一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導方法
【專利摘要】本發明公開了一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導方法，該方法是先將重樓根莖上未萌發的芽體進行消毒和預培養，然后將預培養后體積明顯膨大的芽體切去芽鞘，再將芽軸從中央進行縱切后接入愈傷組織誘導培養基中進行培養,接著將由芽軸產生的已愈傷化的組織進行培養獲得重樓胚性組織，最后將胚性組織進行誘導培養產生白色圓球形的胚狀體。本發明為重樓優良品種的培育和組培苗的大量快速繁殖提供了一條新途徑，可實現重樓植物短時間、低成本的大批量生產。
【專利說明】一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種重樓植物的組織培養方法，特別是涉及一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導方法。
【背景技術】
[0002]中國藥典規定的中藥重樓為漠重樓(Paris polyphylla var.yunnanensis)和華重樓(Paris polyphylla var.chinensis)的地下莖,前者主產于云南,后者主產于四川。《神農本草經》最早記載的蚤休即華重樓。重樓具有清熱解毒、消炎止痛、活血化淤、涼肝定驚的功效。
[0003]近年來因發現重樓具有抗病毒、抗腫瘤作用而需求量大增。重樓中藥材歷來以野生資源提供藥用，近年來由于對野生資源的過度采挖，致使野生重樓資源遭到了毀滅性的破壞，現己瀕臨滅絕，因而大力開發重樓植物資源具有十分重要的意義。
[0004]目前制約重樓植物規模化栽種的主要問題是重樓種苗的短缺。重樓種子由于存在種胚發育不完全，胚乳堅硬，胚軸后熟等明顯“雙重休眠”特性，因此播種后通常需要經歷兩冬一夏才能萌發成苗，是典型的“二年生種子”，而且在自然狀態下，即使經過了長時間休目民，重樓種子的出苗率也不高，因此目前僅靠重樓種子進行有性繁殖已無法滿足重樓植物大面積栽種的需要。
[0005]植株胚狀體是由構成植物體的細胞在組織培養條件下，通過類似于受精卵形成的合子發育成胚的過程而形成的體細胞胚體。胚狀體具有植物胚的特性，在條件允許的情況下可快速生長為再生植株，可有效解決重樓種苗短缺的問題。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導方法，該方法誘導產生的胚狀體，在適當的條件下可快速生長為再生植株，從而可實現重樓再生植株的快速繁殖。
[0007]本發明提供的以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導方法包括下列步驟:
[0008](I)取重樓根莖上生長健壯、且未萌發的芽體，先用自來水沖洗干凈后陰干，然后進行消毒處理，接著用無菌水震蕩洗滌后，用已滅菌的濾紙反復吸干芽體表面的水分，然后接種于預培養基MS+6-BA0.5~3.0mg.L-1+水楊酸20~80mg.L4中，在培養溫度為16~22°C、每天光照6~14小時、光照強度為1000~20001x的條件下進行預培養；
[0009](2)選取預培養后體積明顯膨大的芽體，在超凈工作臺上先將芽鞘切去，然后將芽軸進行縱切，將切開的芽軸的縱切面接入愈傷化誘導培養基MS+6-BA0.5~2.0mg.L、NAA0.5 ~2.0mg.L_1+2,4-Dl.0 ~4.0mg.L-1 中，在培養溫度為 12 ~26。。、每天光照4~16小時、光照強度為1000~20001x的條件下進行培養；
[0010](3)將由 芽軸產生的已愈傷化的組織切成I~3cm3的大小接入LS+6-BA0.5~
2.0mg.L-'+ΝΑΑΟ.5~4.0mg.L-1培養基中，在培養溫度為16~28°C、每天光照8~12小時、光照強度為1200~25001x的條件下進行培養，培養25~45天繼代一次，連續進行2~4次繼代培養，獲得重樓胚性組織；
[0011](4)將重樓胚性組織切成0.5~2.5cm3的大小接入LS+6-BA2.0~
4.0mg.+IAA0.5~2.0mg.L—1+頭孢噻肟鈉100~400mg.L—1培養基中，在培養溫度為5~10°C、每天光照2~6小時、光照強度為400~1000lx的條件下進行培養，培養50~70天后，在胚性組織表面產生白色圓球形的胚狀體。
[0012]上述所有培養基還包括瓊脂5.0~7.0g.L-1和蔗糖20~60g.?Λ培養基的pH值為5.6~6.5、
[0013]上述步驟(1)中所述消毒處理是指在超凈臺上先用濃度為70%~75%的酒精消毒10~60s，再用濃度為0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin。
[0014]本發明首次提出了以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導方法，該方法在一定程度上解決了重樓植物大規模栽種時對種源需求的問題，為重樓優良品種的培育和組培苗的大量快速繁殖提供了一條新途徑，可實現重樓短時間、低成本、大批量生產。
[0015]下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
【具體實施方式】
[0016]實施例1
[0017](I)預培養:取重樓根莖上生長健壯、芽體直徑在0.5cm以上、且未萌發的芽體，先用自來水沖洗干凈后陰干，然后在超凈臺用濃度為70%的酒精消毒10s，再用濃度為0.1%的升汞消毒4min，接著用無菌水震蕩洗滌3次后，用已滅菌的濾紙反復吸干芽體表面的水分，然后接種于預培養基MS+6-BA0.5mg.I71+水楊酸20mg.L4中，在培養溫度為16°C、每天光照6小時、光照強度為lOOOlx的條件下進行預培養，培養20天統計，芽體膨大率為78.93%，染菌率為20.23% ；
[0018](2)芽軸細胞愈傷化誘導:選取預培養后體積明顯膨大的芽體，在超凈工作臺上先將芽鞘切去，然后將芽軸從中央進行縱切，再將切開的芽軸的縱切面接入愈傷化誘導培養基 MS+6-BA0.5mg.I^+NAA0.5mg.^+2,4-01.0mg.L-1 中，在培養溫度為 12°C、每天光照 4小時、光照強度為lOOOlx的條件下培養50天，觀察并統計出有72.84%的芽軸產生了愈傷化；
[0019](3)胚性組織的產生:將由芽軸產生的已愈傷化的組織切成Icm3的大小接入LS+6-BA0.5mg.L-'+ΝΑΑΟ.5mg.L-1培養基中，在培養溫度為16°C、每天光照8小時、光照強度為12001x的條件下進行培養，培養25天繼代一次，連續進行2次繼代培養，有41.31%的培養材料產生了胚性組織；
[0020](4)胚狀體的產生:選取步驟(3)產生的淡黃白色、分裂能力強的重樓胚性組織，將其切成0.5cm3的大小后接入LS+6-BA2.0mg.L_1+IAA0.5mg.L-1+頭孢噻肟鈉IOOmg.L-1培養基中，在培養溫度為5°C、每天光照2小時、光照強度為4001x的條件下進行培養，培養55天后，有61.86%的胚性組織表面產生了白色圓球形的胚狀體；
[0021]上述所有培養基的pH值為5.6，瓊脂5.0g.L—1，蔗糖20g.L'
[0022]實施例2
[0023](I)預培養:取重樓根莖上生長健壯、芽體直徑在0.5cm以上、且未萌發的芽體，先用自來水沖洗干凈后陰干，然后在超凈臺先用濃度為75%的酒精消毒40s，再用濃度為
0.1%的升汞消毒8min，接著用無菌水震蕩洗滌5次后，用已滅菌的濾紙反復吸干芽體表面的水分，然后接種于pH值為5.8的預培養基MS+6-BA2.0mg.L—1+水楊酸60mg.L—1+鹿糖^g-T1+瓊脂6.0g -T1中，在培養溫度為20°C、每天光照8小時、光照強度為15001x的條件下進行預培養，培養20天統計，芽體膨大率為90.3%，染菌率為0% ；
[0024](2)芽軸細胞愈傷化誘導:選取預培養后體積明顯膨大的芽體，在超凈工作臺上先將芽鞘切去，然后將芽軸從中央進行縱切，再將切開的芽軸的縱切面接入PH值為5.8的愈傷化誘導培養基 MS+6-BA1.0mg.L_1+NAA1.0mg.L_1+2,4-D2.0mg.L-1+ 蔗糖 20g.L-1+ 瓊脂6.0g -L-1中，在培養溫度為20°C、每天光照8小時、光照強度為15001x的條件下培養60天，觀察并統計出有85%的芽軸產生了愈傷化； [0025](3)胚性組織的產生:將由芽軸產生的已愈傷化的組織切成2cm3的大小接入pH值為 6 的培養基 LS+6-BA1.0mg.L^+NAA2.0mg.L—1+ 蔗糖 30g.L—1+ 瓊脂 6.0g.L-1 中，在培養溫度為20°C、每天光照10小時、光照強度為20001x的條件下進行培養，培養30天繼代一次，連續進行3次繼代培養，經顯微觀察，有67.8%的培養材料產生了胚性組織；
[0026](4)胚狀體的產生:選取步驟(3)產生的淡黃白色、分裂能力強的重樓胚性組織，將其切成2.0cm3的大小后接入pH值為6的培養基LS+6-BA3.0mg.L^+IAAl.0mg.L-1+頭孢噻肟鈉200mg.L-1+蔗糖30g.L-1+瓊脂6.0g.L-1中，在培養溫度為6~I (TC、每天光照4小時、光照強度為6001x的條件下進行培養，培養60天后，有87.6%的胚性組織表面產生了白色圓球形的胚狀體，平均每個胚性組織材料上產生4~8個胚狀體，經顯微切片觀察，形成的胚狀體與母體組織的維管束不連接，有獨立的維管束系統。
[0027]實施例3
[0028](I)預培養:取重樓根莖上生長健壯、芽體直徑在0.5cm以上、且未萌發的芽體，先用自來水沖洗干凈后陰干，然后在超凈臺用濃度為75%的酒精消毒60s，再用濃度為0.15%的升汞消毒8min，接著用無菌水震蕩洗滌6次后，用已滅菌的濾紙反復吸干芽體表面的水分，然后接種于預培養基MS+6-BA3.0mg.L—1+水楊酸80mg.L-1中，在培養溫度為22°C、每天光照14小時、光照強度為20001χ的條件下進行預培養，培養20天統計，芽體膨大率為82.53%,染菌率為0% ；
[0029](2)芽軸細胞愈傷化誘導:選取預培養后體積明顯膨大的芽體，在超凈工作臺上先將芽鞘切去，然后將芽軸從中央進行縱切，再將切開的芽軸的縱切面接入愈傷化誘導培養基 MS+6-BA2.0mg.L_1+NAA2.0mg.1^+2，4-D4.0mg.L-1 中，在培養溫度為 26°C、每天光照 16小時、光照強度為20001x的條件下培養70天，觀察并統計出有83.54%的芽軸產生了愈傷化；
[0030](3)胚性組織的產生:將由芽軸產生的已愈傷化的組織切成3cm3的大小接入LS+6-BA2.0mg.-1+ΝΑΑ4.0mg -T1培養基中，在培養溫度為28°C、每天光照12小時、光照強度為25001x的條件下進行培養，培養45天繼代一次，連續進行4次繼代培養，有68.26%的培養材料產生了胚性組織；
[0031](4)胚狀體的產生:選取步驟(3)產生的淡黃白色、分裂能力強的重樓胚性組織，將其切成2.5cm3的大小后接入LS+6-BA4.0mg.L^+IAA2.0mg.L-1+頭孢噻肟鈉400mg.-1培養基中，在培養溫度為10°C、每天光照6小時、光照強度為lOOOlx的條件下進行培養，培養65天后，有84.15%的胚性組織表面產生了白色圓球形的胚狀體；
[0032]上述所有培養基的pH值為6.5，瓊脂7.0g.L-S蔗糖60g.L-1
[0033]實施例4
[0034]將實施例2步驟(1)中所述的預培養基改為pH值為6的MS+6-BA0.5mg.l-1+水楊酸30mg.L-1+蔗糖30g.L-1+瓊脂5.8g.L-1其它步驟同實施例2 ;培養20天后，芽體膨大率為81.13%。
[0035]實施例5
[0036]將實施例2步驟(2)中的芽軸愈傷化誘導培養基改為pH值為5.8的MS+6-BA2.0mg.L -1NAA0.5mg.L-1+2,4-D1.0mg.L-1+ 鹿糖 20g.L-1+ 瓊脂 6.0g.L -1 其它步驟同實施例2，培養60天后，觀察并統計出有77%的芽軸產生了愈傷化。
[0037]實施例6
[0038]將實施例2步驟(4)中的誘導重樓胚狀體產生的培養基改為pH值為6的LS+6-BA4.0mg.L-1+IAA1.0mg.L-1+ 頭抱噻月虧鈉 400mg.L-1+ 鹿糖 30g.L-1+ 瓊脂 6.0g.L-1,培養60天后，有85.53%的胚性組織表面產生出白色圓球形的胚狀體，平均每個胚性組織材料上產生5~8個胚狀體。
[0039]比較實施例1
[0040]將實施例2步驟(1)中的芽體改為采用已明顯萌發的芽體，其它步驟同實施例2 ；培養20天統計，芽體膨大率40.39%，染菌率為61.71%;
[0041]比較實施例2
[0042]將實施例2步驟(1)中所述的預培養基改為pH值為5的B5+6-BA1.0mg.L-1+2，4-D1.5mg.L-1+ 蔗糖 20g.L-1+ 瓊脂 6g.L—1，其它步驟同實施例 2 ;培養20天統計，芽體膨大率43.15%。
[0043]比較實施例3
[0044]在實施例2步驟(2)中，采用不切去膨大芽體上的芽鞘，而是將帶芽鞘的芽體縱切后接入培養基中，其它步驟同實施例2 ;培養60天統計，僅有43.52%的芽軸培養材料產生了愈傷化。
[0045]比較實施例4
[0046]將實施例2步驟(2)中芽軸的切割方式改為橫切，即將芽軸切為上下兩部分后，再將橫切面接入培養基中，其它步驟同實施例2 ;培養60天觀察發現，接入的芽軸上部分未出現愈傷化，而是表現為一定程度的抽苗；而接入的芽軸下部有35%產生了愈傷化；
[0047]比較實施例5
[0048]將實施例2步驟(3)中的胚性細胞誘導培養基改為pH值為6.5的MS+6-BA2.0mg.L-1+NAA1.0mg.L-1+ 蔗糖 30g.L-1+ 瓊脂 6.0g.L—1，其它步驟同實施例 2 ;培養后經顯微觀察，只有23.18%的培養材料產生了胚性組織。
[0049]比較實施例6
[0050]將實施例2步驟(4)中的誘導重樓胚狀體產生的培養基改為pH值為5的1/2MS+6-BA1.0mg.L-1+ΙΑΑ2.0mg.L—1+ 蔗糖 30g.L—1+ 瓊脂 6.0g.L-1其它步驟同實施例 2 ;培養 60天后，有9.87%的胚性組織表面產生出白色圓球形的胚狀體，平均每個胚性組織材料上產生1~3個胚狀體。
【權利要求】
1.一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導方法，其特征在于包括如下步驟: (1)取重樓根莖上生長健壯、且未萌發的芽體，先用自來水沖洗干凈后陰干，然后進行消毒處理，接著用無菌水震蕩洗滌后，用已滅菌的濾紙反復吸干芽體表面的水分，然后接種于預培養基MS+6-BA0.5~3.0mg ·L-1+水楊酸20~80mg *L_1中，在培養溫度為16~22°C、每天光照6~14小時、光照強度為1000~20001x的條件下進行預培養； (2)選取預培養后體積明顯膨大的芽體，在超凈工作臺上先將芽鞘切去，然后將芽軸進行縱切，將切開的芽軸的縱切面接入愈傷化誘導培養基MS+6-BA0.5~2.0mg.L、NAA0.5 ~2.0mg.L_1+2,4-Dl.0 ~4.0mg.L-1 中，在培養溫度為 12 ~26。。、每天光照4~16小時、光照強度為1000~20001x的條件下進行培養； (3)將由芽軸產生的已愈傷化的組織切成I~3cm3的大小接入LS+6-BA0.5~2.0mg.L-'+ΝΑΑΟ.5~4.0mg.L—1培養基中，在培養溫度為16~28°C、每天光照8~12小時、光照強度為1200~25001x的條件下進行培養，培養25~45天繼代一次，連續進行2~4次繼代培養，獲得重樓胚性組織； (4)將重樓胚性組織切成0.5~2.5cm3的大小接入LS+6-BA2.0~4.0mg ?L-'+ΙΑΑΟ.5~2.0mg *L-1+頭孢噻廂鈉100~400mg *L_1培養基中，在培養溫度為5~10°C、每天光照2~6小時、光照強度為400~lOOOlx的條件下進行培養，培養50~70天后，在胚性組織表面產生白色圓球形的胚狀體。
2.根據權利要求1所述的一種以重樓芽軸為外植體的胚狀體誘導方法，其特征在于:步驟(1)中所述消毒處理是指在超凈臺上先用濃度為70%~75%的酒精消毒10~60s，再用濃度為0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin。
【文檔編號】A01H4/00GK103548683SQ201310529396
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月31日 優先權日:2013年10月31日
【發明者】王躍華, 張玨, 王金鵬, 陳燕, 劉銀花, 宋超, 段茂華, 任鵬飛, 楊霞 申請人:成都大學