)皿里用銳利的眼科剪快速將其剪碎，以二倍體白及葉片作對照。然后經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過濾至1.5ml離心管中，4°C條件下，IOOOrpm離心5min,吸取上清液200 300 U I,加入等體積上述染色液，懸起，暗處染色5 15min,進行流式細胞儀檢測及軟件分析,發(fā)現(xiàn)對照組即普通白及含2C DNA，多倍體白及含4C DNA (圖2)，進一步表明本發(fā)明所得到的白及多倍體植株為四倍體植株。5)將四倍體白及轉(zhuǎn)接到MS+0.5mg/Ll-萘乙酸+10%香蕉汁的培養(yǎng)基中，待根長到2cm以上時，打開瓶蓋，至于室溫下2 4天，取出小苗，洗去根部培養(yǎng)基，栽入營養(yǎng)土中，澆透水，并用塑料薄膜覆蓋一周；6)上述白及苗在地膜覆蓋一周后去除地膜，定期進行澆水施肥等管理，三年后長成白及四倍體植株，取其中一棵植株，測得株高:66cm，塊莖直徑分別為:10X9X4cm (長X寬X厚);13X9X5cm。葉片5片，葉距3 7cm，頂葉長41cm，寬3.5 5cm，中間葉片長33cm,寬5 8cm,塊莖重93.0lg,整個植株重138g,蒴果長2.5cm,直徑0.7cm。實施例2:`
具體步驟如實施例1所述，不同的是步驟2中的秋水仙素濃度為0.20%,處理時間為9d，變異率為41.07 ± 1.34%。最后，還需注意的是，以上實施例子僅是本發(fā)明的若干個具體實施例子，本發(fā)明不限于上述的實施例，還有許多變形，本領(lǐng)域相關(guān)的人員能從本發(fā)明內(nèi)容中直接導出或者聯(lián)想出的所有變形，均認為是本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種白及多倍體植株的培育方法，所述方法包括: (1)將消毒后的白及種子抖入秋水仙素溶液中，黑暗條件下培養(yǎng)6 8d后，離心、洗滌去除秋水仙素；所述秋水仙素溶液濃度為0.1 0.4%，pH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養(yǎng)液； (2)將秋水仙素處理過的白及種子轉(zhuǎn)接到白及種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，先于培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)5 6d，再移至培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度23 27°C，光照度2000 25001x，光照12h/d，培養(yǎng)三個月得到多倍體白及幼苗；所述白及種子萌發(fā)培養(yǎng)基組成如下:1-萘乙酸0.2 0.5mg/L，pH5.8 6.2，溶劑為 1/2MS 或 MS 培養(yǎng)液； (3)將上述培養(yǎng)得到的白及幼苗，挑選出莖變粗、葉片加厚、葉色加深的植株，轉(zhuǎn)接到白及增殖培養(yǎng)基中進行穩(wěn)定擴繁，選取2 3代性狀穩(wěn)定的植株進行多倍體的鑒定；所述白及增殖培養(yǎng)基組成如下:6_節(jié)氨基嘌呤1.0 2.0mg/L, 1-萘乙酸0.1 0.5mg/L, pH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養(yǎng)液； (4)鑒定為多倍體的植株轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，即獲得白及多倍體植株的幼苗；所述生根壯苗培養(yǎng)基組成如下:1-萘乙酸0.5 1.0mg/L,香蕉汁5 10%，PH5.8 6.2，溶劑為1/2MS或MS培養(yǎng)液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)所述消毒方法如下:取白及蒴果，用洗衣粉浸泡8 IOmin,自來水沖洗5 5min,然后用75%乙醇消毒2 3min,無菌水沖洗，0.1%升汞消毒15 20min，無菌水沖洗，無菌吸水紙將蒴果表面殘留的水吸干，消毒后的白及蒴果切開即獲得消毒后的白及種子。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)所述消毒方法如下:白及蒴果切開，取白及種子，加入75%乙醇，IOs后立即加入無菌水，離心或過濾，取白及種子加入0.1%升汞溶液，5min后加入無菌水 ，離心或過濾，取白及種子用無菌吸水紙上吸干，即得消毒后的白及種子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種白及多倍體植株的培育方法，所述方法包括秋水仙素處理白及種子、白及種子萌發(fā)培養(yǎng)、白及幼苗增殖培養(yǎng)等步驟，鑒定為多倍體的植株再轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，即獲得白及多倍體植株的幼苗；本發(fā)明利用白及種子為材料獲得的白及多倍體植株，具有顯著的多倍體特征，且制備方法簡單，對白及新品種的培育工作具有重要的指導意義，本發(fā)明獲得的白及多倍體具有較高的應用價值。
文檔編號A01H4/00GK103168685SQ20131008525
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者蔣福升, 丁志山, 呂迪, 李偉平, 金波, 丁濱, 高承賢 申請人:浙江中醫(yī)藥大學