專利名稱：一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法
技術領域：
本發明涉及一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法。
背景技術：
就目前的各種研究結果而言，對魚類洄游路線的研究較常用的方法主要有是標志放流法。一般是利用特制的標牌或標簽結附在人工培育的幼魚或捕獲的魚體上，放流到自然水域中。當標志魚重捕時，將放流和重捕時的各項資料加以對比，以分析魚類洄游的變動規律。其方法主要有以下幾種1.切斷標志法切斷部分鰭條；2.外部標志法將標牌或標簽掛夾在尾柄、背鰭或鰓蓋上；3.內部標志法將可探測芯片植入魚體內部，用電磁設備進行檢驗；4.同位素標志法用同位素進行標志，重捕時用示蹤原子探測器檢出標志魚；5.藥品浸泡法用一定有效比例的四環素或者茜素絡合物對標志魚進行一定時間的浸泡或食物喂養，待重捕后挑出其耳石在熒光顯微鏡下觀察有無熒光環。雖然這些方法均可以檢測出魚類的洄游路線，但是必須實現捕到標本，標志后放流才能得以實現，并且放流后的標本的成活率不能保證，實驗時間長，回捕率較低，這些均對研究魚類洄游路線造成不便，更不能對不同種群類型的魚類的洄游路線進行區分。

發明內容
本發明的目的在于提供一種一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法， 該方法操作簡單，快速，而且準確率較高。本發明所采用的技術方案是
一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法，包括如下步驟
1)在某一洄游魚類各生境設采樣點，采集樣本；
2)提取樣本基因組DNA，利用COI基因通用引物進行PCR擴增，對目的片段進行測序， 將測得的正反向序列進行比對后，通過軟件進行聚類和單倍型分析，確定每個樣本的單倍型類型；
3)把每個樣本的單倍體型標示在采樣點上，根據不同采樣點所含有的種群類型，確定該洄游魚類的種群分布和洄游路線。優選的，步驟2)所述CO I基因通用引物序列如下
CO I F，:5，-TTCTCCACCAACCACA ARGAYATYGG-3，(SEQ ID NO 1)； CO I R，5，-CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3‘ (SEQ ID NO :2)。優選的，步驟2)的具體操作為
(1)采用酚-氯仿法提取樣本基因組DNA；
(2)利用COI基因通用引物進行PCR擴增，其反應體系為50μ1，含有5μ1 buffer(200mM Tris-HCl,pH8. 4 ；200mM KCl ； 100mM(NH4)2S04 ； 15Mm MgC12)，4ul dNTP Mixture (2. 5mM), 0.6μ1引物(上游引物0. 3 μ ，下游引物0.3 μ )，4μ1模板DNA，0. 5μ1 Taq酶，其余用無菌水補足；PCR反應的條件94°C預變性:3min，40個循環(94°C變性30s，51.4°C退火45s，72°C延伸 lmin)，最后 72°C延伸 7min ；
(3)將PCR產物進行測序；
(4)將測得的正反向序列進行比對后，通過軟件進行聚類和單倍型分析，確定每個樣本的單倍型類型。優選的，所述洄游魚類為廣東魴。本發明的有益效果在于
與標志放流法的幾種方法相比，本方法不僅能夠準確快速的監測魚類的洄游路線，并且能夠區分同種魚類的不同種群類型的洄游路線，其實驗方法簡單快速，具有準確性。根據不同采樣點的單倍型種類和同種單倍型在不同采樣點的分布，可以尋找出不同單倍型種群類型的分布范圍，和根據水域的范圍及流向確定不同單倍型種群類型的洄游路線，對研究河網中同種魚類不同種群類型的活動范圍及走向具有重要意義。


圖1 每個采樣點特有的廣東魴單倍型類型；
圖2 每個采樣點共有的單倍型類型的活動范圍或洄游路線圖； 圖3 廣東魴H10、H11、H19、H20單倍型類型的活動范圍或洄游路線圖； 圖4 :「*·Η3、Η5、Η8、Η14、Η17、Η21單倍型類型的活動范圍或洄游路線圖。
具體實施例方式下面以廣東魴為例，對本發明作進一步的說明，但并不局限于此，在本領域技術人員的理解范圍內，該方法還可用于快速確定其他洄游魚類的種群分布和洄游路線。廣Mm (Megalobrania terffli/K^is)屬于鯉科，舶亞科，魴屬。廣東魴屬于江河距離洄游、有固定產卵場、聚群產卵的魚類，僅分布于廣東、廣西和海南省。珠江歷史調查，廣東魴產卵場分布于西江廣東段青皮塘和羅旁，以及珠江一級支流北江和賀江。西江廣東魴的生活范圍從錢江沿珠江至珠江口均有分布，廣東魴體型中等，是珠江水系重要的經濟魚類。至上世紀八十年代，由于梯級開發，北江和賀江的產卵場功能逐漸消失，廣東魴的生存面臨威脅。目前廣東魴產卵場保存廣東段青皮塘和羅旁二地，相距約30公里。近年監測表明，廣東魴在二個產卵場的產卵期不一致，產卵親魚個體也存在差異，早期補充資源在不斷下降。因此，了解野生廣東魴種群的遺傳多樣性，了解廣東魴不同群體在水域中的分布及洄游路線，對廣東魴的資源管理和保護具有重要意義。1、樣本采集
在西江(梧州、青皮塘、羅旁、肇慶)、東江、北江、東四口門(洪奇浙門、橫門)、西四口門 (磨刀門、崖門)等各個廣東魴分布水域采集樣本，每個采集點采集樣本分別為104 (14、33、 40、17)、68、24、55、27尾，共278尾樣本，分別做標記。2、樣本單倍型類型分析
(1)樣品DNA的提取與分離基因組DNA提取采用傳統的酚-氯仿法提取。將鰭條組織晾干，剪碎后加入460μ1 ΞΤΕ,δΟμΙ的10% SDS和10μ1 10mg/ml的蛋白酶K，充分混勻； 550C水浴消化2-3小時；加入水飽和酚600μ1，輕輕搖動混勻lOmin，12000rmp離心IOmin ； 取上清液置于新的離心管中，加入酚氯仿異戊醇25:24:1 600μ1，抽提lOmin，12000rmp離心IOmin ；取上清液置于新的離心管中，加入氯仿異戊醇500μ1，輕輕搖晃混勻 5min, 12000rmp離心IOmin ；取上清液置于新的離心管中，加入冰無水乙醇，一 20°C保存 IOmin, 12000rmp離心lOmin，倒出無水乙醇；然后用70%的乙醇漂洗1次，倒出乙醇，室溫晾干，加入ΙΟΟμΙ的ddH20，通過瓊脂糖凝膠(含0. 5ug/mL的溴化乙錠)電泳來鑒定，一
20 0C保存備用。(2) PCR擴增引物為CO I通用引物，引物序列為，
CO I F，:5，-TTCTCCACCAACCACA ARGAYATYGG-3，(SEQ ID NO 1)； CO I R，5，-CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3‘ (SEQ ID NO :2)。(3) PCR擴增對反應體系優化后進行PCR反應。其反應體系為50μ1 有5μ1 buffer (200mM Tris-HCl, pH8. 4 ；200mM KCl ； IOOmM (NH4) 2S04 ； 15mM MgCl2), 4ul dNTP Mixture (2. 5mM)，0. 6μ1 引物(上游引物 0. 3 μ ，下游引物 0.3 μ )，4μ1 模板 DNA，0. 5μ1 Taq酶，其余用無菌水補足。PCR反應的條件94°C預變性!Min，40個循環(94°C變性30s， 51.4°C退火45s，72°C延伸lmin)，最后72°C延伸7min。擴增產物4°C保存，以待電泳。(4) PCR產物的檢測擴增產物取4μ1在1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳(含0. 5g/mL溴化乙錠)上進行電泳，以220V穩定電壓電泳25min左右。電泳結果用凝膠成像系統進行拍照并保存。(5)將剩余的擴增產物送至測序公司測序。(6)將測得的正反向序列進行比對后，用軟件MEGE4. 0和DNAsp進行聚類和單倍型類型分析，確定每個樣本的單倍型數量和類型。具體步驟為MEGE4. 0中的cluster W比對后，存為*. meg文件，根據多重比對的結果，利NJ法進行系統進化樹的構建，節點的數值是Bootstrap 1000次抽樣檢驗的結果。DNAsp軟件打開meg文件，進行單倍型分析。綜合聚類分析結果和單倍型分析結果，確定所有廣東魴的樣本中，共有M種單倍型，如表1所
7J\ ο3、廣東魴種群分布和洄游路線的確定
將2分析得到的各個樣本的單倍型標示在各個采樣點上，根據不同采樣點所含有的種群類型確定廣東魴不同種群的分別位點和洄游路線。4、實驗結果
實驗結果表明，珠江水系中下游的各個江段所采集廣東魴的樣本278尾，共有M個單倍型(ΗΓΗΜ)，每種單倍型的分布位點見表1。每個采集點所分布的單倍型數目見表2、圖 2。由表1、表2可見，所有的M種單倍型中，Η4、Η24是在研究水域所有地點均能采集到， Η19是除了東江外其他采樣點也均能采集到，而HI、Η22、Η23為東四口門特有，H2、H12、H15 為羅旁特有，H6、H18為青皮塘所特有，H7為東江所特有，H13為梧州所特有，H16為北江所特有。
權利要求
1.一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法，包括如下步驟1)在某一洄游魚類各生境設采樣點，采集樣本；2)提取樣本基因組DNA，利用COI基因通用引物進行PCR擴增，對目的片段進行測序， 將測得的正反向序列進行比對后，通過軟件進行聚類和單倍型分析，確定每個樣本的單倍型類型；3)把每個樣本的單倍體型標示在采樣點上，根據不同采樣點所含有的種群類型，確定該洄游魚類的種群分布和洄游路線。
2.根據權利要求1所述一種快速確定魚類種群分布和洄游路線的方法，其特征在于， 步驟2)所述CO I基因通用引物序列如下CO I F，:5，-TTCTCCACCAACCACA ARGAYATYGG-3，(SEQ ID NO 1)；CO I R，5，-CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3‘ (SEQ ID NO :2)。
3.根據權利要求1所述一種快速確定洄游魚類種群分布和洄游路線的方法，其特征在于，步驟2)的具體操作為(1)采用酚-氯仿法提取樣本基因組DNA；(2)利用COI基因通用引物進行PCR擴增，其反應體系為50μ1，含有5μ1 buffer(200mM Tris-HCl,pH8. 4 ；200mM KCl ； 100mM(NH4)2S04 ； 15Mm MgC12)，4ul dNTP Mixture (2. 5mM), 0.6μ1引物(上游引物0. 3 μ ，下游引物0.3 μ )，4μ1模板DNA，0. 5μ1 Taq酶，其余用無菌水補足；PCR反應的條件94°C預變性:3min，40個循環(94°C變性30s，51.4°C退火45s， 72°C延伸 lmin)，最后 72°C延伸 7min ；(3)將PCR產物進行測序；(4)將測得的正反向序列進行比對后，通過軟件進行聚類和單倍型分析，確定每個樣本的單倍型類型。
4.根據權利要求1所述一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法，其特征在于，所述洄游魚類為廣東魴。
全文摘要
本發明公開了一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法，該方法基于COⅠ基因的聚類分析技術，具有操作簡單、快速、準確的特點，適于推廣應用。
文檔編號A01K61/00GK102499157SQ20111035010
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年11月8日
發明者吳茜, 李捷, 李新輝, 李躍飛, 楊計平, 王超, 譚細暢, 賴子尼 申請人:中國水產科學研究院珠江水產研究所