專利名稱：一種高效提高花生轉基因苗成活率的煉苗、移栽方法
技術領域：
本發明涉及一種高效提高花生轉基因苗成活率的移栽方法，屬于轉基因花生組織培養技術領域。
背景技術：
花生是重要的油料作物和經濟作物，在世界范圍內廣泛種植，但其種質資源有限， 在栽培生產中易受多種病蟲害以及干旱等不利因素的影響，導致產量和品質下降。現代轉基因技術的發展對提高花生抗性、改良花生品質，實現花生品種改良，發揮重要的作用。目前應用于花生的轉基因技術以依賴組織培養的農桿菌介導法和基因槍法為主。同多數豆科作物一樣，花生的遺傳轉化技術難度大，仍存在轉化率低、再生頻率和體細胞胚成苗率較低、品種基因型依賴以及移栽成活率低等難題。以花生組織培養為基礎的遺傳轉化前期周期長，且由于花生自身特點以及技術限制，目前的花生遺傳轉化效率最高也只能達到4-5%， 前期外植體制備以及篩選的工作量非常大。因此，后期提高陽性苗的成活率至關重要。花生組培苗本身就存在移栽難度大，成活率低的瓶頸，而花生轉基因苗由于陽性率低且某些外源基因的引入使轉基因苗的生長特性異于普通栽培花生和普通的花生組培苗，因此必須建立一種聞效提聞花生轉基因苗成活率的移栽方法，這是提聞花生遺傳轉化效率的重要一環，也是節約時間成本和勞動成本的重要一環。

發明內容
本發明的目的是提供一種聞效提聞花生轉基因苗成活率的移栽方法，以提聞花生遺傳轉化工作效率。為達到上述目的，本發明采用以下步驟
(I)出瓶，輕輕清除根部培養基，并以無菌水沖洗、以適宜濃度生根劑、殺菌劑先后浸泡。(2)準備合適的容器，內置滅過菌且疏松透氣、保水性好的生長基質備用。(3)移栽，并在基質上層撒一層3_5mm厚的粗粒狀蛭石達到抑菌效果，嚴格按生長階段控制濕度、溫度、光照及營養供給。本發明進一步提供了上述提高花生轉基因苗成活率的移栽方法的優選技術方
步驟(I)中所述的生根劑為3mg/L吲哚丁酸(IBA)和0. 3mg/L a -萘乙酸(NAA)，浸泡 20分鐘；殺菌劑為0. 2%的高錳酸鉀，浸泡30秒后以無菌水沖洗三次。進一步優選的，所述的吲哚丁酸(IBA)和a-萘乙酸體積比為1:1。步驟(2)所述的容器為底部帶有透水孔，直徑35-40cm，高度30_40cm的花盆。所述的生長基質須滅菌備用，成分為7/10翠筠營養土、1/5砂土與1/10粗粒狀蛭石的混合物(重量比)，并以清水攪拌至水不滴漏為佳。步驟(3)所述的移栽，先挖一個足夠根伸展開的坑，深度控制在5cm左右，慢慢填土，第一節肉質莖埋入土中約1/2。優選的，所述的生長時段濕度、光照強度為
A.移栽后三周內，室內濕度需控制在75%以上，光照強度為3000Lx，溫度25°C；
B.三周后，室內濕度可降至65%，光照強度為5000Lx，溫度28°C；
C.待轉基因花生苗長至10-15cm高，且葉色正常，長勢良好，即可移至室外(溫度需 25°C以上)，或者加強室內光照強度至lOOOOLx，溫度仍設為28°C。進一步優選的，移栽后一周內不另外澆水，降低污染機率及防止爛根；一周后置 1/2 MS液體培養基(去掉有機成分)于容器底盤中，以基質自行吸附方式補充營養與水分。之后可保持一周澆水一次的頻率，水量保持在澆水后一天底盤中水被吸干為宜。利用本發明使得花生轉基因苗成活率達到95%以上，且在整個生長周期生長旺盛，正常開花，平均每株結果6-11個，室內生長飽果數即可達到85%以上。突破了轉基因花生移栽難、成活率低的瓶頸，很大程度上提高了花生遺傳轉化工作的效率，科研價值與社會效益顯著。
具體實施例方式下面通過具體實施例進一步說明本發明的技術方案，本發明包括但不限于以下實施方式。根據現有技術對本發明所進行的不脫離本發明實質內容的改變，仍屬于本發明的保護范圍。實施例I
將30株經過煉苗的花育26轉基因苗出瓶，該批苗是通過農桿菌侵染獲得的SAD基因超量表達苗。用鑷子輕輕清除根部培養基，先以3mg/L IBA和0. 3mg/L NAA浸泡根部20分鐘；然后用0. 2%的高錳酸鉀浸泡30秒后以無菌水沖洗三次。移栽至事先滅過菌的生長基質中。該生長基質為7/10翠筠營養土、1/5砂土與1/10粗粒狀蛭石的混合物，所用容器最寬直徑40cm，高35cm，底部帶有透水孔。移栽過程保證所有的根伸展開，慢慢填土，第一節肉質莖埋入土中約1/2。最上層覆蓋一層3_厚的粗粒狀蛭石抑菌。移栽后一周內不另外澆水，降低污染幾率及防止爛根；一周后置1/2 MS液體培養基(去掉有機成分)于容器底盤中，以基質自行吸附方式補充營養與水分。之后可保持一周澆水一次的頻率，水量保持在澆水后一天底盤中水被吸干為宜(約500ml)。移栽后三周內，由于根系不發達，室內濕度控制在75-80%，光照強度為3000Lx，溫度25°C;三周后室內濕度降至65%，光照強度為5000Lx， 溫度28°C ；29株轉基因花生苗長葉色正常，長勢良好，長至10-15cm高后，加強室內光照強度至lOOOOLx，溫度仍設為28°C。移栽后29株苗(97%)成活且生長旺盛，正常開花，平均每株結果7-11個，飽果率約90%。實施例2
將25株經過煉苗的花育17轉基因苗出瓶，該批苗是通過農桿菌侵染獲得的KAS II基因超量表達苗。用鑷子輕輕清除根部培養基，先以3mg/L IBA和0. 3mg/L NAA浸泡根部20 分鐘；然后用0. 2%的高錳酸鉀浸泡30秒后以無菌水沖洗三次。移栽至事先滅過菌的生長基質中。該生長基質為7/10翠筠營養土、1/5砂土與1/10粗粒狀蛭石的混合物，所用容器最寬直徑40cm，高35cm，底部帶有透水孔。移栽過程保證所有的根伸展開，慢慢填土，第一節肉質莖埋入土中約1/2。最上層覆蓋一層5_厚的粗粒狀蛭石抑菌。移栽后一周內不另外澆水，降低污染幾率及防止爛根；一周后置1/2 MS液體培養基(去掉有機成分)于容器底盤中，以基質自行吸附方式補充營養與水分。之后可保持一周澆水一次的頻率，水量保持在澆水后一天底盤中水被吸干為宜(約500ml)。移栽后三周內，由于根系不發達，室內濕度控制在75-80%，光照強度為3000Lx，溫度25°C;三周后室內濕度降至65%，光照強度為5000Lx， 溫度28°C ；24株轉基因花生苗長葉色正常，長勢良好，長至10-15cm高后，加強室內光照強度至lOOOOLx，溫度仍設為28°C。移栽后24株苗(95%)成活且生長旺盛，正常開花，平均每株結果6-10個，飽果率約85%。
權利要求
1.一種花生轉基因苗的移栽方法，包括如下步驟(1)出瓶，清除根部培養基，以無菌水沖洗、以適宜濃度生根劑、殺菌劑先后浸泡；(2)準備合適的容器，內置滅過菌且疏松透氣、保水性好的生長基質備用；(3)移栽，并在基質上層撒一層3-5mm厚的粗粒狀蛭石達到抑菌效果，控制濕度、溫度、 光照及營養供給。
2.根據權利要求I所述的移栽方法，其特征在于，步驟(I)中所述的生根劑為3mg/L吲哚丁酸和O. 3mg/L α -萘乙酸按體積比I: I混合，浸泡20分鐘；殺菌劑為O. 2%的高錳酸鉀，浸泡30秒后以無菌水沖洗三次。
3.根據權利要求I所述的移栽方法，其特征在于，步驟(2)所述的容器為底部帶有透水孔，直徑35_40cm,高度30_40cm的花盆。
4.根據權利要求I所述的移栽方法，其特征在于，步驟(2)中所述的生長基質須滅菌備用，成分為重量比7/10翠筠營養土、1/5砂土與1/10粗粒狀蛭石的混合物，并以清水攪拌至水不滴漏為佳。
5.根據權利要求I所述的移栽方法，其特征在于，步驟(3)所述的移栽，先挖一個足夠根伸展開的坑，深度控制在5cm左右，慢慢填土，第一節肉質莖埋入土中約1/2。
6.根據權利要求I所述的移栽方法，其特征在于，所述的濕度、光照強度為A.移栽后三周內，室內濕度需控制在75%以上，光照強度為3000Lx，溫度25°C；B.三周后，室內濕度可降至65%，光照強度為5000Lx，溫度28°C；C.待轉基因花生苗長至10-15cm高，且葉色正常，長勢良好，即可移至室外，或者加強室內光照強度至lOOOOLx，溫度仍設為28°C。
7.根據權利要求6所述的移栽方法，其特征在于，所述的室外溫度為25°C以上。
8.根據權利要求I所述的移栽方法，其特征在于，移栽后一周內不另外澆水，降低污染機率及防止爛根；一周后置體積比1/2去掉有機成分的MS液體培養基于容器底盤中，以基質自行吸附方式補充營養與水分，之后保持一周澆水一次的頻率，水量保持在澆水后一天底盤中水被吸干。
全文摘要
本發明涉及一種花生轉基因苗的移栽方法，包括如下步驟1)出瓶，清除根部培養基，以無菌水沖洗、以適宜濃度生根劑、殺菌劑先后浸泡；2)準備合適的容器，內置滅過菌且疏松透氣、保水性好的生長基質備用；3)移栽后在基質上層撒一層3-5mm厚的粗粒狀蛭石達到抑菌效果，控制濕度、溫度、光照及營養供給。利用本發明使得花生轉基因苗成活率達到95%以上，且在整個生長周期生長旺盛，正常開花，平均每株結果6-11個，室內生長飽果數即可達到85%以上。突破了轉基因花生移栽難、成活率低的瓶頸，很大程度上提高了花生遺傳轉化工作的效率，科研價值與社會效益顯著。
文檔編號A01G9/10GK102577874SQ20121007936
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者和亞男, 楊慶利, 楊珍, 潘麗娟, 王冕, 王通, 禹山林, 遲曉元, 陳娜, 陳明娜 申請人:山東省花生研究所