專利名稱：瓜類果斑病菌檢測用引物探針及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測瓜類果斑病菌的引物探針及其檢測方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
瓜類果斑病是葫蘆科作物上的一種嚴(yán)重的世界性病害，其病原為嗜酸菌屬西瓜種 (Acidovorax citrulli)。瓜類果斑病菌可侵染多種葫蘆科作物,如西瓜、甜瓜、南瓜、黃瓜等。自報道發(fā)生 以來已在美國、澳大利亞、中國等很多國家發(fā)生，給當(dāng)?shù)氐奈魈鸸戏N植業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。該病菌可通過種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，為我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物。
健康種子是該病害防控最重要及最有效的手段，快速準(zhǔn)確的檢測技術(shù)是保證種子健康的重要措施。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)主要包括分離培養(yǎng)、過敏性壞死反應(yīng)、生理生化測定、免疫學(xué)檢測及種植觀察等。該類方法耗時長且靈敏度不高，難以滿足檢疫要求。分子生物學(xué)檢測方法目前在該病原菌的檢測中已廣泛應(yīng)用。Walcott等報道了利用WFB1/WFB2引物對進(jìn)行PCR凝膠電泳檢測的方法，該對引物擴(kuò)增效率及靈敏度較高，在檢測中應(yīng)用比較廣泛， 但缺點是特異性差，不能將瓜類果斑病菌與嗜酸菌屬的很多其它種區(qū)分開，容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。而且PCR電泳方法容易導(dǎo)致PCR產(chǎn)物污染，在專業(yè)的檢測實驗室中不太適用。胡白石等建立了該病原菌padlock探針檢測技術(shù)，有效避免了 PCR檢測方法易受樣品雜質(zhì)干擾及假陽性問題，具有很高的特異性及靈敏度。實時熒光PCR技術(shù)在封閉管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測，具有PCR凝膠電泳技術(shù)不可比擬的優(yōu)勢，避免了 PCR產(chǎn)物污染，而且具有更高的靈敏度與特異性，目前在病原菌檢測中已廣泛應(yīng)用。在瓜類果斑病菌檢測中實時熒光PCR 方法報道也比較多，通過實驗室實驗驗證比較，在特異性靈敏度及廣譜性(對不同來源瓜類果斑病菌的檢測)等幾個指標(biāo)方面難以顧全。
本研究通過比較已報道的瓜類果斑病菌的基因組與其近緣種之間的差異，找出特異性序列并設(shè)計引物探針，建立了瓜類果斑病菌實時熒光PCR檢測方法。本發(fā)明靈敏度高， 準(zhǔn)確性可靠，為該病害的田間監(jiān)測及口岸檢疫提供技術(shù)支撐。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于瓜類果斑病菌實時熒光PCR檢測的引物探針序列及其檢測方法。
本研究通過比較已報道的瓜類果斑病菌的基因組與其近緣種之間的差異，找出特異性序列并設(shè)計引物探針，篩選比較后建立了瓜類果斑病菌實時熒光PCR檢測方法。
所述的引物對由正向和反向引物組成，其核苷酸序列如序列表Seql和Seq2所示； 所述探針核苷酸序列如序列表Seq3所示，該探針一端標(biāo)記有報告熒光基團(tuán)。另一端標(biāo)記非熒光性的淬滅基團(tuán)。
本發(fā)明還進(jìn)一步給出了應(yīng)用上述引物和探針的熒光PCR檢測方法，其以樣品總 DNA為模板，進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增，每個循環(huán)結(jié)束采集熒光信號，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
具體地說本發(fā)明以樣品總DNA為模板，進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，即在25 μ L反應(yīng)體系中加入12.5yL 2X熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液，I μ L弓丨物Seql (10 μ mol/L)，I μ L弓丨物Seq2 (10 μ mol/L), O. 5 μ L TaqMan 探針 Seq3 (10 μ mol/L), I μ L DNA,補(bǔ)充超純水至 25 μ I
其中，上述反應(yīng)條件可以是第一個循環(huán)為95 °C IOmin;隨后40個循環(huán)，940C 15s, 58°C Imin0
進(jìn)一步，還可以將本發(fā)明引物、探針以及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。


圖I是實時熒光PCR方法特異性實驗結(jié)果；A:瓜類果斑病菌，B:其他對照細(xì)菌及空白對照。
圖2是實時熒光PCR方法靈敏度實驗結(jié)果。I 8 X IO6CFU/ μ L, 2 8 X IO5CFU/ μ L, 3 8 X IO4CFU/μ L, 4 8 X IO3CFU/μ L, 5 8 X IO2CFU/μ L 1,6 8 X IO1CFU/μ L, 7 8 X IO0CFU/ μ L，8 0. 8CFU/y L,9 :空白對照。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均來自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
實施例I引物及探針的設(shè)計和合成
本研究通過分析已報道的瓜類果斑病菌的基因組序列,利用軟件primer Express 3. O設(shè)計引物及探針，最后經(jīng)過比較篩選確定的引物序列為
Seql 5/ -CTGATAATCCTCGGCTCAACAA-3'，
Seq2 5/ -TGAGCGCATTTCTGACGAG-3'，
探針序列為Seq3:5' -AAGAAATACGCCCTCGCCAATCTCC-3'，
該探針5'端標(biāo)記報告熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)。
實施例2實時熒光PCR檢測方法的建立
在25yL反應(yīng)體系中加入12.5yL 2X熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液，I μ L引物Seql (10ymol/L)，lyL 引物 Seq2 (10 μ mol/L), O. 5 μ L TaqMan 探針 Seq3 (10 μ mol/L), I μ L DNA，補(bǔ)充超純水至25 μ I。將樣品管放入ABI 7900熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng) 第一個循環(huán)為95°C IOmin;隨后40個循環(huán)，94°C 15s, 58°C lmin。每個循環(huán)采集熒光信號， 反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
實施例3實時熒光PCR方法的特異性實驗
以瓜類果斑病菌及其近緣種為對象，測試該方法的特異性。所用近緣種包括了嗜酸菌屬 A. avenae subsp. aveane, A. avenae subsp. cattleyae, A. konjaci 及其他屬 23 株植物病原菌及10株不同來源的瓜類果斑病菌。實驗中直接以濃度為106CFU/mL左右的菌液 I μ I為模板進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，結(jié)果表明所有瓜類果斑病菌株均為陽性(圖I中A標(biāo)識的曲線)其他的非瓜類果斑病菌(圖I中B標(biāo)識的曲線)均為陰性結(jié)果。證明了該方法具有較好的特異性。
實施例4實時熒光PCR方法靈敏度實驗
利用平皿涂板培養(yǎng)計數(shù)法對液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期的瓜類果斑病菌進(jìn)行濃度測定，利用超純水進(jìn)行IOX梯度稀釋，稀釋后濃度分別為8 XlO6CFU/^ I至O. 8CFU/y 1，分別取I μ I稀釋液作為模板進(jìn)行實時熒光PCR靈敏度實驗。檢測結(jié)果如圖2所示，8CFU/μ I濃度以上均獲得強(qiáng)的熒光信號(圖2中1-7)，故最低檢測限是SCFU/μ I。
實施例5對西瓜種子的檢測
實驗用種子為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T1465-2004)檢測確認(rèn)的8份攜帶瓜類果斑病菌，4份不攜帶瓜類果斑病菌的西瓜種子。每份種子取100g，4°C無菌水浸泡過夜后取5ml浸泡液， IOOOOg離心lOmin，取沉淀利用商業(yè)化DNA提取試劑盒提取總DNA。通過實時熒光PCR檢測， 攜帶瓜類果斑病菌的種子樣品均可觀察到明顯的熒光信號，而不攜帶瓜類果斑病菌的西瓜種子及空白對照的熒光信號無明顯變化，驗證了該方法的可靠性，可應(yīng)用到實際檢測。
權(quán)利要求
1.一種瓜類果斑病菌檢測用引物，其核苷酸序列為Seql 5/ -CTGATAATCCTCGGCTCAACAA-3'，Seq2 5/ -TGAGCGCATTTCTGACGAG-3'。
2.一種與權(quán)利要求I所述引物配合使用的探針，其核苷酸序列為Seq3 -AAGAAATACGCCCTCGCCAATCTCC-3'，該探針 Y 端標(biāo)記報告熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)。
3.一種利用權(quán)利要求I的引物及權(quán)利要求2的探針進(jìn)行瓜類果斑病菌實時熒光PCR檢測的方法，其特征在于實時熒光PCR反應(yīng)的退火溫度為58°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種瓜類果斑病菌檢測用引物及探針，所述引物的核苷酸序列如序列表Seq1&Seq2所示，所述探針的核苷酸序列如序列表Seq3所示。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了瓜類果斑病菌檢測方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用上述引物和探針進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增，每個循環(huán)采集熒光信號，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本發(fā)明探針特異性好，檢測方法快速簡單，準(zhǔn)確性高，靈敏度高，為保證瓜葫蘆科種子健康提供了技術(shù)支撐。
文檔編號C12Q1/68GK102925568SQ20121040811
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者田茜, 趙文軍, 牟海青, 朱水芳 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院