專利名稱：利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)禽流感Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因。
背景技術(shù)：
世界范圍內(nèi)對重組蛋白的要求在以很快的速度增長，這種增長速度通過傳統(tǒng)的生產(chǎn)蛋白的方法是無法滿足的。重組蛋白主要是藥用蛋白，包括抗體、疫苗以及エ業(yè)上使用的 酶和次級代謝產(chǎn)物。傳統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白的系統(tǒng)包括細(xì)菌和哺乳動物系統(tǒng)，但是這些系統(tǒng)因本身的復(fù)雜性和生產(chǎn)成本較高受到限制，因?yàn)閭鹘y(tǒng)系統(tǒng)需要復(fù)雜的發(fā)酵設(shè)備和昂貴的下游純化過程。在植物中表達(dá)重組蛋白，一方面可以滿足不斷增長的蛋白需求；另一方面，植物表達(dá)系統(tǒng)有很多其它表達(dá)系統(tǒng)沒有的優(yōu)點(diǎn)。植物作為“綠色生物反應(yīng)器”具有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。首先，植物表達(dá)系統(tǒng)具有真核生物蛋白表達(dá)后的修飾系統(tǒng)，包括糖基化、ニ硫鍵的形成，這些對于維持蛋白的生物活性非常重要。其次，“緑色生物反應(yīng)器”不存在交叉感染的危險(xiǎn)，因?yàn)榈侥壳盀橹箾]有發(fā)現(xiàn)跨界的病原體。和傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)相比，植物生長所需要的條件簡單，并且非常經(jīng)濟(jì)，它只要光作為主要能量，這進(jìn)一歩降低了成本。對于藥用蛋白來說，后期純化也比較簡単。煙草作為植物界的“白鼠”，被用作為綠色反應(yīng)器的主要平臺。主要原因包括首先，煙草是多葉植物，具有很高的生物量。其次，煙草具有多種轉(zhuǎn)化方式，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)、病毒侵染、穩(wěn)定遺傳以及葉綠體工程。再次，煙草即不是食物也不是飼料，不會污染食物鏈和飼料鏈。這些特點(diǎn)使煙草非常適合應(yīng)用于表達(dá)外源蛋白。禽流感(Avain Influenza, Al)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的鳥類病毒性傳染病，高致病力毒株(Highly Pathogenic Avain Influenza Virus, HPAIV)的流行可導(dǎo)致感染雞群的死亡率達(dá)100%。血凝素是指紅血球凝聚素。病毒的表面存在兩種蛋白質(zhì)，ー種稱為紅血球凝聚素(Hemagglutinin),另ー種為神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase)。高致病性禽流感病毒H5N1中的“H”指代前者，“ N”指代后者。而就目前而言，紅血球凝聚素有16種形態(tài)，神經(jīng)氨酸酶則有9種形態(tài)。它們會引發(fā)免疫系統(tǒng)作出反應(yīng)，特別是紅血球凝聚素，當(dāng)身體需要產(chǎn)生預(yù)防流感抗體時(shí)，身體會主動找尋■這種蛋白質(zhì)。血凝素(HA)是(Avian Influenza Virus,AIV)的主要保護(hù)性抗原，以HA研制的亞單位疫苗可對同一 H亞型不同毒株產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)性。Re-5疫苗株用于預(yù)防H5亞型禽流感病毒引起的雞、鴨、鵝的禽流感。遺傳信息在由mRNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程中是以三聯(lián)體密碼子的形式傳遞的。每種氨基酸至少對應(yīng)一個(gè)密碼子，最多的有六種對應(yīng)密碼子。編碼同一種氨基酸的密碼子成為同義密碼子。在蛋白質(zhì)的合成過程中，同義密碼子的使用頻率并不相同。某一種物種或某一基因通常傾向于使用ー種或幾種特定的同義密碼子，這些密碼子被稱為最優(yōu)密碼子，此現(xiàn)象被稱為密碼子偏好性。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)目前使用的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因序列，在GenBank中經(jīng)比對后選定目前所用核酸序列。根據(jù)煙草密碼子的偏好性，在保證氨基酸序列不變的情況下，對選定的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因序列進(jìn)行優(yōu)化。委托上海生エ生物有限公司合成并構(gòu)建到PUC57載體上。本實(shí)驗(yàn)從PUC57載體中擴(kuò)增得到Re-5疫苗株血凝素(HA)基因，利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)確定該基因的亞細(xì)胞定位，將該基因構(gòu)建到兩個(gè)植物表達(dá)載體上，并從RNA水平和蛋白水平證明該基因在煙草中得到了瞬時(shí)表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從含有人工合成的目的基因的載體！3UC57中擴(kuò)增出Re-5疫苗株血凝素(HA)基因。血凝素(HA)是禽流感病毒的主要保護(hù)性抗原，對生產(chǎn)抗原性疫苗具有重要意義。本發(fā)明所述的禽流感Re-5疫苗株血凝素基因，經(jīng)過密碼子優(yōu)化，它的序列如SEQ ID No. I 所示。—種含Re-5疫苗株血凝素HA基因的表達(dá)載體，本發(fā)明還構(gòu)建了植物雙元載體HA-pK7FWG2. 0，用于確定所述的Re_5疫苗株血凝素(HA)基因的亞細(xì)胞定位，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該基因定位在細(xì)胞間隙，這對于后來蛋白提取方法的確定非常重要。PK7FWG2. 0植物雙元載體是Gateway系統(tǒng)的載體，載體構(gòu)建過程不需要考慮酶切位點(diǎn)，方便快捷。本發(fā)明構(gòu)建了 HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6 X Hi s-pB2GW7. 0 (Delate Bar)三個(gè)植物表達(dá)載體，并在RNA水平和蛋白水平證明了三個(gè)構(gòu)建都能表達(dá)Re-5疫苗株血凝素(HA)基因，并且植物表達(dá)載體Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)的蛋白表達(dá)量最高。所述的表達(dá)載體Kozak-HA_6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)是將 Kozak 序列和6XHis標(biāo)簽以及所述的Re-5疫苗株血凝素HA基因克隆到去掉抗除草劑篩選標(biāo)記Bar后的載體PB2GW7. 0中而得到。本發(fā)明還公開了利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)Re-5疫苗株血凝素HA基因的方法，是構(gòu)建含有所述Re-5疫苗株血凝素HA基因的表達(dá)載體，再將表達(dá)載體注射到煙草中表達(dá)Re-5疫苗株血凝素。所述的表達(dá)載體是HA-6 X Hi S-PB2GW7. 0、Kozak-HA-6 X Hi s-pB2GW7. 0 和/或Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0(Delate Bar)。本發(fā)明評估了煙草注射Kozak-HA_6XHis-pB2GW7. 0(Delate Bar)表達(dá)載體的農(nóng)桿菌后，Re-5疫苗株血凝素(HA)基因在不同時(shí)期的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在第六天Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的表達(dá)量最高。本發(fā)明證明Re-5疫苗株血凝素(HA)基因能夠在煙草系統(tǒng)中瞬時(shí)表達(dá)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)如下根據(jù)煙草密碼子的偏好性，在保證氨基酸序列不變的情況下，對選定的Re-5疫苗株的血凝素(HA)基因序列進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)優(yōu)化的序列設(shè)計(jì)做血凝素(HA)基因定位的引物(5’加CACC是使用gateway系統(tǒng)時(shí)必須加的，3’去掉終止密碼子)，以上海生エ生物有限公司提供的含有人工合成的目的基因的PUC57載體為模板，擴(kuò)增去掉終止子的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因，跑膠鑒定正確后回收。利用invitrogen公司的pENTR Directional TOPO Cloning Kits試劑盒將回收的血凝素(HA)基因連到Gateway系統(tǒng)中的pENTR載體鑒定正確后通過invitrogen公司的Gateway LR Clonase II Enzyme Mix試劑盒，將血凝素基因從入門載體pENTR置換到Gateway系統(tǒng)中的表達(dá)載體pK7FWG2.0，該載體帶有綠色熒光蛋白GFP，可用于確定目的基因的亞細(xì)胞定位。將鑒定正確的大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，鑒定正確后，用無針頭的注射器注射煙草，6天后用共聚焦顯微鏡觀察，并確定Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的亞細(xì)胞定位。根據(jù)優(yōu)化的序列設(shè)計(jì)Re-5疫苗株血凝素(HA)基因表達(dá)的引物(在5’端加CACC，3’端加上6 XHis標(biāo)簽)，以上海生エ生物有限公司提供的含有目的基因的人工合成的PUC57載體為模板，擴(kuò)增出帶6XHis標(biāo)簽的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因。另外，根據(jù)Kozak提出的真核生物偏好的轉(zhuǎn)移起始密碼子周邊序列，許多研究報(bào)道表明，起始密碼子 的周邊序列做相應(yīng)修改，可提高外源基因的表達(dá)量。我們設(shè)計(jì)另外ー對引物將kozak序列(TAAACCATGGCT)加到序列起始密碼子的前面(5’加CACCTAAACCATGGCT, 3 ’端加卜.6 X His標(biāo)簽)。同樣以上海生エ生物有限公司提供的含有目的基因的人工合成的PUC57載體為模板，擴(kuò)增出帶6XHis標(biāo)簽及kozak序列的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因。將擴(kuò)增結(jié)果跑膠，鑒定正確后回收，利用 invitrogen 公司的 pENTR Directional TOPO Cloning Kits 試劑盒將回收的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因連到Gateway系統(tǒng)中的入門載體pENTR，鑒定正確后通過invitrogen公司的Gateway LR Clonase II Enzyme Mix試劑盒，將只帶6XHis標(biāo)簽的血凝素(HA)基因從入門載體置換到Gateway系統(tǒng)中的表達(dá)載體pB2GW7. 0上，將帶6 XHis標(biāo)簽和Kozak的Re_5疫苗株血凝素(HA)基因從入門載體置換到Gateway系統(tǒng)中的表達(dá)載體PB2GW 7. 0和本實(shí)驗(yàn)室改造成功的pB2GW 7. 0 (Delate Bar)載體上做Re_5疫苗株血凝素(HA)基因的過表達(dá)。將鑒定正確的大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，鑒定正確后，用無針頭的注射器注射煙草，第6天收獲。分別用含有HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6 XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)構(gòu)建的農(nóng)桿菌注射煙草,第六天收獲后,一方面，提RNA檢測Re-5疫苗株血凝素(HA)基因在RNA水平的表達(dá)情況；另ー方面，提蛋白，用Western blot檢測Re_5疫苗株血凝素(HA)基因在蛋白水平的表達(dá)情況。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)I.本發(fā)明選用植物界的“小白鼠”-煙草，作為表達(dá)宿主，能夠快速瞬時(shí)表達(dá)目的基因，成本低，效率高。2.本發(fā)明根據(jù)煙草密碼子的偏好性，在保證氨基酸序列不變的情況下，對選定的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因序列進(jìn)行優(yōu)化，以便使Re-5疫苗株血凝素(HA)基因能在煙草中高效表達(dá)。3.本發(fā)明確定了的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的亞細(xì)胞定位，對于后續(xù)蛋白的提取具有指導(dǎo)意義。4.本發(fā)明證實(shí)本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的三個(gè)含Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的表達(dá)載體都能表達(dá)血凝素基因，并確定了表達(dá)量最聞的載體。5.本發(fā)明還進(jìn)ー步確定了表達(dá)量最高的載體在注射后第幾天Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的表達(dá)量達(dá)到最高。


圖I :Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的亞細(xì)胞定位A :明場；B :葉綠體的自發(fā)熒光；C :綠色熒光代表禽流感血凝素(HA)基因的表達(dá)。D :A、B以及C的疊合。圖2 :實(shí)驗(yàn)中用到的兩個(gè)過表達(dá)載體:A:植物表達(dá)載pB2GW7.0;B :去掉除草劑篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體PB2GW7.0，即是pB2GW7.0 (Delate Bar)圖3 :含Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的三個(gè)表達(dá)載體的示意圖及它們表達(dá)水平比較的情況A :HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6XHi s_pB2GW7. O、Kozak-HA-6 X Hi s-pB2GW7. 0 (Delate Bar)三個(gè)表達(dá)載體的示意圖，其中 2:HA-6XHis-PB2GW7. 0 表達(dá)載體的示意圖；3 Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0 表達(dá)載體的不意圖；4 Kozak-HA-6 XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)表達(dá)載體的不意圖；B :HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0 (DelateBar)三個(gè)表達(dá)載體表達(dá)水平的比較1 :注射P19的煙草；2 :注射HA_6XHis-pB2GW7. 0表達(dá)載體的煙草；3 :注射Kozak-HA-6 X Hi s-pB2GW7. 0表達(dá)載體的煙草；4 :注射Kozak-HA-6 XHis-pB2GW7. OCDelate Bar)表達(dá)載體的煙草。其中I :RNA水平的表達(dá)情況；
2:煙草管家基因的表達(dá)情況；3 :蛋白水平的表達(dá)情況。圖4 :注射 Kozak-HA_6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)表達(dá)載體的煙草在不同時(shí)期表達(dá)Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的情況A :血凝素(HA)基因在RNA水平的表達(dá)情況:煙草管家基因的表達(dá)情況；C :血凝素(HA)基因在蛋白水平的表達(dá)情況。I :是注射P19的煙草；2 :注射Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)表達(dá)載體兩天后的煙草；3 :注射Kozak-HA-6 XHi s_pB2GW7. 0 (Delate Bar)表達(dá)載體四天后的煙草；4:注射Kozak-HA-6 XHi s_pB2GW7. 0 (Delate Bar)表達(dá)載體六天后的煙草；5 :注射Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)表達(dá)載體八天后的煙草。
具體實(shí)施例方式PUC57載體購自上海生エ生物有限公司。pK7FWG2. 0 和 pB2GW7. 0 質(zhì)粒購自 Plant System Biology (構(gòu)建見 Karimi, M.，Inze, D. and Depicker, A. (2002)GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated planttransformation, Trends in Plant Science ；7 (5) 193-5.)農(nóng)桿菌GV3101購自北京拜爾迪公司P19 構(gòu)建見 Olivier Voinnet et al. An enhanced transient expressionsystem in plants based on suppression of gene silencing by the pl9 protein oitomato bushy stunt virus. The Plant Journal(2003)33,949-956.。實(shí)施例一 Re_5疫苗株血凝素(HA)基因的密碼子優(yōu)化由于Re-5疫苗株血凝素(HA)基因是動物病毒基因，考慮到密碼子的偏好性，為使該基因能在煙草中高效表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)首先在不改變其氨基酸序列的情況下，對該基因序列的密碼子進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的序列如SEQ ID No. I所示。該項(xiàng)工作由上海生エ生物有限公司完成并進(jìn)行全基因合成。實(shí)施例ニ Re_5疫苗株血凝素(HA)基因定位載體HA-PK7FWG2. 0的構(gòu)建 根據(jù)煙草密碼子的偏好性，在保證氨基酸序列不變的情況下，對選定的Re-5疫苗株的血凝素(HA)基因序列進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)優(yōu)化的序列設(shè)計(jì)做血凝素(HA)基因定位的正向引物為 HA (SL) F 5f -CACCATGGAAAAAATCGTTC-3 ' (SEQ ID No. 2)，反向引物為 HA (SL) R 5’-GATACAAATTCTGCACTGGAGA-3’ (SEQ ID No. 3)，引物由上海生エ生物有限公司合成。以上海生エ生物有限公司提供的含有人工合成的目的基因的PUC57載體為模板，PCR體系含0. 3 u L 的質(zhì)粒模板，4 u L 的 dNTP (終濃度為 2. 5mmol/L), 5 y L 白勺 IOXpyrobest Buffer,HA(SL)F,HA(SL)R各4 ii L，0. 25 ii L的pyrobest-Taq酶，用超純水補(bǔ)足總體積50 Uし反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 50sec，57°C退火 50sec，72°C延伸 2minl0sec ；36 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段，直接與invitrogen公司的pENTR Directional TOPO⑧連接，具體反應(yīng)體系(3 u L)如下PCR 產(chǎn)物0. 5 ii LSalt Solution0. 5 U LTopo Vector0. 5 U L ddH20I. 5u L22°C連接I小時(shí)，熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E coli DH5 a，經(jīng)兩次PCR確定陽性重組入門質(zhì)粒。兩次PCR的引物為M13通用引物(M13F、M13R)以及M13上游引物Ml 3F 和基因下游引物 HA(SL)R ;M13F :5’ -GTAAAACGACGGCCAG-3 ’ (SEQ ID No. 4)、M13R :5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(SEQ ID No. 5);將鑒定正確的重組入門質(zhì)粒與Gateway系統(tǒng)中的表達(dá)載體PK7FWG2. 0質(zhì)粒混和，具體反應(yīng)體系(5 u L)如下鑒定正確的含目的基因的入門載體 IuL表達(dá)載體PK7FWG2. 0IuLddH202 u LMIX 酶I ii L25 °C反應(yīng)3小時(shí)，熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E coli DH5 a，經(jīng)兩次PCR確定陽性重組質(zhì)粒；兩次PCR的引物為載體PK7FWG2. 0上35S的上游引物F :5’-CTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’ (SEQ ID No. 6)和基因下游引物 HA(SL) R ;以及基因上、下游引物HA (SL) F和HA (SL) R。將確定正確的質(zhì)粒用冷凍法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，經(jīng)兩次PCR鑒定(載體PK7FWG2. 0上35S的上游引物和基因下游引物以及基因下上、下游引物)正確后存菌，即得到基因定位載體HA-PK7FWG2. O。實(shí)施例三Re_5疫苗株血凝素(HA)基因表達(dá)載體的構(gòu)建(I)載體 pB2GW7. 0 (Delate Bar)的構(gòu)建以Gateway系統(tǒng)中載體pB2GW7. 0為基礎(chǔ)，去掉其除草劑篩選標(biāo)記Bar基因，即完成了載體PB2GW7. 0 (Delate Bar)的構(gòu)建，具體方法如下對載體pB2GW7. 0的序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)一對引物Pl :5' -ACATTGGGAACCGGTCACA-3' (AgeI) (SEQ ID No. 7) ;P2 :5' GAGCTCTCAATTCGGCGTTAATTCAG-3' (SacI) (SEQ ID No. 8)(如圖 2，A 中所示)，Pl 從載體pB2GW7. 0上6690bp開始設(shè)計(jì)，其中包含了在載體pB2GW7. 0中只出現(xiàn)一次的酶切位點(diǎn)AgeI ；P2從載體PB2GW7. 0中LB的最后ー個(gè)堿基(即載體pB2GW7. 0 9722bp)開始設(shè)計(jì)，并在LB的最后ー個(gè)堿基的后面加了載體PB2GW7. 0上抗除草劑篩選標(biāo)記Bar基因之后的SacI酶切位點(diǎn)(該酶切位點(diǎn)在載體PB2GW7. 0中只出現(xiàn)一次)。以載體pB2GW7. 0為模板，以PI、P2為引物，PCR體系含0. 5 y L的質(zhì)粒模板，4 y L的 dNTP (終濃度為 2. 5mmol/L) ,5u L 的 10XLA Taq Buffer, PI、P2 各 4 y L，0. 5 y L 的 LATaq酶，用超純水補(bǔ)足總體積50iiし反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性50sec，56°C退火50sec，72°C延伸3min20sec ;36個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段，利用北京全式金生物技術(shù)有限公司的PEASY-Tl CloningKit試劑盒，將目的片段連到T載體上，反應(yīng)體系為PCR產(chǎn)物3 ill (根據(jù)PCR產(chǎn)物量可適當(dāng)增減，最多不超過4iil)，pEASY-Tl Cloning Vector I yl輕輕混合，25°C反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上，熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E coli DH5a。經(jīng)PCR和酶切(SacI和AgeI)鑒定正確后，由上海生エ生物有限公司完成測序工作，測序無誤后，用SacI和AgeI雙酶切載體PB2GW7. O和以載體pB2GW7. O為模板，以PI、P2為引物擴(kuò)增的產(chǎn)物。20 酶切體系為2 ill SacI Buffer, 0. 4 U I SacI, I. 6 ii IAgeI, 5 ii I質(zhì)粒,用超純水補(bǔ)足總體積20u I0 37°C 4小時(shí)，跑膠回收，用大連寶生物工程有限公司的T4連接酶連接。連接體系
2ill T4Buffer, 2 ill T4酶，回收產(chǎn)物各8 yl。連接過夜，熱激發(fā)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E coliDH5a。酶切鑒定正確后，即完成了載體pB2GW7. 0(Delate Bar)(如圖2，B中所示)的構(gòu)建。
(2) Re-5疫苗株血凝素(HA)基因表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體HA-6XHis-pB2GW7. 0的構(gòu)建根據(jù)優(yōu)化的序列設(shè)計(jì)含6XHis標(biāo)簽的血凝素(HA)基因的引物HA-6XHis F 5 CACCATGGAAAAAATCGTTCTTCTTCT 3’ (SEQ IDNo. 9)、HA-6XHis R :5’ TTAATGATGATGATGATGATGGATACAAATTCTGCACTG 3’ (6XHis) (SEQID No. 10)引物由上海生エ生物有限公司合成。以上海生エ生物有限公司提供的含有人工合成的目的基因的PUC57載體為模板，PCR體系含0. 3 ii L的質(zhì)粒模板，4 y L的dNTP (終濃度為 2. 5mmol/L)，5ii L 的 IOXpyrobest Buffer, HA-6XHis F, HA-6XHis R各 4yL，
0.25 ii L的pyrobest-Taq酶,用超純水補(bǔ)足總體積50 Uし反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性 50sec，58°C退火 50sec，72°C延伸 2minl0sec ；36 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin。PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段，直接與invitrogen公司的pENTR Directional T0P0 連接,具體反應(yīng)體系(3 u L)如下PCR 產(chǎn)物0. 5 ii LSalt Solution0. 5 U LTopo Vector0. 5 U LddH20I. 5u L22°C連接I小時(shí)，熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E coli DH5 a，經(jīng)兩次PCR確定陽性重組入門質(zhì)粒。兩次PCR的引物為M13通用引物(M13F、M13R)以及M13上游引物M13F和基因下游引物HA_6XHis R ;將鑒定正確的重組入門質(zhì)粒與Gateway系統(tǒng)中的表達(dá)載體pB2GW7. 0質(zhì)粒混和,具體反應(yīng)體系(5iiL)如下鑒定正確的含目的基因的入門載體 IuL表達(dá)載體pB2GW7. 0IuLddH202 u LMIX 酶I ii L25°C反應(yīng)3小時(shí)，熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E coli DH5 a，經(jīng)兩次PCR確定陽性重組質(zhì)粒；兩次PCR的引物為載體pB2GW7. 0上35S的上游引物F :載體pB2GW7. 0上35S的上游引物 F :5，CTTCGCAAGACCCTTCCTC 3，(SEQ ID No. 11)和基因下游引物 HA_6XHis R;以及基因上、下游引物HA-6XHis F和HA-6XHis R0將確定正確的質(zhì)粒用冷凍法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，經(jīng)兩次PCR鑒定(載體PB2GW7.035S上的上游引物和基因下游引物以及基因下上、下游引物)正確后存菌，即得到表達(dá)載體HA-6XHis-pB2GW7. O。表達(dá)載體Kozak-HA-6XHis-PB2GW7. 0 和 Kozak-HA-6 XHis-pBMWL 0 (DelateBar)的構(gòu)建根據(jù)優(yōu)化的序列設(shè)計(jì)含Kozak序列和6XHis標(biāo)簽的血凝素(HA)基因的引物Kozak-HA-6XHis F :5’ CACCTAAACCATGGCTATGGAAAAAATC(Kozak)3’ (SEQ ID No. 12)，Kozak-HA-6 XHis R :5，TTAATGATGATGATGATGATGGATACAAATTC (6 XHis) 3，(SEQ IDNo. 13)，引物由上海生エ生物有限公司合成。以上海生エ生物有限公司提供的含有人工合成的目的基因的PUC57載體為模板，PCR體系含0. 3 ii L的質(zhì)粒模板，4 y L的dNTP (終濃度為 2. 5mmol/L), 5 u L 的 IOXpyrobest Buffer, Kozak-HA-6 XHis F\> Kozak-HA-6 XHis R 各L，0. 25ii L的pyrobest-Taq酶，用超純水補(bǔ)足總體積50 yし反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 50sec, 57°C退火 50sec, 72°C延伸 2minl0sec ；36 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸IOmin0 PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收目的片段,直接與invitrogen公司的pENTR Directional T0P0⑧連接，具體反應(yīng)體系(3 u L)如下PCR 產(chǎn)物0. 5 ii LSalt Solution 0. 5 U LTopo Vector0. 5 U LddH20I. 5u L22°C連接I小時(shí)，熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E coli DH5 a，經(jīng)兩次PCR確定陽性重組入門質(zhì)粒。兩次PCR的引物為M13通用引物(M13F、M13R)以及M13上游引物M13F和基因下游引物Kozak-HA-6XHis R ;將鑒定正確的重組入門質(zhì)粒與Gateway系統(tǒng)中的表達(dá)載體pB2GW7. 0和pB2GW7. 0 (Delate Bar)質(zhì)粒混和，具體反應(yīng)體系(5 u L)如下鑒定正確的含目的基因的入門載體IuL表達(dá)載體pB2GW7. 0/pB2GW7. 0 (Delate Bar) I U LddH202u LMIX 酶I ii L25°C反應(yīng)3小時(shí)，熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E coli DH5 a，經(jīng)兩次PCR確定陽性重組質(zhì)粒；兩次PCR的引物為載體pB2GW7. 0上35S的上游引物F和基因下游引物Kozak-HA-6 X Hi SR ；以及基因上、下游引物 Kozak-HA_6XHisF 和 Kozak-HA_6XHisR。將確定正確的質(zhì)粒用冷凍法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，經(jīng)兩次PCR鑒定(載體pB2GW7. 035S上的上游引物和基因下游引物以及基因下上、下游引物)正確后存菌，即得到表達(dá)載體Kozak-HA-6XHiS-PB2GW7. 0 和 Kozak-HA-6XHis_pB2GW7. 0(Delate Bar)。實(shí)施例四煙草的種植和Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的瞬時(shí)表達(dá)(I)煙草的種植煙草種植在本實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)箱內(nèi)，10小時(shí)光照，14小時(shí)黑暗，濕度是70%左右。煙草種子不需任何處理直接種植在小的育苗盒中，兩星期以后，每ー個(gè)小的育苗盒移ー棵煙草幼苗，移苗后2-3星期，大概5-6片真葉，即可用于注射。(2) Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的瞬時(shí)表達(dá)Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的瞬時(shí)表達(dá)通過將相應(yīng)構(gòu)建的農(nóng)桿菌注射煙草來實(shí)現(xiàn)。具體方法如下將鑒定正確的含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌按體積比1%的接種量接種到含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中，搖16小時(shí)，然后按體積比1/10的接種量再搖6個(gè)小時(shí)。4000rpm，IOmin離心收集菌體,用提前配好的Mgcl2懸浮液(0. 406g Mgcl2 7H20溶于200ml水)懸浮，再4000rpm, IOmin,再用Mgcl2懸浮液懸浮，將OD600調(diào)至0. 8即可。將含有P19 (沉默抑制因子，作用是增加目的蛋白的表達(dá)量)的懸浮液和含目的基因的懸浮液等體積混合，注射煙草。實(shí)施例五Re-5疫苗株血凝素(HA)基因亞細(xì)胞定位的觀察取注射載體HA-pK7FWG2. 0+P19五天后的煙草葉片，用鑷子從所取葉片上撕一小片下來，放在載玻片上(下表皮緊貼載玻片)，加一滴30%甘油，蓋上蓋玻片，吸取多余的30%的甘油。然后將制好的標(biāo)本倒放在共聚焦顯微鏡上觀察，結(jié)果如圖I所示，Re-5疫苗 株血凝素(HA)基因定位在細(xì)胞間隙。實(shí)施例六Re-5疫苗株血凝素(HA)基因在HA_6XHis-pB2GW7. O、Kozak-HA-6 XHis-pB2GW7. 0、Kozak-HA_6 XHis_pB2GW7. 0 (Delate Bar)三個(gè)表達(dá)載體中表達(dá)情況的比較(I) RNA水平的比較煙草分別注射HA-6XHis-pB2GW7. 0+P19、Kozak-HA-6 X Hi s-pB2GW7. 0+P19、Kozak-HA-6 XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar) +P19后，第六天收獲煙草葉片，提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。以該 cDNA 為模板，以 HARTF(5，TATTCCGAAATCTTCTTGGTCT 3’，SEQ ID No. 14)、HA RT R(5’ ITGAITGCGTCATTAGGCTT3’，SEQ ID No. 15)為引物，進(jìn)行 RT-PCR。同樣的cDNA 作為模板，使用 Actin F(5' ATGACGGCAGATACTGGACC 3'，SEQ ID No. 16)和 ActinR(5/ CAGGCTTGTAGGCAATGAAA 3'，SEQ ID No. 17)作為引物,擴(kuò)增 Actin 作為內(nèi)參。(2)蛋白水平的比較蛋白水平的檢測，通過雜交6XHis標(biāo)簽來實(shí)現(xiàn)，具體方法如下蛋白提取緩沖液是4M尿素和IOOmMDTT,將適量葉片用液氮磨成粉末，在預(yù)冷的EP管中加入300 U I提取緩沖液及0. Ig的粉末，在蝸旋儀上充分蝸旋，然后加入蛋白上樣Loading，放入沸水中煮5min,然后8000rpm離心30min,取20 y I上清點(diǎn)入提前做好10%的聚丙烯酰胺凝膠中，70伏電壓，40min，然后90伏，大概3小吋。膠跑完后，ー塊染色，另ー塊膠轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件是200毫安，35min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%的奶粉封閉3個(gè)小時(shí)，然后封ー抗(I 1000)，4°C過夜。PBS洗膜5次，每次5min。封ニ抗，室溫3個(gè)小時(shí)。PBS洗膜5次，每次5min。用ECL顯色，試劑盒中兩種液體等體積混合，然后加到轉(zhuǎn)膜時(shí)靠近膠的膜的那一面，壓X光片5-30min。具體結(jié)果如圖3所示，三個(gè)含Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的載體表達(dá)該基因的情況在RNA水平上沒有顯著的差別，但在蛋白水平上，注射載體Kozak-HA-6 X Hi s-pB2GW7. 0 (DelateBar)的煙草，Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的表達(dá)量最高。實(shí)施例七注射Kozak-HA_6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)表達(dá)載體的煙草不同時(shí)期表達(dá)Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的情況按照實(shí)施例六的方法檢測注射Kozak-HA_6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)表達(dá)載體的煙草在不同時(shí)期表達(dá)Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的情況。具體結(jié)果如圖4所示，無論是在RNA水平還是蛋白水平，煙草在注射Kozak-HA-6XHis-pB2GW7. 0 (Delate Bar)載體的農(nóng)桿菌后的第六天，Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的表達(dá)量都是最高的。
權(quán)利要求
1.Re-5疫苗株血凝素HA基因，其特征在干，該基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化，它的序列如SEQID No. I 所示。
2.ー種含Re-5疫苗株血凝素HA基因的表達(dá)載體，是Kozak-HA-6XHis- pB2GW7. O(Delate Bar)其特征在于是將Kozak序列和6XHis標(biāo)簽以及權(quán)利要求I所述的Re_5疫苗株血凝素HA基因克隆到去掉抗除草劑篩選標(biāo)記Bar后的載體pB2GW7. 0中而得到。
3.ー種利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)Re-5疫苗株血凝素HA基因的方法，其特征在于構(gòu)建含有權(quán)利要求I所述Re-5疫苗株血凝素HA基因的表達(dá)載體，再將表達(dá)載體注射到煙草中表達(dá)Re-5疫苗株血凝素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的表達(dá)載體是胡-6XHis-pB2GW7.O、Kozak-胡-6XHis-pB2GW7. 0 或 Kozak-胡-6XHis_pB2GW7. 0 (Delate Bar)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的表達(dá)載體是Kozak-胡-6XHis-pB2GW7. OCDelate Bar)，注射 Kozak-胡-6XHis_pB2GW7. OCDelate Bar)到煙草中表達(dá)Re-5疫苗株血凝素，轉(zhuǎn)化第六天后Re-5疫苗株血凝素的含量最高。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程和蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域，涉及一種利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因。所述的Re-5疫苗株血凝素(HA)基因，序列如SEQIDNO.1所示。通過基因工程方法，該基因在煙草葉片中表達(dá)。發(fā)現(xiàn)HA主要在煙草的細(xì)胞間隙表達(dá)，三個(gè)含目的基因的構(gòu)建都能表達(dá)Re-5疫苗株血凝素(HA)基因，Kozak-HA-6×His-pB2GW7.0(DelateBar)表達(dá)載體Re-5疫苗株血凝素(HA)基因的表達(dá)量最高。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)煙草注射Kozak-HA-6×His-pB2GW7.0(DelateBar)表達(dá)載體后，Re-5疫苗株血凝素(HA)基因在第六天表達(dá)量最高。
文檔編號A01H5/00GK102643837SQ20121007599
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者侯繼波, 唐應(yīng)華, 張志燕, 王政, 王秋葉, 譚小力, 鄭香峰, 陳克平 申請人:江蘇大學(xué)