專利名稱：防治西瓜細菌性果斑病生防菌株1jn2及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業生物技術領域，涉及防治西瓜細菌性果斑病生防菌株1JN2及其應用。
背景技術：
西瓜細菌性果斑病(Bacterialfruit blotch of watermelon, BFB)是西瓜上的一種危險性檢疫病害，又稱細菌性斑點病，該病最早于1969年由Crall和Schenck在美國佛羅里達州發現，當時只是對果斑病癥狀進行了描述，未做病原菌的鑒定；目前為止，在我國許多省市，像新疆，陜西，河北，山西，吉林，福建，甘肅等地都已有果斑病的報道。該病害主要危害果實，引起西瓜果實腐爛等，可造成毀滅性損失，一旦發病用藥防治基本沒有效果。而且帶菌種子將成為下一年重要的初侵染源。該病的發生嚴重影響了西瓜的產量和品質，成為西瓜生產上亟待解決的難題之一。該病害是由燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Acidovorax avenae subsp. citrulli, Aac)引起的，西瓜果斑目前在瓜類作物中無免疫品種。西瓜細菌性果斑病是一種毀滅性的細菌性病害，大田生長期不易被發現，且發病突然、發展迅速，由于目前還沒有發現種子處理的更好方法，目前生產中所采用的化學藥劑有農用鏈霉素，可殺得，新植霉素，細菌殺，葉雙青， 加瑞農，琥膠肥酸銅等，雖然化學藥劑對該病有一定的防治效果，但是防治效果不高，而且大量使用化學殺菌劑往往會造成環境污染、農藥殘留，以及引起病原菌抗藥性等問題。生物防治是一種安全有效的防治手段，符合農業持續發展的方向。

發明內容
本發明的目的針對西瓜產業潛在危害較大的西瓜細菌性果斑病，提供開發一種防治西瓜細菌性果斑病的單一生防菌菌株及其應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現一種防治西瓜細菌性果斑病病害的生防菌株1JN2，分類命名為Bacillus axarquiensis, 2012年I月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO. 5731。用所述的保藏號為CGMCC NO. 5731的生防菌株1JN2制備的生防菌劑。所述的保藏號為CGMCC NO. 5731的生防菌株1JN2在防治西瓜細菌性果斑病中的應用。所述保藏號為CGMCC NO. 5731的生防菌株IJN2用于制備生防菌劑的方法將所述的保藏號為CGMCC NO. 5731的防治西瓜細菌性果斑病的生防菌株1JN2在LB培養液中 280C 180rpm振蕩培養12_16h，然后6000rpm離心lOmin，用滅菌水進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為I X IO9-I X 101QCFU/mL。所述的保藏號為CGMCC NO. 5731的生防菌株1JN2制備的生防菌劑在防治西瓜細菌性果斑病中的應用。該菌劑可以兌水噴霧使用，或做成堆肥使用，也可稀釋后在移栽時灌根。有益效果本發明的優點和積極效果表現在本發明是專門針對西瓜細菌性果斑病病害開發的生防制劑。由于是生物制劑，完全沒有因化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于西瓜的無公害生產，農民可以不用或減少其他化學農藥的用量，這不僅可為農民節省開支，而且有利于西瓜的出口貿易。溫室大棚試驗結果顯示，含1JN2(CGMCC NO. 5731)的生防菌劑對西瓜的促生作用效果顯著，生物量增加達到55. 92% (表I)，并且該生防菌劑對西瓜果斑病病害防效顯著， 高達 50. 13% (表 2)。生物樣品保藏信息生防菌株1JN2,分類命名為Bacillus axarquiensis,于2012年I月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC NO. 5731。
具體實施例方式實施例I—種防治西瓜細菌性果斑病病害的生防菌株1JN2,為Bacillus axarquiensis,由山東省萊蕪市生姜莖內分離得到。其具體分離、篩選、鑒定方法如下I生防菌株IJN2的分離剪掉生姜莖部3g，用1%的次氯酸鈉ImL浸5min，70%酒精浸2min，無菌水清洗3 次。(取最后一次清洗的溶液0. ImL涂R2A,或取0. ImL最后一次清洗液加入R2A培養液， 30°C振蕩培養，若48h后無菌生長則認為表面消毒干凈)。用滅菌的研砵研碎表面消毒好的莖，加3mL無菌水，無菌棉布過濾，用無菌水稀釋10倍，取0. ImL涂LB平板，每個點重復 3次，28°C培養48h，計數，挑取平板上所有的菌落分離純化，-70°C、40%甘油保存備用。2生防菌株1JN2的篩選 將西瓜細菌性果斑病病原菌燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Acidovoraxavenae) FC440(JianjunFeng, Erin L. Schuenzel, Jianqiang Li, and Norman ff. Schaad. 2009. Multilocus Sequence Typing Reveals Two Evolutionary Lineages of Acidovorax avenae subsp. Citrulli. Bacteriology. 99 (8) :913-920)在 LB 培養液(氯化鈉 lOg/L,膜蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調節pH值為7. 2)中培養16-24h至CFU為108/ml)，加入熔化冷卻至40°C左右的固體培養基中，體積比I : 200，將培養基每20mL倒入9cm直徑的平板中。待冷卻凝固后，牙簽接種生防菌1JN2。置于28°C恒溫培養箱培養，24h后記錄抑菌圈環徑，挑取抑菌圈最大的命名為1JN2，于2012年I月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，菌種保藏號為 CGMCC NO. 5731。3生防菌株1JN2的鑒定3. I生防菌株1JN2的形態特征菌落扁平、灰白色，邊緣波紋狀，較粘稠，菌體直桿狀，大小為2. 0 X 0. 5 ii m，單生、
4對生或成短鏈狀、絲狀，周生多根鞭毛，內生孢子為橢圓形，在末端未膨大的孢子囊中，好氣性，革蘭氏反應陽性。3. 2生防菌株1JN2的生理生化特征將生防菌1JN2活化在LB平板上(氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L， 調節pH值為7. 2)，28°C培養24h，用牙簽挑取單菌落分別接種到蛋白酶，幾丁質酶，纖維素酶，以及嗜鐵素酶活測定的平板上，置于28°C恒溫培養箱培養，培養2-3d，測量透明圈直徑的大小。表I. Bacillus axarquiensis 1JN2 的生理生化特征
菌株編號蛋白酶透明圈直徑 (cm)幾丁質酶透明圈直徑(cm)纖維素酶透明圈直徑(cm)嗜鐵素透明圈直徑 (cm)1JN2203I3. 3生防菌株1JN2的分子學鑒定細菌基因組試劑盒(賽百盛公司)提取細菌基因DNA后，用gyrB通用引物 gyrBl (SEQ ID NO. I) ；gyrB2R(SEQ ID NO. 2)從基因組 DNA 中擴增出 gyrB 基因片段。具體擴增體系及程序(25ul)如下引物 gyrB U gyrB2R (IOuM)各 I yl ；Mix 12. 5u I ；Taq 0. 5u I0 ddH20 :10 ill ;模板1 ill。94°C 預變性 5min，94°C 變性 lmin，56°C 退火 2min，72°C 延伸2min，35個循環，72°C延伸lOmin，4°C保存。PCR擴增產物用I %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，90V，30min ；EB染色30min，檢測擴增產物。擴增產物純化后連接到pMD19_T載體，轉化于 Escherichia coliDH5 a ,提取陽性克隆質粒,委托TaKaRa公司測序,提交NCBI (National Center for Biotechnology Information)進行比對。與登錄號為 DQ903178. I 的 Bacillus axarquiensis strain LMG 22476DNA gyrase subunit B(gyrB)基因比對，相似度為99%， 因此鑒定 1JN2 為 Bacillus axarquiensis。實施例2蠟質芽孢桿菌1JN2生防菌劑的制備將上述防治西瓜細菌性果斑病的生防菌株1JN2(CGMCC NO. 5731)在LB培養液 280C 180rpm振蕩培養12_16h，然后6000rpm離心lOmin，用滅菌水進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為I X IO9-I X 101(lCFU/mL，以下稱該生防菌劑為蠟質芽孢桿菌1JN2生防菌劑。實施例3蠟質芽孢桿菌1JN2溫室促生試驗將催芽后的西瓜種子播種于裝有無菌土壤中盆砵中，每盆一粒，16/8h光周期。待西瓜長到6葉期時，將懸浮好的蠟質芽孢桿菌1JN2生防菌劑(實施例2制備，下同)以 108CFU/ml的濃度用手動式噴器將該菌成霧狀噴施于葉片的表面，使葉片濕潤而菌劑又恰好不流下來。置于溫室中培養，28°C，70%相對濕度以上，生防菌接種30天后，分別取處理組和對照組植株，小心剔除根部土壤，清洗干凈后，自然風干，分別統計地上部長，地下部長，植株鮮重。6CTC,烘干72h后測量植株干重。生物量增加(％ )=(處理組植株干重-對照植株干重)/對照植株干重X 100 %表2. Bacillus axarquiensis 1JN2對西瓜苗期的促生作用
權利要求
1.一種防治西瓜細菌性果斑病的生防菌株1JN2，分類命名為Bacillus axarquiensis,于2012年I月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCN0. 5731。
2.用權利要求I所述的保藏號為CGMCCNO. 5731生防菌株1JN2制備的生防菌劑。
3.權利要求I所述的保藏號為CGMCCNO. 5731生防菌株1JN2在防治西瓜細菌性果斑病中的應用。
4.權利要求I所述生防菌株1JN2用于制備生防菌劑的方法，其特征在于將權利要求I所述防治西瓜細菌性果斑病的生防菌株1JN2在LB培養液中28°C 180rpm振蕩培養 12-16h，然后6000rpm離心lOmin，用滅菌水進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為 lX109-lX101QCFU/mL。
5.權利要求2所述生防菌劑在防治西瓜細菌性果斑病中的應用。
全文摘要
本發明屬于農作物防病治病技術領域，公開了防治西瓜細菌性果斑病生防菌株1JN2及其應用。生防菌株1JN2，分類命名為Bacillus axarquiensis，2012年1月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.5731。將該菌在LB培養液中28℃180rpm振蕩培養12-16h，然后6000rpm離心10min，用滅菌水進行稀釋制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為1×109-1×1010CFU/mL。溫室大棚試驗結果顯示，含1JN2的生防菌劑對西瓜的促生作用效果顯著，生物量增加達到55.92％，并且該生防菌劑對西瓜果斑病病害防效顯著，高達50.13％。
文檔編號A01P1/00GK102604869SQ20121007933
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者武芳, 蔣春號, 郭堅華 申請人:南京農業大學