專利名稱：一種遼東楤木原生質體培養方法
技術領域：
本發明涉及一種遼東橡木原生質體培養方法。
背景技術：
遼東橡木[Aralia elates (Miq. ) kem]是一種食藥兼用型經濟植物，主要分布于中國東北地區。遼東橡木的食藥用價值較高，其嫩芽含有豐富的營養成分；其植株根、莖、葉等器官均含有多種橡木皂苷，主要皂苷元為齊墩果酸類化合物，可作為生產中藥制劑的原料。原生質體具有細胞全能性，能夠再生細胞壁并進行細胞分裂并再生成完整植株。 遼東橡木原生質體的培養可為進一步篩選橡木皂苷高產細胞及細胞系、開展細胞融合與再生植株培養，以及為以原生質體為受體材料進行的各種遺傳分析與操作提供基礎材料。目前關于遼東橡木相關報道研究均在外植體再生愈傷組織、植株再生方面，現今尚未見到利用遼東橡木的愈傷組織、葉片等來源的原生質體培養及植株再生的相關報道。

發明內容
本發明提供一種遼東橡木原生質體培養方法，可為進一步篩選橡木皂苷高產細胞及細胞系、開展細胞融合與再生植株培養，以及為以原生質體為受體材料進行的各種遺傳分析與操作提供基礎材料。本發明遼東橡木原生質體培養方法，按以下步驟進行一、取培養20 30天的遼東橡木無菌苗葉片，放入含有600mmol/L甘露醇的CPW溶液中密封，于2 6°C暗處理 6 他；二、再將無菌苗葉片放入含有600mmol/L甘露醇的酶解液中密封，于23 27°C暗處理2 14h，得混合液；三、將步驟二得到的混合液經MO目篩網過濾，再以1500r/min離心3min，去掉上清，將所得沉淀加入到750 900mmol/L的蔗糖溶液中，以500r/min離心 lmin，然后用吸管將處于離心管中部的原生質體帶吸出，放入CPW溶液中洗滌2 3次，得到純化后的原生質體；四、將純化后的原生質體放入培養基中混勻后加入到培養皿中，將培養皿封口，再將培養皿放入搖床中，在25°C、60 80r/min條件下進行暗培養，每隔3天更換一次培養基，培養13 17天后，獲得微小愈傷組織；五、將微小愈傷組織移植到芽分化培養基中培養，誘導成苗，即完成遼東橡木原生質體培養方法；其中步驟四所述培養基為含有 1. Omg/L的2，4-D、l. Omg/L的BA和質量濃度3%蔗糖的MS培養基；步驟五所述芽分化培養基為含有1. Omg/L的6-BA、0. lmg/L的NAA、質量濃度3%蔗糖和6. 5g/L瓊脂的MS培養基。本發明操作簡便，設備要求低，污染率極低，制備的原生質體具有鮮艷的顏色，形態較圓且透明，原生質體的活性為80. 5% 87. 7%，產量為1. 0 3. 2X IO7個/g。原生質體培養過程中細胞增殖較快，形成的微型愈傷組織活力高，生長迅速，轉接到固體培養基上成活率可達95%以上。本發明著重于探索影響原生質體分離和培養的因素，完善原生質體穩定高效的分離與培養體系，以提高原生質體培養的重復性，使原生質體培養更為簡單化和實用化。以此獲取的大量高活性原生質體及誘導的愈傷組織可以滿足橡木皂苷高產細胞系篩選培育和細胞融合等實驗的需要。


圖1為具體實施方式
二十八得到的原生質體的形態照片；圖2為具體實施方式
二十八中原生質體培養過程中形成的細胞；圖3為具體實施方式
二十八中原生質體培養過程中形成的細胞團。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式遼東橡木原生質體培養方法，按以下步驟進行一、 取培養20 30天的遼東橡木無菌苗葉片，放入含有600mmol/L甘露醇的CPW溶液中密封， 于2 6°C暗處理6 他；二、再將無菌苗葉片放入含有600mmol/L甘露醇的酶解液中密封， 于23 27°C暗處理2 14h，得混合液；三、將步驟二得到的混合液經MO目篩網過濾，再以1500r/min離心3min，去掉上清，將所得沉淀加入到750 900mmol/L的蔗糖溶液中，以 500r/min離心lmin，然后用吸管將處于離心管中部的原生質體帶吸出，放入CPW溶液中洗滌2 3次，得到純化后的原生質體；四、將純化后的原生質體放入培養基中混勻后加入到培養皿中，將培養皿封口，再將培養皿放入搖床中，在25°C、60 80r/min條件下進行暗培養，每隔3天更換一次培養基，培養13 17天后，獲得微小愈傷組織；五、將微小愈傷組織移植到芽分化培養基中培養，誘導成苗，即完成遼東橡木原生質體培養方法；其中步驟四所述培養基為含有1. Omg/L的2，4-D、l. Omg/L的BA和質量濃度3%蔗糖的MS培養基；步驟五所述芽分化培養基為含有1. Omg/L的6-BA、0. lmg/L的NAA、質量濃度3%蔗糖和6. 5g/L 瓊脂的MS培養基。本實施方式所述CPW 溶液由 101mg/L 的 KN03、27. 2mg/L 的 KH2P04、0. 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20,246mg/L 的 MgSO4 · 7Η20、0· 16mg/L 的 ΚΙ、1. 48mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和蒸餾水組成，CPW溶液的pH值為5.8。本實施方式中BA為芐氨基嘌呤，6-BA為6_芐氨基嘌呤，NAA為a_萘乙酸。本實施方式操作簡便，設備要求低，污染率極低，制備的原生質體具有鮮艷的顏色，形態較圓且透明，原生質體的活性為80. 5% 87. 7%，產量為1. O 3. 2 X IO7個/g。原生質體培養過程中細胞增殖較快，形成的微型愈傷組織活力高，生長迅速，轉接到固體培養基上成活率可達95%以上。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中于2°C暗處理。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中于6°C暗處理。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中于3 5°C暗處理。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中于4°C暗處理。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟一中暗處理他。其它與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟一中暗處理他。其它與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟一中暗處理幾。其它與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一至八之一不同的是步驟二所述酶解液為含有質量濃度2%的纖維素酶(Cellulase R-10)和質量濃度0. 4%的離析酶 (MacerozymeR-IO)的CPW溶液。其它與具體實施方式
一至八之一相同。本實施方式所述CPW 溶液由 101mg/L 的 KN03、27. 2mg/L 的 KH2P04、0. 025mg/L 的 CuSO4 · 5H20,246mg/L 的 MgSO4 · 7Η20、0· 16mg/L 的 ΚΙ、1. 48mg/L 的 CaCl2 · 2H20 和蒸餾水組成，CPW溶液的pH值為5.8。本實施方式的酶解液使用前需要經過0. 22 μ m混合纖維素微孔濾膜過濾除菌，其 pH 為 5.8。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一至九之一不同的是步驟二中于 23 °C暗處理。其它與具體實施方式
一至九之一相同。
具體實施方式
十一本實施方式與具體實施方式
一至九之一不同的是步驟二中于27°C暗處理。其它與具體實施方式
一至九之一相同。
具體實施方式
十二 本實施方式與具體實施方式
一至九之一不同的是步驟二中于25°C暗處理。其它與具體實施方式
一至九之一相同。
具體實施方式
十三本實施方式與具體實施方式
一至十二之一不同的是步驟二中暗處理池。其它與具體實施方式
一至十二之一相同。
具體實施方式
十四本實施方式與具體實施方式
一至十二之一不同的是步驟二中暗處理14h。其它與具體實施方式
一至十二之一相同。
具體實施方式
十五本實施方式與具體實施方式
一至十二之一不同的是步驟二中暗處理4 12h。其它與具體實施方式
一至十二之一相同。
具體實施方式
十六本實施方式與具體實施方式
一至十二之一不同的是步驟二中暗處理6 10h。其它與具體實施方式
一至十二之一相同。
具體實施方式
十七本實施方式與具體實施方式
一至十二之一不同的是步驟二中暗處理他。其它與具體實施方式
一至十二之一相同。
具體實施方式
十八本實施方式與具體實施方式
一至十七之一不同的是步驟三中將所得沉淀加入到750mmol/L的蔗糖溶液中。其它與具體實施方式
一至十七之一相同。
具體實施方式
十九本實施方式與具體實施方式
一至十七之一不同的是步驟三中將所得沉淀加入到900mmol/L的蔗糖溶液中。其它與具體實施方式
一至十七之一相同。
具體實施方式
二十本實施方式與具體實施方式
一至十七之一不同的是步驟三中將所得沉淀加入到850mmol/L的蔗糖溶液中。其它與具體實施方式
一至十七之一相同。
具體實施方式
二十一本實施方式與具體實施方式
一至二十之一不同的是步驟四中在25°C、60r/min條件下進行暗培養。其它與具體實施方式
一至二十之一相同。
具體實施方式
二十二 本實施方式與具體實施方式
一至二十之一不同的是步驟四中在25°C、80r/min條件下進行暗培養。其它與具體實施方式
一至二十之一相同。
具體實施方式
二十三本實施方式與具體實施方式
一至二十之一不同的是步驟四中在25°C、70r/min條件下進行暗培養。其它與具體實施方式
一至二十之一相同。
具體實施方式
二十四本實施方式與具體實施方式
一至二十三之一不同的是步驟四中培養13天。其它與具體實施方式
一至二十三之一相同。
具體實施方式
二十五本實施方式與具體實施方式
一至二十三之一不同的是步驟四中培養17天。其它與具體實施方式
一至二十三之一相同。
具體實施方式
二十六本實施方式與具體實施方式
一至二十三之一不同的是步驟四中培養14 16天。其它與具體實施方式
一至二十三之一相同。
具體實施方式
二十七本實施方式與具體實施方式
一至二十三之一不同的是步驟四中培養15天。其它與具體實施方式
一至二十三之一相同。
具體實施方式
二十八本實施方式遼東橡木原生質體培養方法，按以下步驟進行 一、取培養30天的遼東橡木無菌苗頂部葉片lg，放入20mL含有600mmol/L甘露醇的CPW 溶液中密封，于4°C暗處理；二、再將無菌苗葉片放入IOmL含有600mmol/L甘露醇的酶解液中密封，于25°C暗處理8，得混合液；三、將混合液經MO目篩網過濾，再以1500r/min 離心3min，去掉上清，將所得沉淀加入到850mmol/L的蔗糖溶液中，以500r/min離心lmin， 然后用吸管將處于離心管中部的原生質體帶吸出，放入5mLCPW溶液中洗滌3次，得到純化后的原生質體；四、將純化后的原生質體放入培養基中混勻后加入到培養皿中，將培養皿用 Paraf i Im膜封口，再將培養皿放入搖床中，在25°C、70r/min條件下進行暗培養，每隔3天更換一次培養基，培養15天后，獲得微小愈傷組織；五、將微小愈傷組織移植到芽分化培養基中培養，誘導成苗，即完成遼東橡木原生質體培養方法。原生質體活性測定采用曲利本藍染色法，原生質體活性及原生質體產量的計算公式如下原生質體活性=未被染色的原生質體數(有活性)/原生質體總數X100%。原生質體產量(個/g)=原生質體總數(個)/材料鮮重(g)本實施方式制備的原生質體具有鮮艷的顏色，形態較圓且透明，如圖1所示。圖2 為原生質體培養過程中形成的細胞，圖3為原生質體培養過程中形成的細胞團。本實施方式原生質體的活性為84. 13%，產量為2. 12 X IO7個/g。原生質體培養過程中細胞增殖較快，形成的微型愈傷組織活力高，生長迅速，轉接到固體培養基上成活率可達97%。
權利要求
1.一種遼東橡木原生質體培養方法，其特征在于遼東橡木原生質體培養方法，按以下步驟進行一、取培養20 30天的遼東橡木無菌苗葉片，放入含有600mmol/L甘露醇的CPW 溶液中密封，于2 6°C暗處理6 他；二、再將無菌苗葉片放入含有600mmol/L甘露醇的酶解液中密封，于23 27°C暗處理2 14h，得混合液；三、將步驟二得到的混合液經MO目篩網過濾，再以1500r/min離心3min，去掉上清，將所得沉淀加入到750 900mmol/L的蔗糖溶液中，以500r/min離心lmin，然后用吸管將處于離心管中部的原生質體帶吸出，放入 CPW溶液中洗滌2 3次，得到純化后的原生質體；四、將純化后的原生質體放入培養基中混勻后加入到培養皿中，將培養皿封口，再將培養皿放入搖床中，在25°C、60 80r/min條件下進行暗培養，每隔3天更換一次培養基，培養13 17天后，獲得微小愈傷組織；五、將微小愈傷組織移植到芽分化培養基中培養，誘導成苗，即完成遼東橡木原生質體培養方法； 其中步驟四所述培養基為含有1. Omg/L的2，4-D、l. Omg/L的BA和質量濃度3%蔗糖的MS 培養基；步驟五所述芽分化培養基為含有1. Omg/L的6-BA、0. lmg/L的NAA、質量濃度3%蔗糖和6. 5g/L瓊脂的MS培養基。
2.根據權利要求1所述的一種遼東橡木原生質體培養方法，其特征在于步驟一中于 3 5°C暗處理。
3.根據權利要求1所述的一種遼東橡木原生質體培養方法，其特征在于步驟一中于 4°C暗處理。
4.根據權利要求1或2所述的一種遼東橡木原生質體培養方法，其特征在于步驟一中暗處理7h。
5.根據權利要求4所述的一種遼東橡木原生質體培養方法，其特征在于步驟二中于 25 °C暗處理。
6.根據權利要求5所述的一種遼東橡木原生質體培養方法，其特征在于步驟二中暗處理4 12h。
7.根據權利要求5所述的一種遼東橡木原生質體培養方法，其特征在于步驟二中暗處理8h。
8.根據權利要求6所述的一種遼東橡木原生質體培養方法，其特征在于步驟三中將所得沉淀加入到850mmol/L的蔗糖溶液中。
9.根據權利要求8所述的一種遼東橡木原生質體培養方法，其特征在于步驟四中在 25°C、70r/min條件下進行暗培養。
10.根據權利要求9所述的一種遼東橡木原生質體培養方法，其特征在于步驟四中培養15天。
全文摘要
一種遼東楤木原生質體培養方法，涉及一種遼東楤木原生質體培養方法。本發明可為進一步篩選楤木皂苷高產細胞及細胞系、開展細胞融合與再生植株培養提供基礎材料。方法取遼東楤木無菌苗葉片，放入含甘露醇的CPW溶液中密封，暗處理；將無菌苗葉片放入含甘露醇的酶解液中密封，暗處理；過濾，離心去上清，將沉淀加入蔗糖溶液中，離心，將原生質體帶吸出，放入CPW溶液中洗滌；放入培養基中混勻后加入到培養皿中，再放入搖床暗培養，獲得微小愈傷組織；然后移植到芽分化培養基，誘導成苗，即完成遼東楤木原生質體培養方法。本發明操作簡便，設備要求低，污染率極低，制備的原生質體顏色鮮艷，形態較圓且透明，原生質體的活性高，產量高。
文檔編號A01H4/00GK102349444SQ20111022743
公開日2012年2月15日 申請日期2011年8月9日 優先權日2011年8月9日
發明者徐正莉, 李富恒, 趙恒田, 鄧中樞, 黃福山 申請人:中國科學院東北地理與農業生態研究所