專利名稱：一種防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-l-16及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種防治香蕉枯萎病的菌株及其應用，具體涉及一種防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16及其應用。
背景技術：
香蕉枯萎病是由尖胞鐮刀菌古巴 專化型(Fusarium oxysporium f. sp.CUbenSe，F(xiàn)0C)病原真菌引起的毀滅性土傳病害，自1874年首次在澳大利亞發(fā)現(xiàn)以來，曾于1896年在巴拿馬造成大面積危害，之后逐漸傳至世界各地，是至今無法解決的世界科技難題。目前，在我國廣東、海南、廣西、云南和福建等香蕉主產(chǎn)區(qū)，香蕉枯萎病是由FOC的4號生理小種引起的，粉蕉枯萎病是由FOC的I號生理小種引起的，發(fā)病蕉園發(fā)病率一般在30-50%，重病區(qū)可達90%以上，導致香蕉減產(chǎn)、甚至絕收，是香蕉生產(chǎn)上的一個主要限制因子。迄今對該香蕉枯萎病尚無理想的抗病品種和化學藥劑，因此，結合栽培措施，施用對該病具有拮抗效果的微生物菌株，從而抑制土壤香蕉枯萎病數(shù)量，改變土壤的微生物生態(tài)結構，促進香蕉生長，提高香蕉廣譜抗病性，成為一種理想的生物防治措施。目前拮抗菌來源是通過土壤、植株本身微生物的分離與篩選得到，這種方法得到拮抗微生物通常存在定植能力弱、繁殖系數(shù)低、拮抗菌抗菌譜較窄等缺點。特別是土壤中分離得到的拮抗菌往往不能在植株體內(nèi)大量定植，防控效果不顯著。因此采用其他途徑獲得易于繁殖，抗菌范圍廣的拮抗菌尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個技術問題在于提供一種防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16，該菌株分離自有機質(zhì)與紅糖水的發(fā)酵液中，易于定植繁殖，抗菌范圍廣泛，對香蕉枯萎病I號、4號生理小種及其它香蕉常見病種如香蕉長形葉斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉大灰斑病菌、芒果鏈格孢霉葉斑病菌、荔枝炭疽菌、芒果炭疽菌等多種病原菌均具有較強的拮抗作用。本發(fā)明所要解決的第二個技術問題在于提供上述防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16在制備具有防控香蕉枯萎病作用的藥物中的用途。本發(fā)明所要解決的第三個技術問題在于提供一種防控香蕉枯萎病的制劑，該制劑含有上述防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16,該制劑對香蕉枯萎病I號、4號生理小種及其它香蕉常見病種如香蕉長形葉斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉大灰斑病菌、芒果鏈格孢霉葉斑病菌、荔枝炭疽菌、芒果炭疽菌等多種病原菌具有更好的拮抗作用，同時還對植株生長具有促生作用。本發(fā)明最后要解決的技術問題是在于提供上述防控香蕉枯萎病制劑的制備方法。本發(fā)明的所要解決的第一個技術問題是通過如下技術方案來實現(xiàn)的一種防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16，該菌株的保藏名稱為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16,分類命名為Bacillus methylotrophicus4-L_16,保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年6月26日，保藏號為CCTCC N0:M2012248。本發(fā)明中的防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16是采用平板稀釋涂布法分離自培養(yǎng)基質(zhì)餅肥、紅糖和水的混合發(fā)酵液，并經(jīng)平板對峙培養(yǎng)法篩選獲得，其中餅肥優(yōu)選為花生餅、菜籽餅和豆餅中的一種或幾種，具體分離篩選過程可以參閱下文具體實施例中的描述。本發(fā)明的第二個技術問題是通過如下技術方案來實現(xiàn)的上述防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16在制備具有防控香蕉枯萎病作用的藥物中的用途。該藥物不僅對香蕉枯萎病菌I號、4號生理小種的平板拮抗作用；對香蕉長形葉斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉大灰斑病菌、芒果鏈格孢霉葉斑病菌、荔枝炭疽菌、芒果炭疽菌等多種病原菌的也具有拮抗作用。 本發(fā)明的第三個技術問題是通過如下技術方案來實現(xiàn)的一種防控香蕉枯萎病的制劑，含有上述防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16。作為本發(fā)明的一種改進本發(fā)明所述的防控香蕉枯萎病的制劑，還含有培養(yǎng)基質(zhì)餅肥、紅糖和水，其中餅肥和紅糖的總重量與水的總重量比為1:4，培養(yǎng)基質(zhì)的C/N比為15 25 :1。所述的餅肥優(yōu)選自花生餅、豆餅和菜籽餅中的一種或幾種。本發(fā)明的最后一個技術問題是通過如下技術方案來實現(xiàn)的上述防控香蕉枯萎病制劑的制備方法，含以下步驟(I)將紅糖溶于水中得紅糖水，將餅肥置于可透氣性包裝體內(nèi)并將置于可透氣性包裝體內(nèi)的餅肥置于紅糖水中或直接將餅肥溶于紅糖水中，調(diào)節(jié)PH值為6 8，置于陰涼通風處，密封保存，得含餅肥的紅糖水溶液；(2)將含餅肥的紅糖水溶液和權利要求I中所述的防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16在25 3(TC條件下發(fā)酵7 15天，并不時攪拌保持通氣至完成發(fā)酵過程，得紅褐色溶液，過濾即得含多種微生物的抗香蕉枯萎病發(fā)酵液。本發(fā)明步驟(2)中所述的含餅肥的紅糖水溶液和防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16的體積比優(yōu)選為8 12: I。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(I)本發(fā)明首次利用培養(yǎng)基質(zhì)餅肥、紅糖和水等原料按照優(yōu)化配方直接液體發(fā)酵，通過對發(fā)酵液中產(chǎn)生的微生物進行分離，篩選得到一株對香蕉枯萎病I號、4號生理小種及其他多種病原菌均具有較好拮抗效果的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16 ；(2)由于菌株來源于生物發(fā)酵產(chǎn)生，易于定植繁殖，能夠有效抑制香蕉枯萎病菌I號、4號生理小種及其它香蕉常見病種的生長，環(huán)境安全性好，對香蕉枯萎病防控具有重要意義；(3)將本發(fā)明中的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16與其它有機質(zhì)一起制成微生物制齊U，對香蕉枯萎病I號、4號生理小種及其他多種病原菌具有更好的拮抗效果，同時還對植株生長具有促生作用；(4)同時本發(fā)明中的防控香蕉枯萎病的菌株4-L-16菌株培養(yǎng)條件簡單，繁殖速度快，易于保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應用前景。


圖I是實施例2中4-L-16菌株對尖孢鐮刀菌I號生理小種的拮抗效果；圖2是實施例2中4-L-16菌株對尖孢鐮刀菌4號生理小種的拮抗效果；圖3是實施例2中4-L-16菌株對香蕉長形葉斑病菌、芒果鏈格孢霉葉斑病菌、香蕉大灰葉斑病菌、荔枝炭疽菌、芒果炭疽菌和香蕉 炭疽菌的抑菌效果圖，其中A代表香蕉長形葉斑病菌；B代表芒果鏈格孢霉葉斑病菌；C代表香蕉大灰葉斑病菌；D代表荔枝炭疽菌；E代表芒果炭疽菌；F代表香蕉炭疽菌；圖4是實施例3中含甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16微生物菌劑對粉蕉苗期枯萎病的防控效果圖；圖5是實施例4中含甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16微生物菌劑對巴西蕉苗期枯萎病的防控效果圖。
具體實施例方式實施例I菌株的來源、分離和鑒定該菌株由菜籽餅、紅糖和水發(fā)酵液中分離得到，具體發(fā)酵液的制備方法如下將紅糖155g溶于IOOOmL水中，將菜籽餅95g溶于紅糖水中，調(diào)節(jié)紅糖水的pH值為7.0，置于陰涼透風處，密封保存，得含餅肥的紅糖水溶液；將含餅肥的紅糖水溶液置于5L容量瓶中，在180rpm，3(TC條件下，震蕩培養(yǎng)7天，過濾得紅褐色溶液劑為發(fā)酵完成的發(fā)酵液。I.發(fā)酵液中拮抗菌的分離、初篩采用平板稀釋涂布法，稀釋度(10—1 10_3)，采用PDA培養(yǎng)基對真菌的進行分離；LB培養(yǎng)基對細菌的進行分離；高氏一號培養(yǎng)基對放線菌的進行分離，分離前加入質(zhì)量百分含量為3%重鉻酸鉀抑制細菌、真菌的生長。用移液槍分別吸取上述不同稀釋度的溶液100 μ L，滴加于培養(yǎng)基平板上，用L型玻棒涂布均勻，稍晾干，倒置培養(yǎng)皿，于25 28°C溫箱中培養(yǎng)3天，根據(jù)平板上長出的菌落的顏色、形態(tài)、大小等，將不同的真菌、細菌和放線菌的單菌落挑出到新的培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，細菌、放線菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)、真菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用平板對峙培養(yǎng)法初篩拮抗菌株，初篩共獲得28株拮抗菌，將菌種凍干_20°C保存，用于進一步篩選。2.發(fā)酵液中拮抗菌的復篩采用平板對峙培養(yǎng)法，分別檢測初篩后的拮抗菌對尖孢鐮刀菌I號生理小種和4號生理小種的抑菌活性，以拮抗菌株與病原菌之間的抑菌帶寬度(cm)作為拮抗作用強弱的指標。將待測拮抗菌株在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后，在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板中央接入5mm的F0C1/F0C4菌絲塊，在距離F0C1/F0C4菌絲塊四周2. 5cm處，接種待測拮抗菌5 μ L，置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以只接種病原菌為對照，待對照剛長滿培養(yǎng)皿時。測量拮抗菌株與病原菌之間的抑菌帶寬度(cm)作為拮抗作用強弱的指標。最終篩選得到對FOCl和F0C4病原菌均有較好拮抗效果的菌株4_L_16。
3.拮抗菌的鑒定甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16的主要生物學特性為該菌為革蘭氏陽性菌，培養(yǎng)條件為LB培養(yǎng)基，37 °C，pH7. O。檢測16sRNA序列，并將序列在線提交到GENBANK上進行 BLAST 比對，發(fā)現(xiàn)其于 Bacillus amyIoliquefaciens subsp. Plantarum 和 Bacillusmethylotrophicus兩種菌的相似度菌達到99. 859 再經(jīng)生理生化鑒定最終確定,該菌為Bacillus methylotrophicus,其 16sRNA 序列可以參閱序列表 SEQ ID NO :1 所不。表I菌株4-L-16表型及生理生化特性-酶活、碳源同化

權利要求
1.一種防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16，其特征是該菌株的保藏名稱為甲基營養(yǎng)型芽抱桿菌4-L-16,分類命名為Bacillus methylotrophicus4-L-16,保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年6月26日，保藏號為CCTCCN0:M2012248。
2.權利要求I所述的防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16在制備具有防控香蕉枯萎病作用的藥物中的用途。
3.—種防控香蕉枯萎病的制劑，其特征是含有權利要求I中所述的防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16。
4.根據(jù)權利要求3所述的防控香蕉枯萎病的制劑，其特征是還含有培養(yǎng)基質(zhì)餅肥、紅糖和水，其中餅肥和紅糖的總重量與水的總重量比為1:4，培養(yǎng)基質(zhì)的C/N比為15 25 :1。
5.根據(jù)權利要求4所述的防控香蕉枯萎病的制劑，其特征是所述的餅肥為菜籽餅、花生餅和豆餅中ー種或幾種。
6.權利要求4或5所述的防控香蕉枯萎病的制劑的制備方法，其特征是含以下步驟 (1)將紅糖溶于水中得紅糖水，將餅肥置于可透氣性包裝體內(nèi)并將置于可透氣性包裝體內(nèi)的餅肥置于紅糖水中或直接將餅肥溶于紅糖水中，調(diào)節(jié)PH值為6 8，置于陰涼通風處，密封保存，得含餅肥的紅糖水溶液； (2)將含餅肥的紅糖水溶液和防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16在25 30°C條件下發(fā)酵7 15天，并不時攪拌保持通氣至完成發(fā)酵過程，得紅褐色溶液，過濾即得含多種微生物的抗香蕉枯萎病發(fā)酵液。
7.根據(jù)權利要求6所述的防控香蕉枯萎病的制劑的制備方法，其特征是步驟(2)中所述含餅肥的紅糖水溶液與防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16的體積比為8 12:1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防控香蕉枯萎病的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌株4-L-16，該菌株的保藏名稱為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16，分類命名為Bacillus methylotrophicus4-L-16，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年6月26日，保藏號為CCTCC NO:M2012248。該菌株對香蕉枯萎病1號、4號生理小種及其它香蕉常見病種均具有較強的拮抗作用。還公開了該菌株在制備具有防控香蕉枯萎病作用的藥物中的用途以及含該菌株的微生物制劑，該微生物制劑不僅對多種香蕉病原菌具有更好的拮抗作用，還對植株生長具有促進作用。
文檔編號A01P3/00GK102787084SQ20121024723
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月17日 優(yōu)先權日2012年7月17日
發(fā)明者井濤, 劉小玉, 周登博, 張錫炎, 甘東泉, 譚昕, 趙炎坤, 高祝芬, 黃霄 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所