專利名稱：一種根癌農桿菌介導普通春性小麥成熟胚轉化體系的方法
技術領域：
本發明屬于農業生物技術領域，特別涉及一種根癌農桿菌介導普通春性小麥成熟胚轉化體系的方法。
背景技術：
利用植物基因工程技術，通過打破物種之間的界限，將優良的目的基因(抗逆、高產、優質等性狀)對作物進行有目的改造，獲得的轉基因作物在產量、抗逆能力以及品質等方面得到顯著改進，以滿足人類的需要。小麥是世界第一大糧食作物，轉基因小麥的研究一直是眾多學者研究的重點。但是與其它作物相比，小麥的轉基因研究明顯落后。自從Vasil 等(1993) (Vasil et al，Rapid production of transgenic wheat plants by direct bombardment of cultured immature embryos. Bio-Technology 1993，11 :1553-1558)首次報道了外源基因導入小麥并整合和遺傳之后，國內外又有多例小麥轉基因成功的報道， 不過獲得的轉基因小麥基本上都是以幼胚作為外植體，而且多數轉基因小麥是通過基因槍法轉化獲得的。然而，基因槍轉化法存在成本高、轉化效率低、外源基因拷貝數多等缺點。相比之下，農桿菌法具有(1)轉化效率高；( 拷貝數少，單拷貝出現頻率大；C3)能夠轉移較大的DNA片段；(4)結構變化較小，在轉基因表達和遺傳穩定性方面具有明顯的優越性； (5)操作簡單、成本低等優點成為近年來人們研究的熱點。常用的小麥外植體有幼胚、幼穗、幼葉、子葉中層、種子、頂端分生組織、成熟胚等， 但最好的外植體是幼胚和幼穗，其組織培養的愈傷組織誘導和植株再生能力最高。但是由于小麥的生長周期長，用于遺傳轉化的小麥幼胚的取材受到時間和空間限制。而收獲后的種子能長期保存，如果用成熟胚為材料進行遺傳轉化，將節省大量資源和時間，克服生長季節的局限，為試驗的取材提供極大的方便。然而，小麥成熟胚培養一般耗時長，組培效率低， 限制了成熟胚在小麥組織培養和遺傳轉化中的應用。在小麥成熟胚培養過程中，小麥高頻再生系統是提高轉化率的首要保證。其中基因型和培養基中激素類型、配比是最重要的影響因素。國內外學者對于培養基中激素類型和配比研究結果各不相同。其中，2，4-D是小麥成熟胚培養中應用最廣泛的生長調節劑，每升培養基中添加2mg 8mg的2，4-D即能夠誘導愈傷組織；細胞分裂素KT在某種程度上能夠拮抗高濃度2，4-D對愈傷組織分化的抑制作用，對愈傷組織有一定的毒害作用，而不建議在誘導愈傷培養基中添加。外源基因通過農桿菌介導法轉化小麥的效率，不僅與小麥基因型、培養基關系密切，還與培養時間、農桿菌類型、濃度和侵染時間有關。甚至有的研究認為不同農桿菌對同一基因型小麥的侵染能力也不同。因此尋找高效的小麥成熟胚培養基因型，建立起完善的高效率成熟胚轉化體系，是小麥研究工作者的一個重要課題，對小麥轉基因研究將有巨大的推動作用
發明內容
本發明的目的在于，提供一種根癌農桿菌介導普通春性小麥成熟胚轉化體系的方法，該方法適用于進行小麥轉基因，可成功獲得小麥轉基因植株。為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案一種根癌農桿菌介導普通春性小麥成熟胚轉化體系的方法，其特征在于，在進行目的基因轉化時，選用再生能力較強的春性小麥品種成熟胚愈傷組織為材料，接種于小麥成熟胚培養基，然后用帶有目的基因的農桿菌菌株EHA105侵染成熟胚愈傷組織，愈傷組織經潮霉素篩選后得到抗性愈傷組織，經過愈傷組織誘導、根癌農桿菌侵染、除菌培養、預分化篩選培養、分化培養和生根培養，獲得轉基因植株。所述的小麥成熟胚培養基是以MS基本培養基為基礎，其中含有MS基本培養基的大量元素、MS基本培養基的微量元素、MS基本培養基的鐵鹽、MS基本培養基的有機成份， 在其中添加2，4-D、細胞分裂素KT、天門冬酰胺、水解酪蛋白、玉米素ZT、6-BA、乙酰丁香酮 AS、羧芐青霉素cb、潮霉素hpt、蔗糖或瓊脂，制成誘導培養基、侵染培養基、共培養基、除菌培養基、預分化培養基、分化培養基和生根培養基。所述的誘導培養基中，2，4-D濃度為ang/L，細胞分裂素KT濃度為0.5mg/L，天門冬酰胺濃度為150mg/L，水解酪蛋白的濃度為500mg/L，蔗糖濃度為30g/L，瓊脂的濃度為7g/ L ； 所述侵染培養基中，2，4-D濃度為ang/L，細胞分裂素KT濃度為0. 5mg/L,天門冬酰胺濃度為150mg/L，水解酪蛋白的濃度為500mg/L，乙酰丁香酮AS的濃度為200ymol/L，蔗糖濃度為30g/L。所述共培養基中，2，4-D濃度為ang/L，細胞分裂素KT濃度為0. 5mg/L,天門冬酰胺濃度為150mg/L，水解酪蛋白的濃度為500mg/L，乙酰丁香酮AS的濃度為200 μ mol/L ；蔗糖濃度為30g/L ；瓊脂的濃度為7g/L。所述的除菌培養基中，2，4-D濃度為ang/L，細胞分裂素KT濃度為0. 5mg/L,天門冬酰胺濃度為150mg/L，水解酪蛋白的濃度為500mg/L，羧芐青霉素cb濃度為500mg/L，蔗糖濃度為30g/L ；瓊脂的濃度為7g/L。所述的預分化培養基中，6-BA濃度為0. 5mg/L、水解酪蛋白的濃度為500mg/L，羧芐青霉素cb濃度為500mg/L，潮霉素hpt濃度為5mg/L，蔗糖濃度為30g/L ；瓊脂的濃度為 7g/L ；所述分化培養基中，玉米素ZT濃度為ang/L，細胞分裂素KT濃度為0. 5mg/L,羧芐青霉素cb濃度為500mg/L，潮霉素hpt濃度為10mg/L，蔗糖濃度為30g/L，瓊脂的濃度為7g/ L；所述生根培養基中，采用1/2MS基本培養基，羧芐青霉素cb濃度為500mg/L，蔗糖濃度為15g/L，瓊脂的濃度為7g/L。所述愈傷組織誘導方法為將當年收獲的成熟小麥種子用0. 1 % HgCl2消毒處理20min，用蒸餾水清洗3_4次， 小麥種子在消毒后于25°C條件下用蒸餾水浸泡12-15小時，將浸泡后的小麥種子于超凈工作臺用75%的乙醇浸泡3min，用無菌水沖洗2-3次，再用0. 1 % HgCl2消毒15min，無菌水沖洗4-5次，在超凈工作臺中剝離完整的胚，用解剖刀切去胚根，盾片向上，接種于接種誘導培養基中，在M-25°C黑暗條件下誘導培養愈傷組織7天培養。
5
所述根癌農桿菌侵染方法為將接種于誘導培養基中的小麥成熟胚愈傷組織轉入到滅過菌的培養皿里，將準備好的農桿菌倒入愈傷組織中侵染20min，將浸染后的愈傷組織放到滅過菌的濾紙上15min， 吸干菌液后的愈傷組織接種于放有一層濾紙的共培養基上，25°C黑暗條件共培養3天。所述除菌培養方法為將共培養后的愈傷組織，按照培養后愈傷組織的情況進行分類，轉接到除菌培養基上，25°C光照條件下培養1星期；所述預分化篩選培養方法為將除菌培養后的愈傷組織轉接到預分化篩選培養基上，25°C光照條件下培養2星期。所述分化培養方法為將預分化培養后的愈傷組織轉接到分化培養基上，25°C光照條件下培養6星期， 每兩周繼代一次。所述生根培養方法為將分化后的愈傷組織轉接到生根培養基上，25°C光照條件下培養3星期。采用本發明的方法，經測定，可以穩定得到目標基因的轉基因小麥植株。


圖1是春小麥(張春19號)的實施部分圖片，其中圖I-A表示誘導的春小麥愈傷組織生長情況；圖I-B表示愈傷組織與農桿菌共培養情況；圖I-C和圖I-D表示潮霉素篩選后的愈傷組織分化效果；圖I-E和圖I-F表示篩選后的小麥植株生長情況；圖2為春小麥(張春19號)Ttl代轉基因植株的潮霉素基因PCR檢測電泳圖。以下結合發明人給出的實施例對本發明作進一步的詳細說明，需要說明的是，本發明不限于這些實施例。
具體實施例方式在以下的實施例中，所述的小麥成熟胚培養基以目前使用最普遍的MS基本培養基為基礎，MS基本培養基具有較高的無機鹽濃度，能夠保證組織生長所需的礦質營養還能加速愈傷組織的生長。由于配方中的離子濃度高，在配制、貯存和消毒等過程中，即使有些成分略有出入，也不會影響離子間的平衡。MS固體培養基可用于誘導愈傷組織，也可用于胚、莖段、莖尖及花藥的培養，其液體培養基用于細胞懸浮培養時能獲得明顯的成功。本發明在MS基本培養基中添加2，4-D、細胞分裂素KT、天門冬酰胺、水解酪蛋白、玉米素ZT、 6-BA、乙酰丁香酮AS、羧芐青霉素cb、潮霉素hpt、蔗糖或瓊脂，分別制成誘導培養基、侵染培養基、共培養基、除菌培養基、預分化培養基、分化培養基和生根培養基。下述實施例中所涉及的農桿菌EHA105是本領域公知的，實驗方法如無特殊說明均為常規方法。實施例1 農桿菌EHA105轉化春小麥(張春19號)成熟胚愈傷組織一、培養基的配制和滅菌1、誘導培養基MS+2mg/L 的 2，4_D+0. 5mg/L 的細胞分裂素 KT+500mg/L 的水解酪蛋白 +150mg/L 的天門冬酰胺+3%的蔗糖+0. 7%的瓊脂；配制過程10XMS 大量 100ml、1000XMS 微量 lml、200 XMS 鐵鹽 5ml、100 XMS 有機5ml，加入天門冬酰胺150mg、水解蛋白500mg、蔗糖30g、2，4_D ang、細胞分裂素KTO. 5mg、 瓊脂7g，加入500ml蒸餾水煮沸，定容至1000ml，然后調節pH至6. 0，以上成分采用121 °C， 高壓濕熱滅菌20分鐘，放置2-3天后可以接胚。2、侵染培養基MS+2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L細胞分裂素KT+500mg/L水解酪蛋白 +150mg/L天門冬酰胺+3%葡萄糖+200 μ mol/L乙酰丁香酮AS配制過程10XMS 大量 IOOml、1000 XMS 微量 Iml、200 XMS 鐵鹽 5ml、100 XMS 有機 5ml，加入天門冬酰胺150mg、水解蛋白500mg、葡萄糖30g、2，4_D ang、細胞分裂素KTO. 5mg, 加入500ml蒸餾水煮沸，定容至1000ml，然后調節pH至5. 5，以上成分采用121 °C，高壓濕熱滅菌20分鐘，乙酰丁香酮AS過濾滅菌后加入到上述高壓滅菌后的培養基中。3、共培養基MS+2mg/L 2,4-D+O. 5mg/L細胞分裂素KT+500mg/L水解酪蛋白 +150mg/L天門冬酰胺+3%蔗糖+0. 7%瓊脂+200 μ mol/L乙酰丁香酮AS配制過程10XMS 大量 IOOml、1000 XMS 微量 Iml、200 XMS 鐵鹽 5ml、100 XMS 有機 5ml，加入天門冬酰胺150mg、水解蛋白500mg、葡萄糖30g、瓊脂7g、2，4_D ang、細胞分裂素 ΚΤ0. 5mg，加入500ml蒸餾水煮沸，定容至1000ml，然后調節pH至5. 5，以上成分采用121 °C， 高壓濕熱滅菌20分鐘，乙酰丁香酮AS過濾滅菌后加入到上述高壓滅菌后的培養基中。4、除菌培養基MS+2mg/L2,4-D+0. 5mg/L 細胞分裂素 KT+500mg/L 水解酪蛋白 +150mg/L 天門冬酰胺+3%蔗糖+0. 7%瓊脂+500mg/L羧芐青霉素cb配制過程10XMS 大量 IOOml、1000 XMS 微量 Iml、200 XMS 鐵鹽 5ml、100 XMS 有機 5ml，加入天門冬酰胺150mg、水解蛋白500mg、葡萄糖30g、瓊脂7g、2，4_D ang、細胞分裂素 ΚΤ0. 5mg，加入500ml蒸餾水煮沸，定容至1000ml，然后調節pH至6. 0，以上成分采用121 °C，
高壓濕熱滅菌20分鐘，羧芐青霉素cb加入到上述高壓滅菌后的培養基中。5、預分化培養
基MS+0. 5mg/L 6_BA+500mg/L 水解酪蛋白 +3%蔗糖 +0. 7%瓊脂 +500mg/L 羧芐青霉素cb+5mg/L潮霉素hpt配制過程10XMS 大量 100ml、1000XMS 微量 lml、200 XMS 鐵鹽 5ml、100 XMS 有機5ml，加入天門冬酰胺150mg、水解蛋白500mg、蔗糖30g、瓊脂7g、6_BA0. 5mg，加入500ml 蒸餾水煮沸，定容至1000ml，然后調節pH至6. 0，以上成分采用121，高壓濕熱滅菌20°C分鐘，潮霉素hpt、羧芐青霉素cb加入到上述高壓滅菌后的培養基中。6、分化培養基MS+2mg/L玉米素ZT+0. 5mg/L細胞分裂素KT+3%蔗糖+0. 7%瓊脂+500mg/L羧芐青霉素cb+10mg/L潮霉素hpt配制過程10XMS大量 100ml、1000XMS 微量 lml、200XMS 鐵鹽 5ml、100XMS 有機5ml，加入天門冬酰胺150mg、水解蛋白500mg、蔗糖30g、瓊脂7g、2，4_D ang、細胞分裂素 ΚΤ0. 5mg，加入500ml蒸餾水煮沸，定容至1000ml，然后調節pH至6. 0，以上成分采用121 °C， 高壓濕熱滅菌20分鐘，潮霉素hpt、羧芐青霉素cb加入到上述高壓滅菌后的培養基中。7、生根培養基
7
1/2MS+1. 5% /L 蔗糖 +0. 7% 瓊脂 +500mg/L 羧芐青霉素 cb配制過程10XMS 大量 50ml、1000 XMS 微量 0. 5ml、200 XMS 鐵鹽 2. 5ml、100 XMS 有機2. 5ml、蔗糖15g、瓊脂7g、加入500ml蒸餾水煮沸，定容至1000ml，然后調節pH至6. 0， 以上成分采用121°C，高壓濕熱滅菌20分鐘，羧芐青霉素cb加入到上述高壓滅菌后的培養基中。二、實驗過程1、愈傷組織誘導將當年收獲的春小麥(張春19號)成熟小麥種子用0. 1% HgCl2 消毒處理20min，用蒸餾水清洗3-4次，小麥種子在消毒后于25°C條件下用蒸餾水浸泡 12-15小時，將浸泡后的小麥種子于超凈工作臺用75%的乙醇浸泡;3min，用無菌水沖洗2-3 次，再用0. 1% HgCl2消毒15min，無菌水沖洗4_5次，在超凈工作臺中剝離完整的胚，用解剖刀切去胚根，盾片向上，接種于培養基誘導培養基中，在M_25°C黑暗條件下誘導培養愈傷組織7天。2、根癌農桿菌侵染①農桿菌EHA105的培養挑取含有Pcambia1305質粒農桿菌單菌落，接種于5mL 的LB液體培養基，加卡納霉素50mg/L，利富平50mg/L，28°C、180r搖菌培養36 40h，0D600 值約為0.6 0.8，按1 50的比例于侵染液，28°C、180r搖菌擴大培養至0D600值0.6。②將小麥成熟胚愈傷組織轉入到滅過菌的培養皿里，將準備好的農桿菌(0D = 0. 6)倒入愈傷組織中侵染20min、將浸染后的愈傷組織放到滅過菌的濾紙上15min吸干菌液，吸干菌液后的愈傷組織接種于放有一層濾紙的的共培養基上，用報紙包裹，25°C黑暗條件共培養3天。3、除菌培養將共培養后的愈傷組織，按照培養后愈傷組織的情況進行分類(長菌少的為一類，長菌多的為一類)，轉接到除菌培養基上，25°C光照條件下培養1星期。4、預分化篩選培養將除菌培養后的愈傷組織轉接到預分化篩選培養基上，25°C 光照條件下培養2星期。5.分化培養將預分化培養后的愈傷組織轉接到預分化篩選培養基上，25°C光照條件下培養6星期，每兩周繼代一次。6.生根培養將分化后的愈傷組織轉接到生根培養基上，25°C光照條件下培養3星期。三、轉基因植株分子檢測提取抗性再生植株葉片基因組DNA，以其為模板，以hpt引物擴增潮霉素基因，其中上游引物5‘ -GGACGCAACGCCTACGACTGGAC-3 ‘；下游引物5‘ -TCATCGCAAGACCGGCAACAGGA-3 ‘。PCR反應條件為先94°C預變性5min，然后94°C變性30sec，56°C復性30sec，72°C 延伸lmin，共計35個循環，最后再72°C延伸lOmin。PCR擴增產物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測情況如圖2所示。表明成功獲得了轉基因植株。
權利要求
1.一種根癌農桿菌介導普通春性小麥成熟胚轉化體系的方法，其特征在于，在進行目的基因轉化時，選用再生能力較強的春性小麥品種成熟胚愈傷組織為材料，接種于小麥成熟胚培養基，然后用帶有目的基因的農桿菌菌株EHA105侵染成熟胚愈傷組織，愈傷組織經潮霉素篩選后得到抗性愈傷組織，經過愈傷組織誘導、根癌農桿菌侵染、除菌培養、預分化篩選培養、分化培養和生根培養，獲得轉基因植株。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述的小麥成熟胚培養基是是MS基本培養基為基礎，在MS基本培養基中添加2，4-D、細胞分裂素KT、天門冬酰胺、水解酪蛋白、玉米素 ZT、6-BA、乙酰丁香酮AS、羧芐青霉素cb、潮霉素hpt、蔗糖或瓊脂，分別制成誘導培養基、侵染培養基、共培養基、除菌培養基、預分化培養基、分化培養基和生根培養基。
3.如權利要求2所述方法，其特征在于，所述的誘導培養基中，2，4-D濃度為ang/L，細胞分裂素KT濃度為0. 5mg/L,天門冬酰胺濃度為150mg/L，水解酪蛋白的濃度為500mg/L，蔗糖濃度為30g/L，瓊脂的濃度為7g/L ；所述侵染培養基中，2，4-D濃度為ang/L，細胞分裂素KT濃度為0. 5mg/L,天門冬酰胺濃度為150mg/L，水解酪蛋白的濃度為500mg/L，乙酰丁香酮AS的濃度為200 μ mol/L，蔗糖濃度為30g/L ；所述共培養基中，2，4-D濃度為ang/L，細胞分裂素KT濃度為0. 5mg/L,天門冬酰胺濃度為150mg/L，水解酪蛋白的濃度為500mg/L，乙酰丁香酮AS的濃度為200 μ mol/L ；蔗糖濃度為30g/L ；瓊脂的濃度為7g/L ；所述的除菌培養基中，2，4-D濃度為ang/L，細胞分裂素KT濃度為0. 5mg/L，天門冬酰胺濃度為150mg/L，水解酪蛋白的濃度為500mg/L，羧芐青霉素cb濃度為500mg/L，蔗糖濃度為 30g/L ；瓊脂的濃度為7g/L ；所述的預分化培養基中，6-BA濃度為0. 5mg/L、水解酪蛋白的濃度為500mg/L，羧芐青霉素cb濃度為500mg/L，潮霉素hpt濃度為5mg/L，蔗糖濃度為30g/L ；瓊脂的濃度為7g/L ； 所述分化培養基中，玉米素ZT濃度為ang/L，細胞分裂素KT濃度為0. 5mg/L,羧芐青霉素cb濃度為500mg/L，潮霉素hpt濃度為10mg/L，蔗糖濃度為30g/L，瓊脂的濃度為7g/L ； 所述生根培養基采用1/2MS基本培養基,加入羧芐青霉素cb、蔗糖和瓊脂,其中，羧辛青霉素cb濃度為500mg/L，蔗糖濃度為15g/L，瓊脂的濃度為7g/L。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于 所述愈傷組織誘導方法為將當年收獲的成熟小麥種子用0. 1% HgCl2消毒處理20min，用蒸餾水清洗3_4次，小麥種子在消毒后于25°C條件下用蒸餾水浸泡12-15小時，將浸泡后的小麥種子于超凈工作臺用75%的乙醇浸泡3min，用無菌水沖洗2_3次，再用0. 1 % HgCl2消毒15min，無菌水沖洗4-5次，在超凈工作臺中剝離完整的胚，用解剖刀切去胚根，盾片向上，接種于誘導培養基中，在M-25°C黑暗條件下誘導培養愈傷組織7天培養； 所述根癌農桿菌侵染方法為將接種于誘導培養基中的小麥成熟胚愈傷組織轉入到滅過菌的培養皿里，將準備好的農桿菌倒入愈傷組織中侵染20min，將浸染后的愈傷組織放到滅過菌的濾紙上15min，吸干菌液后的愈傷組織接種于放有一層濾紙的共培養基上，25°C黑暗條件共培養3天； 所述除菌培養方法為將共培養后的愈傷組織，按照培養后愈傷組織的情況進行分類，轉接到除菌培養基上， 25°C光照條件下培養1星期； 所述預分化篩選培養方法為將除菌培養后的愈傷組織轉接到預分化篩選培養基上，25°C光照條件下培養2星期； 所述分化培養方法為將預分化培養后的愈傷組織轉接到分化培養基上，25°C光照條件下培養6星期，每兩周繼代一次；所述生根培養方法為將分化后的愈傷組織轉接到生根培養基上，25°C光照條件下培養3星期。
全文摘要
本發明公開了一種根癌農桿菌介導普通春性小麥成熟胚轉化體系的方法。該方法在利用根癌農桿菌進行轉基因小麥研究時，選用篩選出的具有再生能力較強的小麥品種為材料，取當年成熟種子籽粒，經種子滅菌，在超凈工作臺中剝取成熟胚，盾片向上，接種于成熟胚誘導愈傷培養基上。以農桿菌菌株EHA105，菌液濃度OD600值為0.6，感染預培養6-7天的小麥成熟胚愈傷組織，經共培養，除菌，恢復培養和分化成苗，將農桿菌中的目標基因導入普通春性小麥。用本發明的方法，經測定，可以穩定得到目標基因的轉基因小麥植株。
文檔編號A01H4/00GK102559744SQ20111045478
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者劉迎團, 宋成麗, 徐虹, 王軍衛 申請人:西北農林科技大學