專利名稱：水稻缺氮后恢復供氮特異性誘導表達的啟動子y2及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程技術領域。具體涉及一種水稻缺氮后恢復供氮特異性誘導表達的啟動子Y2及應用
背景技術：
目前轉基因研究主要以組成型啟動子驅動目的基因表達，最典型的是花椰菜花葉病毒中分離的 CaMV35S 啟動子(Hirt et al.，1990 ；Battraw et al.，1990)，以及近年來一些植物來源的啟動子，如從水稻中克隆的肌動蛋白基因Actinl的啟動子和玉米中克隆的泛素基因ubiquitin啟動子(Schledzewski et al., 1994)。但是外源基因的組成型表達往往會造成資源的非必要浪費，同時大量異源蛋白的積累也會打破植物原有的代謝平衡，阻礙植物的正常生長(聶麗娜等，2008 ；Rai et al.,2009)。Kasuga等(1999)在研究中發現，使用強的組成型表達啟動子CaMV35S啟動DREBlA的表達時，對植物的生長可能起到某種程度的阻礙作用， 而用誘導型的啟動子可以減輕這種狀況。誘導型的啟動子可以快速有效地誘導轉錄基因的“開、關”:可根據需要在植物特定發育階段、組織器官或生長環境下接受誘導信號，誘導基因表達，也可以隨時解除脅迫，停止表達(李杰等，2006)。因此，獲得水稻在氮饑餓狀態下誘導表達的啟動子，不僅可以減少外源基因大量表達帶來的負面影響，更能為基因工程改良水稻提供安全有效的調控。在植物生長所需的各種大量元素中，氮素是限制植物生長和形成植物產量的首要因素。氮不僅是遺傳物質的基礎，更是蛋白質、核酸、葉綠素、酶、維生素、生物堿和植物激素等的重要組成部分(陸景陵，1994)。近半個世紀以來，世界各國都把增施氮肥作為增加水稻產量的重要農業措施，特別是第一次綠色革命之后，隨著高產耐肥品種推廣應用，農田氮肥施用量迅猛增長，極大提高了水稻的產量(鐘代斌等，2001)。農田氮肥的過量施用，隨之而來的便是氮素利用率降低以及一系列的環境問題。氮素的大量流失直接導致地下水污染和江河湖泊的富營養化作用(王光火等，2003)。隨著分子生物學和基因工程在植物領域的迅速發展，植物對氮吸收轉運的分子機制也越來越清晰。大量的銨鹽轉運子、硝酸鹽轉運子被發現，GS/G0GAT(谷氨酸胺合成酶/谷氨酸合成酶)循環同化銨機理被揭示，為基因工程改良水稻氮的吸收利用提供大量的研究素材。雖然通過突變體或者吸收實驗等驗證了不少基因的吸收轉運功能，但是這些基因在水稻體內的超量表達并未達到提高吸收轉運銨的目的。Mohammad等(2006)用玉米ubiquitin啟動子超量表達水稻中的銨鹽轉運子OsAMTl-Ι，提高了水稻中銨的吸收能力以及根中總銨含量，但同時產生了銨的毒害，導致地上部生物量大量減少。如果改為缺氮誘導啟動子驅動，就有可能根據植株的需要，適當控制銨的吸收，避免毒害。GS是參與NH4+同化合成谷氨酰胺(Gln)的主要酶，Cai等(2009)用35S啟動子在水稻品種中花11中超量表達水稻谷氨酰胺合成酶基因GSl ;1、GS1 ；2和大腸桿菌谷氨酰胺合成酶基因glnA，GS活性、總氮含量、氨基酸含量、可溶性蛋白等都得到了顯著提高，但是單株生物學產量及籽粒產量都顯著下降了。如果改為供氮誘導啟動子驅動，不僅可以降低組成型表達造成的“浪費”，更可以保證僅在供氮充足的情況下促進GS的同化，避免單株因氮源不足而造成生物學產量降低。本發明通過芯片發掘了一個供氮誘導基因表達的啟動子，用實時定量realtimePCR在三個不同品種中進行了驗證，同時通過水稻穩定轉化進一步確定了該啟動子是一個供氮誘導的啟動子，為基因工程改良水稻對氮的吸收利用提供了新的材料。

發明內容
本發明的目的在于克服現有的技術缺陷，提供了一種在水稻中供氮誘導基因表達啟動子的應用。啟動子Y2在水稻中供氮誘導基因表達的用途如下:芯片結果顯示，日本晴和珍汕97在缺氮脅迫7d后再供氮時，啟動子Y2控制的下游基因在根中均誘導表達25倍左右，而在地上部組織中不誘導表達。在第三個品種中花11中，通過realtime PCR驗證(Realtime PCR的方法參見TAKARA商業試劑盒的使用說明書，貨號:code:DRR041A)發現啟動子Y2控制的下游基因在缺氮7d后再供氮2h時即可誘導30倍以上，供氮6h誘導可達40倍以上。從中花11 (或稱ZH11)材料中擴增啟動子Y2全長序列融合GUS基因穩定轉化水稻，并構建系列5'端缺失載體，將轉基因陽性材料進行缺氮脅迫后供氮處理，發現供氮前后⑶S基因在根中表達量顯著誘導表達，而⑶S蛋白活性相比誘導前明顯上升。進一步驗證了啟動子Y2供氮誘導表達的特性，并且功能區段在ATG上游519bp。本發明是這樣實現的:本發明以水稻日本晴(英文名稱:Nipponbare，一個公知公用的水稻品種材料，且已經完成全基因組測序的水稻品種)和珍汕97( —個公知公用的水稻品種，來自江西省農業科學院)作為基礎材料，水培幼苗至5葉期，分不同時間點缺氮脅迫處理取樣(缺氮lh、缺氮IcU缺氮3d、缺氮7d、缺氮7d后恢復供氮2小時、恢復供氮I天)，以持續正常營養液培養的幼苗作為對照，利用全基因組eDNA芯片表達譜作為技術手段(楊蓉等，1999)，得到了一個在兩種材料的根中供氮2h后都高倍誘導表達的基因，根據這些基因的信息在NCBI網站(WWW.ncb1.nlm.nih.gov)獲得了基因上游序列即其啟動子序列，同時，申請人按同樣的處理方法處理了第三個水稻品種中花11 (又稱ZH11，來自于中國農業科學院作物科學研究所的一個公知公用品種)，并通過realtime PCR驗證了該基因供氮誘導的表達模式。將啟動子序列融合GUS報告基因構建到啟動子載體DX2181b (載體DX2181b是申請人所在作物遺傳國家重點實驗室研究人員在商業載體PCAMBIA1381，一個來自澳大利亞公開報道和使用的質粒的基礎上改造得到的，見圖2)上，再進行農桿菌介導的遺傳轉化，轉化水稻品種中花11，得到陽性轉化植株。檢測轉化陽性植株的GUS基因表達量發現，缺氮處理7d后供氮2h的⑶S表達量顯著上升，⑶S蛋白檢測發現供氮處理后其活性明顯增強。本發明的優點在于:(I)本發明提供了一種在水稻中供氮誘導基因表達啟動子的應用。在三個不同的品種中驗證了該啟動子下游基因的表達量缺氮處理后供氮高倍誘導的表達模式。啟動子融合⑶S基因穩定轉化水稻陽性植株中，⑶S表達量和⑶S活性供氮處理后均顯著上升。(2)本發明首次發現了啟動子Y2是一個供氮高倍誘導基因表達的啟動子，并且功能區段在ATG上游519bp 內，為基因工程改良水稻中如何有效控制氮素的吸收同化提供了新的材料。
(3)本發明中應用的啟動子及其下游基因可以為水稻等禾谷類作物以及其它作物的營養代謝研究提供支持。


SEQ ID NO:1是啟動子Y2A的核苷酸序列，序列全長為2266bp。SEQ ID NO:2是啟動子Y2A的其中一個截短的啟動子區段Y2B的核苷酸序列，序列全長為1056bp。SEQ ID NO:3是啟動子Y2A的另一個截短的啟動子區段Y2C的核苷酸序列，序列全長為519bp。SEQ ID NO:4是啟動子Y2A的CDS區序列，序列全長為1089bp。SEQ ID NO:4是啟動子Y2A編碼的蛋白質的氨基酸序列，編碼362個氨基酸。圖1.是本發明的總體技術路線圖。圖2.是載體DX2181b的結構示意圖。圖2a是DX2181b改造前載體pCAMBIA1381載體結構圖；圖2b是載體DX2181b的結構示意圖；圖2c是載體DX2181b的多克隆位點結構。圖3.啟動子融合GUS表達載體穩定轉化水稻片段的結構示意圖。圖4.啟動子Y2下游基因在芯片`材料中的表達模式。圖4a是芯片數據，顯示在日本晴(nip)和珍汕97 (ZS)兩個品種的芯片數據中該基因供氮強烈誘導；圖4b是以芯片同批珍汕97材料重新抽提RNA做realtime驗證表達量結果，同樣顯示供氮強烈誘導。圖5.啟動子Y2下游基因用realtime驗證中花11中的表達模式。圖5a是地上部分結果(shoot);圖5b是根結果(root)。圖6.啟動子Y2融合GUS穩定轉化水稻后，各個截短模式的不同陽性單株中GUS基因表達量隨供氮前后的變化。圖6-1、6-2、6-3依次為啟動子全長￥2八及啟動子區段￥28、Y2C結果，后面的不同數字編號代表不同的轉基因陽性株系。圖7.啟動子Y2融合GUS穩定轉化水稻后，各個截短模式的不同陽性單株中GUS蛋白活性隨供氮前后的變化。圖7-1、7-2、7-3依次為啟動子全長Y2A及啟動子區段Y2B、Y2C結果，后面的不同數字編號代表不同的轉基因陽性株系。
具體實施例方式以下實施例進一步定義本發明，并描述了啟動子Y2及其截短片段調節基因表達的模式、遺傳轉化、以及表達水平和GUS活性的測定方法和該啟動子在水稻中的調控表達的模式。根據以下的描述和這些實施事例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特征，并且在不偏離本發明精神和范圍的情況下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。下面結合附圖對本發明作進一步具體描述。實施例1:Y2基因啟動子的調控模式的確定和序列的獲得為發掘水稻中缺氮或供氮高倍誘導基因表達的啟動子，為基因工程改良水稻氮素吸收提供新的啟動子材料，申請人設計了圖1中的技術路線，并選用了兩種公知公用的常規水稻品種作為實驗材料:即日本晴和珍汕97。應用芯片技術，挑選對氮脅迫有明顯反應的新基因，該技術可用于定量檢測大量基因在不同時間表達水平(楊蓉等，1999)。將日本晴和珍汕97的種子37°C浸種3天，催芽2天，沙培一周出苗，移苗于水稻全營養液水培(水培營養液成分:1.44mM NH4NO3,0.3mM NaH2P04,0.5mM K2SO4,1.0mM CaCl2,
1.6mM MgSO4,0.17mMNaSi03, 50 μ M Fe_EDTA，0.06 μ M(NH4)6Mo7024，15 μ M Η3Β03，8μΜ MnCl2,
0.12 μ M CuSO4,0.12 μ MZnSO4, 29 μ M FeCl3,40.5μ M Citric acid，pH 值 5.5，具體參見Yoshida et al.，1976)，培養至5葉期，將部分水稻苗移至缺氮的營養液(上述營養液中不加NH4NO3即可)中進行氮脅迫處理，以繼續用全營養液培養的苗做為對照。根據實驗需要，處理時間點設計如下:缺氮lh、缺氮Id、缺氮3d、缺氮7d、缺氮7d后恢復供氮2h、恢復供氮Id。取樣時地上部和根部分開，分別用錫箔紙包好，置于液氮中保存。抽提樣品RNA并反轉錄成cDNA(具體步驟參見invitrogen公司的SSIII反轉錄試劑盒說明書,貨號:Cat.N0.18080-093)，將各個時間點的樣品送至北京博奧生物有限公司制作全基因組cDNA芯片(楊蓉等，1999)，對反饋的芯片數據進行分析，從芯片結果中發現，由啟動子Y2啟動的下游基因在這兩個品種中缺氮7d后恢復供氮2h根部有高倍誘導，而地上部則無此反應(見圖4a、圖4b)。為了確信該基因對氮的反應是不是在不同品種中都是同樣的表達模式，申請人又用另一種水稻品種中花11(或稱ZH11)種了一批脅迫材料，驗證這些基因對氮的反應。Realtime驗證結果(Realtime PCR的方法參見TAKARA商業試劑盒的使用說明書,貨號code:DRR041A):在中花11中供氮2h根也有30倍的誘導(見圖5a、圖5b)。說明啟動子Y2下游基因的表達模式確實與芯片結果相符。申請人將該基因序列輸入RGAP網站(//rice,plantbiology.msu.edu/)進行Blast得到該基因的全基因序列及登錄號L0C_0s08g02700。在softberry網站上，預測全長0RF，從而得到Y2下游基因的全長基因組序列及啟動子序列。該基因位于水稻8號染色體，全長基因組序列為1672bp，全長cDNA為1089bp，編碼362個氨基酸(見序列表SEQ ID NO:4)。申請人取該基因ATG上游2266bp為該基因的啟動子全長，本發明是通過PCR方法，以水稻品種中花11的總DNA為模板，擴增得到了 Y2啟動子全長的序列，為便于應用并且縮小該啟動子對氮反應調控元件的范圍，申請人又同時將該啟動子全長序列按5'端截短模式截短為兩段，分別命名為:Y2B(該基因ATG上游1056bp)、Y2C(該基因ATG上游519bp)，啟動子全長序列也命名為Y2A (啟動子全長2266bp)。用PCR的方法得到截短的片段，再把片段連接到啟動子融合GUS報告基因的載體DX2181b上(由申請人所在的作物遺傳改良國家重點實驗室對商業載體PCAMBIA1381改造⑶S連接方向和酶切位點而來，見圖2)上，再進行農桿菌介導的遺傳轉化，轉化水稻品種中花11，得到陽性轉化植株。檢測轉化陽性植株的GUS基因表達量發現，缺氮處理7d后恢復供氮2小時的⑶S表達量顯著上升，⑶S蛋白檢測發現缺氮處理后供氮其活性明顯增強。實施例2:啟動子表達轉化載體的構建根據已知啟動子Y2A全長序列(2266bp，見序列表SEQ ID NO:1所述)及其截短的啟動子區段:Y2B(見序列表SEQ ID NO:2)，Y2C(見序列表SEQ ID NO:3)設計三對引物對(引物對的序列見表I)，以水稻品種中花11的總DNA為模板，擴增分別得到啟動子Y2A全長序列(2266bp)及截短的Y2B(1056bp)和Y2C(519bp)。擴增這3個片段時，在三對引物的5'端均添加了相同的限制性內切酶位點BamHI (如表1_1所示)，因此擴增得到的片段可以用限制 性核酸內切酶BamHI進行酶切，然后連接到啟動子載體DX2181b上(載體DX2181b是申請人所在作物遺傳國家重點實驗室研究人員在商業載體pCAMBIA1381，一個來自澳大利亞公開報道和使用的質粒的基礎上改造得到的。該載體包含有潮霉素的篩選基因:hygromyCin(R)，載體DX2181b的結構參見圖2所述)，然后再用表1-2所示的引物對得到的克隆進行測序，確定基因按正確的方向連接到DX2181b載體上(見圖2所示)。利用經典的農桿菌介導的轉化方法(農桿菌EHA105，來自澳大利亞CAMBIA實驗室，轉化的具體操作方法參見=Elizabeth et.al.，1993)，在水稻品種中花11中用Y2A及其截短啟動子啟動GUS基因的表達。考察轉基因陽性植株，發現缺氮7d后供氮處理會導致⑶S表達量顯著上升，⑶S蛋白活性明顯增加。表1-1本發明設計的PCR弓丨物對
權利要求
1.一種在水稻缺氮后恢復供氮下特異性誘導表達的啟動子Y2A，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示。
2.一種在水稻供氮情況下特異性誘導基因表達的啟動子Y2A，它還包括截短的啟動子區段Y2B和Y2C，它們的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
3.權利要求I或2所述的啟動子在缺氮后恢復供氮下誘導基因在水稻中表達的應用。
全文摘要
本發明屬于植物基因工程技術領域。具體涉及一種水稻缺氮后恢復供氮特異性誘導表達啟動子Y2及應用。利用芯片技術，得到了啟動子Y2下游基因供氮誘導表達的信息，通過不同水稻品種驗證了Y2下游基因供氮誘導的表達模式。通過PCR方法，擴增出啟動子Y2全長和其5`端截短的片段，連接到啟動子載體DX2181b上，構建得到啟動子融合GUS表達的載體。再將構建好的載體對水稻品種中花11進行遺傳轉化，在轉化陽性植株中驗證該啟動子對GUS基因表達的調控，通過Realtime表達量驗證和GUS蛋白活性的檢測，進一步確證該啟動子屬于缺氮后恢復供氮特異性誘導表達的啟動子，其功能區段在AT6上游519bp。
文檔編號A01H5/00GK103255140SQ20121003958
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日
發明者練興明, 楊猛, 張星 申請人:華中農業大學