專利名稱：一種短小芽孢桿菌、益生菌制劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物領域，具體涉及一種具高酶活性和抑弧菌活性的短小芽孢桿菌，及利用其作為活性成份的益生菌制劑及其制備方法和應用。
背景技術：
隨著規模化、集約化水產養殖業的迅速發展，水產養殖病害頻繁發生，為了控制疾病，一些抗生素藥物在水產養殖中被廣泛使用和濫用，不僅造成環境中藥物殘留、細菌耐藥性增加，而且由于水體環境的流動性，耐藥基因更容易水平轉移，造成更多耐藥株的出現。 為了應對耐藥性，養殖中不得不加大用量并不斷更換藥物種類，進而造成惡性循環。另一方面藥物的大量使用，藥物在水產動物體內殘留造成的食品安全問題也日益引起關注。為了應對這些問題，采用替代的生物防治措施成為當前水產養殖的熱點，其中益生菌的應用在水產養殖中越來越受到重視，它們不僅具有抑制細菌性病原的作用，還具有促進水產養殖動物生長、改善免疫等作用。市場上水產用益生菌產品，名目繁多，層出無窮，但是概括起來存在以下問題(1) 絕大多數產品的益生菌直接來源于人類和陸生動物的益生菌種類。這些陸源益生菌是否能長期存活于水體環境或水生動物的腸道則幾乎無相關的報道。Panigrahi等(2004)則直接認為那些借鑒畜禽思路所研制的水產益生菌存在難定植的不足，不能在水產動物消化道內存留并大量繁殖。(2)水產益生菌產品以水質調節劑為主，飼用添加劑為次要。一些益生菌產品標示其既可作水質調節劑也可作為飼用添加劑，顯然違背了微生物生長環境存在差異的規律。(3)作為飼用添加劑的益生菌產品以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌為常見，少見其它類型的芽孢桿菌，而上述三種芽孢桿菌并非海洋環境的常見菌群。(4)水產益生菌產品中菌株的酶活效果不明確、抑菌效果不明確，而這二項指標是評價飼用益生菌的效果的核心指標。以當前水產益生菌使用最多的芽孢桿菌為例，目前已經報道的芽孢桿菌抗菌素有169種，這些抗菌素主要是肽類，多作用于革蘭氏陽性細菌。人和陸生動物的腸道主要病原菌是革蘭氏陽性細菌，因此對于人和陸生動物而言，芽孢桿菌是比較合適的益生菌。但是對于海洋水產動物而言，主要的病原菌是革蘭氏陰性菌，如弧菌。芽孢桿菌對于這些來自水產動物的革蘭氏陰性菌的抑制效果還少見報道。因此不可照搬挪用，需要針對水產動物的特點篩選對弧菌等革蘭氏陰性菌有抑制效果的芽孢桿菌等。結合上述問題， 我們迫切需要從水產動物生長的土著環境和腸道中分離益生菌株，并且以酶活性和抑菌活性作為篩選和評價效果的主要指標。

發明內容
本發明的第一個目的是提供一種分離自健康凡納濱對蝦腸壁粘膜且具有高酶活性和抑弧菌活性的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149，該菌于2011年11月23日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號CCTCC NO :M2011411。本發明所述的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LV149分離自健康凡納濱對奸腸壁粘膜。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149的生物學特征如下I、菌落形態和細胞形態特征菌株在LB瓊脂培養基和2216E培養基上的菌落形態為乳白色、扁平、表面較濕、不透明、褶皺、邊緣不整齊，培養24小時菌落直徑2-4_。桿狀， 芽孢橢圓形，中性或偏端生。2、生理生化特征菌株生長適宜鹽度范圍5_35%。，7%以上NaCl不生長，生長適宜pH范圍為5-9。革蘭氏陽性，接觸酶(_)，氧化酶(+)，V-P試驗(_)，硝酸鹽還原(_)，淀粉水解 (+)，明膠液化(+)，能發酵D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-葡萄糖，發酵葡萄糖不產氣，苯丙氨酸脫氨酶(_)，檸檬酸鹽利用(+)，卵磷脂酶(_)，吲哚試驗(_)，酪素水解(+)，酪氨酸水解(_)。常規方法提取短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149基因組DNA并做16S rRNA 基因序列測定，其序列如SEQ ID NO. I所示。經BLAST比對，其與公布的多株短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus)的16S rRNA基因一致度100%，與其它芽孢桿菌一致度為99%以下。 因此，分子鑒定該細菌為短小芽孢桿菌。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第九版)所列的方法對細菌進行常規的生理和生化鑒定。其與標準株的相似度為100%，屬短小芽孢桿菌，此結果與分子鑒定的結果一致。因此該菌屬于短小芽孢桿菌，命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149，該菌于2011年11月23日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號CCTCC NO :M2011411。對短小芽孢桿菌LV149和LV479進行了隨機擴增多態性 DNA(RAPD)擴增，以檢測二者指紋圖譜的差別。由圖2可見，采用的7條隨機引物均能給出二株短小芽孢桿菌的指紋圖譜，并且每條引物均能顯示出二者明顯的差別，這個結果表明短小芽孢桿菌LV149和短小芽孢桿菌LV479雖然屬同一個種，但是遺傳差異較大，導致其有不同的表型特征。經實驗發現,本發明的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149能同時產生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，并且這三種酶具有高的活性。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LV149對哈氏弧菌E385、副溶血弧菌E154、副溶血弧菌E347、副溶血弧菌E346、輪蟲弧菌 E231、哈氏弧菌E379、哈氏弧菌E345、弗尼斯弧菌E341、創傷弧菌11758、溶藻弧菌E333、溶藻弧菌A056和溶藻弧菌E066等弧菌具有廣泛的抑制性，且不具有溶血活性。進一步的將短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149進行固態發酵，干燥粉碎制備得到含短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149的短小芽孢桿菌益生菌制劑,用其添加到飼料中飼喂凡納濱對蝦，結果發現隨著養殖周期增長，投喂添加了短小芽孢桿菌益生菌制劑的飼料的實驗組與不添加益生菌制劑的對照組相比，體重增加逐漸明顯，肝體指數降低逐漸明顯。至實驗結束時，實驗組對蝦的平均體重與對照組相比差異明顯，增加了 11. 7% ;實驗組對蝦的肝體指數與對照組相比差異明顯，降低了 10. 2%;計算后餌料系數降低了 12. 1%。由此說明，在對蝦的養殖中使用短小芽孢桿菌益生菌制劑可以明顯地降低餌料系數，促進對蝦生長，從而縮短養殖周期，減少養殖成本和風險。短小芽孢桿菌益生菌制劑的使用也明顯改善了對蝦的商品品質，增加了出肉率。此外，這個結果結合溶血實驗也表明短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LV149具有生物安全性。本發明將對蝦分為實驗組和對照組，實驗組對蝦投喂添加有短小芽孢桿菌益生菌制劑的商品對蝦飼料，對照組則只投喂商品對蝦飼料。將對蝦在含哈氏弧菌的水中浸泡24小時后，正常換水、投喂，觀察對蝦的攝食表現并統計死亡率，結果表明采用添加有短小芽孢桿菌益生菌制劑的飼料喂養對蝦5天，對蝦即表現出對哈氏弧菌具有一定的抵抗力，死亡率低于對照組；投喂10天、15天后，對蝦死亡率明顯低于對照組，投喂20天后，實驗組的對蝦的死亡率只有5%，由此表明在養殖應用中，短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus) LV149可以抑制哈氏弧菌，堅持使用短小芽孢桿菌益生菌制劑10天以上，可以大大降低對蝦弧菌病的患病率，長期使用基本可以杜絕弧菌病的發生。因此，本發明的第二個目的是提供短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149在制備抑制弧菌微生態制劑中的應用。所述的弧菌病原為哈氏弧菌E385、副溶血弧菌E154、副溶血弧菌E347、副溶血弧菌E346、輪蟲弧菌E231、哈氏弧菌E379、哈氏弧菌E345、弗尼斯弧菌E341、創傷弧菌11758、 溶藻弧菌E333、溶藻弧菌A056和溶藻弧菌E066。本發明的第三個目的是提供一種短小芽孢桿菌益生菌制劑，其特征在于，以短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149作為活性成份。本發明的第四個目的是提供一種短小芽孢桿菌益生菌制劑的制備方法，其特征在于，以短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149作為發酵菌株，經固態發酵，烘干粉碎后而制得。所述的短小芽孢桿菌益生菌制劑的制備方法，其優選具體步驟為將短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) LV149接種到LB培養基中培養制成種子培養液，再以5% 10%的接種量接種到固態發酵培養基中，發酵時間為20 48小時，發酵溫度為30°C，發酵物于烘箱中50°C烘干，烘干物粉碎過60目篩，即為短小芽孢桿菌益生菌制劑，所述的固態發酵培養基由料和水組成，所述的料按總質量分數100%計，包括米糠5 20%、麩皮10 30%、 豆柏20 40%、玉米粉20 40%、脫脂奶粉I 5%、蔗糖I 5%、酵母提取物0. I 2%,NaCl 0. I 1%和飼用多礦0. I 0.5% (廣州國信飼料科技有限公司，產品名稱為 江豐多礦，貨號為JC1000)，料水比為I : I I. 3。本發明的第五個目的是提供短小芽孢桿菌益生菌制劑作為飼料添加劑的應用。將本發明的短小芽孢桿菌益生菌制劑與對蝦成品飼料按重量比0. I 1%的比例混合均勻， 吸附10 60分鐘，即可投喂對蝦，不僅可以抑制對蝦腸道病原弧菌生長、減少對蝦弧菌病的發生，同時促進對蝦生長、降低餌料系數、提高商品品質、縮短養殖周期，從而減少養殖風險、降低養殖成本，且生物安全性高。所述的飼料優選為對蝦飼料，進一步優選短小芽孢桿菌益生菌制劑按對蝦飼料重量的0. I 1%添加。綜上所述,本發明的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149對弧菌具有廣泛的抑制性，且不具有溶血活性。以此菌作為發酵菌株，經固態發酵、干燥粉碎制得以短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149作為活性成分的短小芽孢桿菌益生菌制劑，將其添加到對蝦飼料中，飼喂對蝦，不僅可以起到抑制對蝦腸道病原弧菌生長、減少對蝦弧菌病的發生， 同時促進對蝦生長、降低餌料系數、提高商品品質、縮短養殖周期，從而減少養殖風險、降低養殖成本，且生物安全性高，在水產養殖中具有廣泛的應用前景。本發明的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149于2011年11月23日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCC NO:M2011411。


圖I是短小芽孢桿菌LV149三種酶活性檢測圖，其中I :淀粉酶活性；2 :脂肪酶活性；3 :蛋白酶活性；圖2是短小芽孢桿菌LV149與短小芽孢桿菌LV479的RAPD分子指紋圖譜比較。其中1，3，5，7，9，11，13分別為上海生工隨機引物39，S10, Sll, S12，S13，S14，S15對短小芽孢桿菌LV149的RAH)擴增結果；2，4，6，8，10，12，14分別為上海生工隨機引物59，510，511， S12，S13，S14，S15 對短小芽孢桿菌 LV479 的 RAI3D 擴增結果;M，DNA 分子 Marker DL 15000 ；圖3是短小芽孢桿菌抑弧菌活性典型檢測圖。其中(I):短小芽孢桿菌LV448(指示菌)；(2):短小芽孢桿菌LV149 ;圖4是短小芽孢桿菌LV149與對照細菌溶藻弧菌A056的溶血性檢測圖，其中(I) 短小芽孢桿菌LV149 ； (2):溶藻弧菌A056 (指示菌)。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。所用方法及技術， 如無特別說明，均為常規方法和技術。實施例I :短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149的篩選與分離(I)腸道粘附細菌分離分別于不同時間和不同市場購得健康凡納濱對蝦5批，每批30尾，從中挑取個體大、體色亮、光滑、無損傷、肝臟褐色的個體5尾，平均體長12cm。用體積分數75%的酒精消毒對蝦體表，再用無菌海水沖洗，解剖后取其腸道于無菌錫箔紙上，用注射器吸取滅菌海水，迅速沖洗掉腸道內的糞便，每條腸道沖洗2-3次，以肉眼觀察腸道內不殘留內容物為止。于無菌勻漿器中加無菌生理鹽水將腸道勻漿。取0.5mL勻漿液用無菌生理鹽水(1% NaCl)按10倍系列稀釋即為腸道粘附細菌懸液。將腸道粘附細菌懸液涂布對蝦飼料培養基。對蝦飼料培養基成分按總質量分數 100%計，包括對蝦飼料打碎粉(過100目篩)10%，NaCl 1%，瓊脂2%，其余為水，然后再滅菌倒平板。30°C培養24 48小時后，挑取菌落，進一步在LB培養基進行劃線分離和純化。總計獲得對蝦腸道粘附細菌500株。(2)三種酶活性腸道粘附細菌篩選按常規方法檢測腸道粘附細菌的蛋白酶活性、脂肪酶活性、淀粉酶活性。結果發現 500株細菌中能同時產生三種胞外酶的菌株共有90株。(3)高酶活性腸道粘附細菌中篩選抑菌活性株采用平板濾紙片擴散法對上述獲得的高酶活性腸道粘附細菌進行篩選，目的是獲得具有抑制水產動物病原弧菌能力且高酶活性的菌株。所用培養基為LB培養基，指示菌為溶藻弧菌A056、哈氏弧菌E385、副溶血弧菌E154。受試菌與指示菌均事先用LB培養基過夜培養。將指示菌液采用滅菌1% NaCl適當稀釋后涂布LB平板，LB平板上帖濾紙片，直徑 5mm，每個濾紙片滴加受試菌液20ii L，30°C培養12-24小時，觀察抑菌圈的出現，并測量抑菌圈的直徑。結果表明90株具有高酶活性腸道粘附細菌中只有一株細菌LV149同時對三種弧菌具有抑制作用。(4)高酶活性腸道粘附細菌分子鑒定和生化鑒定從90株具酶活性的細菌中挑選生長較快、易于培養的69株細菌進行了基于 16S rRNA 基因的分子鑒定。PCR 擴增引物27F :5' -AGAGTT TGATC(C/A) TGG CTCAG-3'； 1492R:5' -TACGG(C/T)TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。陽性擴增片段直接遞交 Invitrogen 公司純化、測序。結果表明它們分別屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬 (Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、利斯頓氏菌屬(Listonella)和莫拉氏菌屬(Moraxella)。其中數量最多是芽胞桿菌屬，占鑒定細菌總數的53. 62%。細菌LV149的16S rRNA基因序列，其序列如SEQ ID NO. I所示。經BLAST比對， 其與公布的多株短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)的16S rRNA基因一致度100%，與其它芽孢桿菌一致度為99%以下。因此，分子鑒定該細菌為短小芽孢桿菌。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第九版)所列的方法對細菌進行常規的生理和生化鑒定。其與標準株的相似度為100%，屬短小芽孢桿菌，此結果與分子鑒定的結果一致。因此該菌屬于短小芽孢桿菌， 命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149，于2011年11月23日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號=CCTCC NO :M2011411。盡管69株高酶活性腸道粘附細菌中有芽孢桿菌占多數，其中包括其它短小芽孢桿菌株，但只有一株短小芽孢桿菌LV149對三種弧菌有明顯抑制作用。這表明在對腸道中， 具有高酶活性且具有抑制弧菌的芽孢桿菌株出現的比率非常低。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149的三種胞外酶均具有高的活性,三種酶活檢測圖見圖I。(5)短小芽孢桿菌LV149的分子指紋圖譜特征采用上海生工的隨機擴增多態性DNA(RAPD)隨機引物S9-S15分別對短小芽孢桿菌LV149和LV479進行了 RAPD擴增，以檢測二者指紋圖譜的差別。RAPD擴增程序93°C預變性 2min ；93°C lmin,36°C lmin,72°C 7min，共進行 35 個循環；最后 72°C延伸 7min。RAPD 產物以0. 8 %的瓊脂糖電泳30min，紫外成像，結果見圖2。由圖2可見，采用的7條隨機引物均能給出二株短小芽孢桿菌的指紋圖譜，并且每條引物均能顯示出二者明顯的差別，這個結果表明LV149和LV479雖然屬同一個種，但是遺傳差異較大，導致其有不同的表型特征。 短小芽孢桿菌的RAPD指紋圖譜可用于區分同種類的不同株，因此一定程度上可以防偽，并防止非法的產品剽竊。實施例2 :短小芽孢桿菌LV149的抑制弧菌譜分析及溶血性分析采用來自9個不同種的13株弧菌對短小芽孢桿菌LV149的抑制弧菌譜進行了分析。同樣采用上述的平板濾紙片擴散法。根據抑菌圈的大小判定抑菌能力的強弱，抑菌譜分析結果見表I :表I :短小芽孢桿菌LV149的抑制弧菌活性分析
權利要求
1.短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)LV149，保藏編號CCTCC NO M2011411o
2.權利要求I所述的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) LV149在制備抑制弧菌微生態制劑中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的弧菌為哈氏弧菌E385、副溶血弧菌 E154、副溶血弧菌E347、副溶血弧菌E346、輪蟲弧菌E231、哈氏弧菌E379、哈氏弧菌E345、弗尼斯弧菌E341、創傷弧菌11758、溶藻弧菌E333、溶藻弧菌A056或溶藻弧菌E066。
4.一種短小芽孢桿菌益生菌制劑，其特征在于，以權利要求I所述的短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus)LV149 作為活性成份。
5.一種權利要求4所述的短小芽孢桿菌益生菌制劑的制備方法，其特征在于，以短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149作為發酵菌株，經固態發酵，烘干粉碎后而制得。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，具體步驟為將短小芽孢桿菌 (Bacillus pumilus)LV149接種到LB培養基中培養制成種子培養液，再以5% 10%的接種量接種到固態發酵培養基中，發酵時間為20 48小時，發酵溫度為30°C，發酵物于烘箱中50°C烘干，烘干物粉碎過60目篩，即為短小芽孢桿菌益生菌制劑，所述的固態發酵培養基由料和水組成，所述的料按總質量分數100%計，包括米糠5 20%、麩皮10 30%、豆柏20 40%、玉米粉20 40%、脫脂奶粉I 5%、蔗糖I 5%、酵母提取物O. I 2%、 NaCl O. I 1%和飼用多礦O. I O. 5%，料水比為I : I L 3。
7.權利要求4所述的短小芽孢桿菌益生菌制劑作為飼料添加劑應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的飼料為對蝦飼料。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，短小芽孢桿菌益生菌制劑按對蝦飼料重量的O. I 1%添加。
全文摘要
本發明公開了一種短小芽孢桿菌、益生菌制劑及其制備方法和應用。短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149于2011年11月23日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號CCTCC NOM2011411。本發明的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149具有強的胞外蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，對弧菌具有廣泛的抑制性，且不具有溶血活性。以此菌作為發酵菌株，經固態發酵、干燥粉碎制得以短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LV149作為活性成分的短小芽孢桿菌益生菌制劑，將其添加到對蝦飼料中，飼喂對蝦，不僅可以起到抑制對蝦腸道病原弧菌生長、減少對蝦弧菌病的發生，同時促進對蝦生長、降低餌料系數、提高商品品質、縮短養殖周期，從而減少養殖風險、降低養殖成本，且生物安全性高，在水產養殖中具有廣泛的應用前景。
文檔編號A23K1/16GK102586144SQ20121002920
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月9日 優先權日2012年2月9日
發明者任春華, 江海英, 王艷紅, 羅鵬, 胡超群 申請人:中國科學院南海海洋研究所