專利名稱：一種解決大豆轉化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法
技術領域：
本發明屬于作物遺傳育種技術領域，具體涉及一種解決大豆轉化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法。
背景技術：
大豆{Glycine max L. Merrill)是屬于豆科、蝶形花亞科、大豆屬的二倍體(2n=40)植物。它起源于中國，后相繼傳入日本、歐洲、美國等地。它是人類主要植物性蛋白質來源之一，又是重要的家畜飼料和許多工業的原料，在醫學上也有很大價值。因而是一種非常重要的農作物。當生物學進入分子生物學時代以后，有關大豆的科學研究也進入快速發展的時期，尤其大豆的基因工程研究工作給生產上帶來了巨大的經濟效益。
植物遺傳轉化是一種重要和先進的育種技術，利用遺傳轉化技術已經培育出了抗除草劑的大豆品種，在幾個大豆主產國的生產上得到了大面積的推廣。目前，植物遺傳轉化的技術已經基本成熟，而最為通常的轉化是應用農桿菌介導法將外源基因導入到受體植物的細胞并整合到染色體基因組中以實現外源基因穩定的遺傳。由于在遺傳轉化過程中同時還需要應用培養基培養誘導轉化的細胞再生成為芽體，而農桿菌在完成轉化后不能夠從轉化系統中被清除掉，因此需要在完成轉化后的植物培養基中添加抗生素以抑制農桿菌的增殖，避免轉化的細胞由于農桿菌的過旺增殖而腐爛死亡。然而，抗生素除了能夠抑制農桿菌的增殖外，在大豆的組織培養系統中，抗生素的添加還嚴重地抑制了大豆芽條的生根，導致大豆在遺傳轉化處理后很難得到能夠栽培成活的完整植株。大豆芽條在含有抗生素的培養基中難以生根成了大豆遺傳轉化工作效率很低的一個重要原因。目前關于大豆嫁接技術的研究僅有極少數報道，申請號為200610017107.2的發明專利“應用嫁接技術提高轉基因大豆的遺傳轉化效率的方法”，通過農桿菌介導大豆子葉節轉化系統和胚尖轉化系統獲得的不定芽，不定芽不經過生根、煉苗過程，直接作成接穗，采用劈接的方法嫁接到大豆實生苗砧木上。該嫁接過程屬于常規嫁接(非無菌嫁接)。另外，上述嫁接切口是在砧木子葉節以上的上胚軸。嫁接切口在上胚軸，由于有兩片子葉，嫁接操作麻煩；移栽田間后，砧木子葉腋芽會長出第一對側芽，由于此處具有分化原基，去除側芽后還會不斷再長，因此需經常去側芽，增加了工作量，并且還會影響接穗的生長和結果。

發明內容
針對現有技術中大豆轉化不定芽條生根難、移栽成活率低的不足以及上述現有大豆嫁接技術中存在的缺陷和不足，本發明提供了一種大豆不定芽條的無菌嫁接方法，解決了現有技術中導致大豆在遺傳轉化處理后很難得到能夠栽培成活的完整植株的技術難題。本發明的目的通過以下技術方案予以實現
本發明將無菌萌發的大豆幼苗的下胚軸作為嫁接用的砧木，將經過遺傳轉化的大豆芽條作為接穗，嫁接到砧木上，接穗芽條利用下胚軸下方的胚根而不需要重新形成根系，嫁接時在無菌條件下進行，不需要繁瑣的捆綁固定接穗和砧木操作。接穗芽條經過嫁接后能夠和砧木愈合成為一棵完整和能夠移栽成活的植株，能夠正常地生長發育、開花和結實，其嫁接苗成活率為100 %。具體地，本發明提供一種解決大豆轉化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法，包括以下步驟
Ca)將經過常規農桿菌介導的遺傳轉化處理和篩選的大豆芽條從母體上分割開，作為接穗；
(b)大豆種子經常規方法滅菌后接種到培養基上，25°C黑暗培養，取31天齡小苗，在子葉下方5mm處橫切，棄除上方的子葉和上 胚軸，得到帶有胚根的下胚軸，作為砧木；
其中所述培養基為含有(T2mg/L BA (芐氨基腺嘌呤)的MSB5培養基，包括MS配方的無機成分+B5配方的有機成分+25 g/L鹿糖+100 mg/L肌醇+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊月旨，ρΗ5· 8 6. O。培養基在121 °C、0. I MPa的條件下滅菌20分鐘；
(c)在無菌條件下，將步驟(a)獲得的接穗嫁接到步驟(b)獲得的砧木上；
Cd)將嫁接有接穗的砧木轉移到與步驟(b)相同成分的培養基上，光照培養；
(e)待接穗和砧木接口愈合，接穗芽條有明顯的伸長生長后，取出嫁接苗，進行栽種。在優選的實施方式中，所述步驟(b)中培養基為無激素的MSB5培養基。在優選的實施方式中，所述步驟(b)中小苗的苗齡為5天。在優選的實施方式中，所述步驟(b)橫切位置應在子葉下方5mm左右處。 在優選的實施方式中，步驟(c)所述嫁接可以采用插接法或者劈接法
(Cl)插接法在下胚軸切口中央挖一 5毫米深小孔，刮掉芽條的莖基部的表皮，然后插到小孔中完成嫁接；
(c2)劈接法在砧木形態學上端橫切面的中部豎著向下切出深O. 5厘米的切口，把芽條基部切成“V”型，小心插入砧木切口中完成嫁接。本發明的有益效果是
本發明創造性地設計將無菌萌發的大豆幼苗的下胚軸作為嫁接用的砧木，將經過遺傳轉化的大豆芽條作為接穗，嫁接到砧木上，通過一種無菌嫁接的方法客服現有技術中大豆轉化不定芽條生根難、移栽成活率低的不足。接穗芽條利用下胚軸下方的胚根而不需要重新形成根系，嫁接時在無菌條件下進行，不需要繁瑣的捆綁固定接穗和砧木操作。接穗芽條經過嫁接后能夠和砧木愈合成為一棵完整和能夠移栽成活的植株，能夠正常地生長發育、開花和結實，其嫁接苗成活率為100 %，有效解決了現有大豆轉化不定芽條難以生根的技術難題，克服了嫁接成活率低的技術缺陷。


圖I插接法砧木(左)和接穗(右)
圖2插接法嫁接完成時的情況
圖3劈接法砧木(左)和接穗(右)
圖4劈接法嫁接完成時的情況 圖5嫁接后開始培養的情況 圖6嫁接后培養20天的情況 圖7嫁接苗移栽成活的情況
具體實施例方式 下面結合附圖和具體實施例以及比較實施例進一步詳細說明本發明。實施例I
(a)用鋒利的小刀將經過常規農桿菌介導的遺傳轉化處理和篩選的大豆芽條從母體上分割開O. 7cm，然后再輕輕刮去芽條的莖的基部的表皮，作為接穗，如附圖I右；
(b)選取干凈飽滿的成熟大豆種子，經常規滅菌后接種到不含激素MSB5的培養基上，25 °C黑暗培養，分別取5天齡小苗，在子葉下方5mm處橫切，棄除上方的子葉和上胚軸，得到帶有胚根的下胚軸，作為砧木，如圖I左。所述不含激素MSB5的培養基組成為MS配方的無機成分+B5配方的有機成分+25 g/L鹿糖+100 mg/L肌醇+300 mg/L蛋白胨+7 g/L瓊脂，pH 6. O ； (c)用合適粗細的針狀物(牙簽、竹簽、針等)垂直插入下胚軸切口中央5毫米后拔出，然后小心將上述接穗準確穩妥地插入到針狀物拔出后產生的小孔中，完成嫁接，見附圖2所示；
(d)用鑷子夾住已經嫁接有接穗的砧木下胚軸，小心地將胚根朝下轉移到不含激素的MSB5培養基上(同步驟(b))，用鑷子夾住下胚軸根莖處往下輕壓稍作固定，在光照時間每天12小時的組織培養室內條件下培養；
(e)待接穗和砧木接口愈合，接穗芽條有明顯的伸長生長后，即可將嫁接苗取出培養瓶，洗凈根上的培養基后，即可栽種到干凈的細砂基質中，并在栽種的早期進行常規方法的組培苗保濕。實施例2
(a)用鋒利的小刀將經過常規農桿菌介導的遺傳轉化處理和篩選的大豆芽條從母體上分割開O. 7cm,將芽條基部切成“V”型，作為接穗，如附圖3右所示；
(b)選取干凈飽滿的成熟大豆種子，經常規滅菌后接種到不含激素的MSB5培養基上，25°C黑暗培養，分別取5天齡小苗，在子葉下方5mm處橫切，棄除上方的子葉和上胚軸，得到帶有胚根的下胚軸，作為砧木，如附圖3左所示；所述不含激素MSB5的培養基組成為MS配方的無機成分+B5配方的有機成分+25 g/L鹿糖+100 mg/L肌醇+300 mg/L蛋白胨+7 g/L 瓊脂，pH 6. O ；
(c)用解剖刀在砧木形態學上端橫切面的中部豎著向下切O.5厘米，再把所述接穗小心插入站'木切口中完成嫁接，如附圖4所不；
Cd)用鑷子夾住已經嫁接有接穗的砧木下胚軸，小心地將胚根朝下轉移到不含激素的MSB5培養基上，用鑷子夾住下胚軸根莖處往下輕壓稍作固定，在光照時間每天12小時的組織培養室內條件下培養；
(e)待接穗和砧木接口愈合，接穗芽條有明顯的伸長生長后，即可將嫁接苗取出培養瓶，洗凈根上的培養基后，即可栽種到干凈的細砂基質中，并在栽種的早期進行常規方法的組培苗保濕。下表I給出了實施例f 2兩種方法獲得的嫁接苗生長情況結果，
表I插接法和劈接法的嫁接效果比較
嫁接方法I嫁接成活率/% I苗高增加量/m I根數增加量/條I根長增加量/Cm I鮮重增加量/g插接法 IlOO|o. 80|θ8|l3. 77|θ· 5權利要求
1.一種解決大豆轉化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法，其特征在于包括如下步驟 Ca)將經過常規遺傳轉化處理和篩選的大豆芽條從母體上分割開，作為接穗； (b)大豆種子經常規方法滅菌后接種到培養基上，25°C黑暗培養，取:Γ8天齡小苗，在子葉下方5mm處橫切，棄除上方的子葉和上胚軸，得到帶有胚根的下胚軸，作為砧木； 其中所述培養基為含有(T2mg/L BA的MSB5培養基； (c)在無菌條件下，將步驟(a)獲得的接穗嫁接到步驟(b)獲得的砧木上； Cd)將嫁接有接穗的砧木轉移到與步驟(b)相同組成的培養基上，光照培養； (e)待接穗和砧木接口愈合，接穗芽條有明顯的伸長生長后，取出嫁接苗，進行栽種。
2.如權利要求I所述的解決大豆轉化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法，其特征在于步驟(b)所述MSB5培養基含有Omg/L的BA。
3.如權利要求I所述的解決大豆轉化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法，其特征在于步驟(b)所述小苗的苗齡為5天。
4.如權利要求I所述的解決大豆轉化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法，其特征在于步驟(c)所述嫁接是采用插接法，在下胚軸切口中央挖一小孔，所述小孔深5毫米；刮掉芽條的基部的表皮，然后插到小孔中完成嫁接。
5.如權利要求I所述的解決大豆轉化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法，其特征在于步驟(c )所述嫁接是采用劈接法，在砧木形態學上端橫切面的中部豎著向下切出切口，所述切口深O. 5厘米，把芽條基部切成“V”型，插入砧木切口中完成嫁接。
全文摘要
本發明公開了一種解決大豆轉化不定芽條難以生根的無菌嫁接方法。本發明以無菌萌發的大豆幼苗的下胚軸作為砧木，將經過遺傳轉化的大豆芽條作為接穗嫁接到砧木上，接穗芽條利用下胚軸下方的胚根而不需要重新形成根系，嫁接時在無菌條件下進行，不需要繁瑣的捆綁固定接穗和砧木操作，接穗芽條經過嫁接后能夠和砧木愈合成為一棵完整和能夠移栽成活的植株，能夠正常地生長發育、開花和結實，其嫁接苗成活率為100%，有效解決了大豆轉化不定芽條難以生根的技術難題。
文檔編號A01H4/00GK102870604SQ20121036858
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者楊躍生, 劉穎, 于磊, 金亞紅, 郭振飛, 年海 申請人:華南農業大學