專利名稱：源于稻瘟病菌的真菌致病性基因MoMon1及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物病理學和微生物基因工程領域，提供了一個來源于稻瘟病菌的、在營養生長、孢子產生、附著胞形成、自噬過程與致病性中起重要作用的新基因MoMonl的編碼區的核苷酸序列及其編碼蛋白質的氨基酸序列。
背景技術：
由稻痕病菌(Magnaporthe Oryzae)引起的稻痕病是世界性的一種水稻上的毀滅性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻產量損失在1(T30% 之間。我國幾乎每年都有稻瘟病菌的流行爆發。最近的2005年，四川省和重慶市遭受到10年來最嚴重的稻瘟病，四川省共有20個市、127個縣的230萬畝稻田發生稻瘟病，重慶市共有100多萬畝稻田發生稻瘟病菌；這次稻瘟病流行迅速、危害程度重、發病水稻品種多、對水稻產量影響嚴重。除了水稻外，稻痕病菌也能侵染其它50多種禾本科植物,也對小米(Eleusine coracana)、大麥(Hordeum vulgare)、小麥(Triticum aestivum)等重要農作物造成嚴重的危害。稻痕病菌也是一種研究植物病原真菌一寄主植物相互作用的模式生物，具有許多病原真菌共有的植物致病侵染循環，包括孢子產生、萌發、附著胞形成、侵染栓形成、侵入菌絲生長等致病過程；許多發達國家正在進行研究其致病分子機制，期望通過此類研究設計出新型農藥篩選的藥靶，從而開發、設計新型抗真菌藥物。稻瘟病菌的生活史包括有性階段和無性階段。有性階段由2個不同交配型的菌株交配后產生子囊和子囊孢子。稻瘟病菌的交配型由交配基因MATl — I和MATl — 2控制。無性階段為營養菌絲分化產生分生孢子梗和梨形分生孢子。在自然界，稻瘟病菌主要通過無性階段完成生活史，而分生孢子是植物的主要侵入源。稻瘟病菌無性孢子落到水稻葉片表面后，侵染過程開始。當孢子與水相遇后，孢子頂端分隔內的粘膠釋放出來，使孢子緊緊粘附在水稻葉片表面。水稻葉片表面具有一層蠟質角質膜，該膜具有很大的疏水性，而粘膠使孢子粘附在這一疏水的排斥性表面。粘附后2小時內，孢子萌發并產生芽管。芽管通常從孢子的一個頂端細胞伸出并生長。芽管頂端也分泌一種粘膠物質，使芽管緊緊粘附在植物葉片表面，防止被水滴沖走。4小時內，芽管生長停止，頂端鉤狀體形成并膨大形成附著胞。基質的硬度是芽管分化的一個重要因子，如稻瘟病菌孢子僅在硬的固體表面形成附著胞，而不能在液體表面或軟基質表面形成附著胞。而基質疏水表面也通過類似于水稻葉片表面的蠟質的作用激發附著胞的形成。在孢子萌發后不久，產生芽管的細胞進行一次有絲分裂。一個細胞核留在孢子內，而另一個細胞核通過芽管移動，與孢子和芽管的細胞質內容物一起轉移到形成中的附著胞。這些細胞質內容物包括儲存在正在發育的附著胞中央大液泡的脂滴。然后，在附著胞和芽管之間形成隔膜。隨著附著胞成熟，附著胞細胞壁出現黑色素沉積，最終形成黑色素層。黑色素層允許水分子自由通過，但溶解于水的物質不能自由通過，從而讓附著胞建立并維持一個很大的細胞內膨壓。附著胞的黑色素化過程完成后，附著胞產生一根狹小的菌絲一侵染栓。侵染栓對水稻葉片的穿透由于附著胞產生巨大的膨壓而得以完成。膨壓只要稍微降低就會阻止附著胞在人工表面或水稻葉片表面穿透。測量結果表明附著胞膨壓達到8. OMpa，相當于40倍汽車輪胎的壓力。附著胞黑色素層的作用在于限制了細胞壁的滲透性，有利于細胞內滲透物質的積累和膨壓的產生。甘油是一種可溶性物質，產生的滲透勢足以使附著胞產生巨大的膨壓。在膨壓產生過程中，甘油在細胞內累積濃度超過3M。侵入后，侵染栓分化成侵染菌絲，迅速在水稻葉片內生長并侵染其它細胞。侵入72小時后，病原菌生物量已經達到感染葉片的10%。5 7天后，分生孢子梗上分化出大量新的分生孢子，并從病斑釋放出來。這些新形成的孢 子被潮濕的空氣帶到鄰近的植物開始新的侵染過程。在冬天，稻瘟病菌以菌絲和分生孢子形式在稻草和稻谷上越冬，完成侵染循環。稻瘟病菌的致病過程是一個復雜的分子過程。目前已經克隆了許多與稻瘟病菌致病性相關的基因，如MPGl、CPKA、PMKl、MAGB、PLSl、SMOl、PDEl、MPSl、PTHlI、CBPl、ICLl、BUF1、ALB1、ACR1、RSY1、HEX1。其中多數與附著胞形成有關，如PMK1、MAGB、MAC1等；部分參與黑色素的形成和積累(ALB1、RSYl、BUFl等)以及甘油合成相關(ICLl等)；少數與稻瘟病菌的穿透相關(MPS1、PLS1、H)E1等)。稻瘟病菌芽管分泌的一種疏水蛋白，由MPGl基因編碼，參與菌絲和水稻葉表的互作，為形成正常的附著胞所必須(Talbot，1999)。MAGB基因編碼的異源三聚G蛋白的a亞單位和MACl編碼的cAMP環化酶也是形成附著胞所必需的(Liuand Dean, 1997; Choi and Dean, 1997; Kulkarni and Dean, 2004)。CPKA 基因編碼的cAMP依賴性蛋白激酶A的催化亞單位PKA-c是附著胞穿透所必須的(Mitchell & Hamer,1995 ； Xu et al，1997)，而正在分化的芽管中的PKA活性對于形成正常的附著胞也非常關鍵(Adachi & Hamer 1998 )。同樣,有絲分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinase, MAPK)基因PMKl是附著胞形成所需的(Xu & Hamer 1996)。黑色素合成系列基因也證明是附著胞穿透所不可缺少的(Chumley and Valent, 1990 ；Motoyama等，1998)。在各種突變子庫中也發現了一些突變子缺失致病性，如編碼一種與ATP運輸體(ATP-binding cassette transporters )相關的蛋白的 ABCl 基因(Urban等，1999)、編石馬P-型ATP酶的F1DEl基因(Balhadere等，1999，2001)和編碼tetraspannin樣蛋白的PLSl基因(Clergeot等，2001)。盡管如此，稻瘟病菌的分子致病機制還是不清楚。鑒定、克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是與侵入過程相關的基因，可以為設計、篩選抗真菌藥物提供有用的靶標位點。目前已經在包括稻瘟病菌在內的一些真菌中證明了一些藥物的靶點，如三環唑是一種很重要的稻瘟病菌殺菌劑，其作用是抑制黑色素的合成，靶點是稻瘟病菌的三羥萘還原酶；多肽殺菌劑sorphen A的作用靶點是青霉的脫甲基酶(CYP51)。因此，利用分子生物學技術鑒定、克隆新的在稻瘟病菌的致病過程中具有重要功能的致病性基因，可以為設計、篩選新的抗真菌藥物提供有用的藥物靶點。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種新的、對稻瘟病菌等真菌的菌絲生長、分生孢子產生和萌發、附著胞形成以及致病性有重要影響的基因MoMonl及該基因的用途。為了解決上述技術問題，本發明提供了一種源于稻瘟病菌的真菌致病性基因MoMonl，該基因的核苷酸序列或其互補鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示。本發明同時提供了上述基因MoMonl編碼的cDNA序列，該cDNA序列具有SEQ IDNO :2所示的核苷酸序列。
本發明同時提供了上述基因MoMonl編碼的蛋白質，該蛋白質具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。本發明還同時提供了上述基因MoMonl的用途基因MoMonl的表達作為用于設計和篩選抗真菌藥物的靶標。本發明還同時提供了上述蛋白質的用途蛋白質的表達和修飾作為設計和篩選抗真菌藥物的靶標。本發明通過同源序列比對，在稻瘟病菌中克隆了與液泡融合相關的基因MoMonl，并且對其進行了同源序列的比對和進化分析，結果說明MoMonl基因在真核生物中的保守性很高。本發明揭示了稻瘟病菌MoMonl基因可以互補酵母Monl基因缺失突變體，恢復突變體液泡的部分形態；說明了稻瘟病菌MoMonl基因在功能上與酵母Monl基因同源。
本發明通過構建MoMonl基因同源置換載體，利用農桿菌介導的轉化將載體轉入到野生型稻瘟病菌，得到了基因缺失突變體AMoMonl ;在基因缺失突變體AMoMonl中，重新引入MoMonl基因，突變體的表型恢復，并且進行了表達水平上的檢測。本發明對稻瘟病菌MoMonl基因進行了細胞定位，該基因在稻瘟病菌分生孢子、附著胞和菌絲的細胞質中不均勻表達；在附著胞形成后熒光則主要定位在分生孢子的液泡上。本發明對細胞內運輸途徑進行觀察，AMoMonl突變體細胞自噬途徑受阻；液泡的形態改變；細胞內與液泡相關的物質運輸途徑受到影響；細胞壁的完整性被破壞。本發明分析了基因缺失突變體AMoMonl的基本表型，稻瘟病菌MoMonl基因缺失，氣生菌絲變得非常稀疏；產孢能力顯著下降，附著胞形成受阻；育性受到影響；對水稻和大麥的致病性喪失。本發明還提供了利用上述基因MoMonl的表達作為靶標，在設計和篩選抗真菌藥物中的應用。本發明還提供了利用上述蛋白質的表達與修飾作為靶標，在設計和篩選抗真菌藥物中的應用。本發明所稱的抗真菌藥物包括抗稻癒病菌(Maaiaporthe Oryzae )、玉米赤霉病菌(Gibberella zeae)、禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)、小麥穎枯病病菌(Phaeosphaeria nodorum)或玉米黑粉病菌(Ustilago maydis)的藥物。本發明所涉及的基因因為同源重組造成的基因缺失突變導致稻瘟病菌菌絲稀疏、產孢量下降以及附著胞形成率下降，并且在感病水稻品種上的致病力缺失。因此，本發明最重要的用途是應用上述成果，設計和篩選能夠破壞該基因的表達、剪切及其編碼蛋白的表達的化合物，或設計和篩選能對該蛋白的氨基酸序列進行修飾的化合物，從而開發出新的抗真菌藥物。此外，本發明的用途還包括利用該基因的DNA或cDNA序列作為探針在其它真菌中分離與該基因具有一定序列同源性的序列。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖I :不同真核生物Monl氨基酸序列比對。利用ClustalW軟件(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)進行了序列比對。不同真核生物Monl基因在GenBank里的登陸號稻瘟病菌(M. oryzae) (JN845639)，釀酒酵母(S. cerevisiae) (CAA96832. I)，鵝掌柄抱殼(Podospora anserine) (XP_001908681. I),油菜莖基潰瘍病菌(Leptosphaeriamaculans) (CBX983O3. I),黑抱塊菌(Tubermelanosporum) (XP_002839031. I),構巢曲霉(Aspergillus nidulans) (XP_659697. I)，小麥殼針抱(Mycosphaerella graminicola)(EGP83322. I)和產黃青霉(Penicillium chrysogenum) (XP_002557860. I)。* 代表比對相同的氨基酸；一代表間隔。圖2: Monl基因在不同真核生物中的進化發育。真核生物中Monl同源基因在 GenBank 里的登陸號M. oryzae (MoMonl), S. cerevisiae (CAA96832. I),N.crassa (XP_959164. 2), M. musculus (NP_766603. I), H. sapiens (NP_115731. 2),D. melanogaster (NP_608868.I), Gibberella zeae (XP_387259.I), Trichodermareesei (EGR50254. I), Neurospora tetrasperma (EG052340. I), Fusarium oxysporum(EGU75269.I), Aspergillus clavatus (XP_001272699.I), Phaeosphaeria nodorum(XP_001802326. I), Chaetomiumglobosum (XP_001220171. I). MEGA4. O 軟件 NJ 法(Neighbor-joining),以1000次自展值(bootstrap)重復來評價進化樹分支可信度。圖3 pMD18-MoMonl 載體經 EcoRI 和 XbaI 酶切結果。 圖4: PCR驗證轉化了稻瘟病菌MoMonl基因的酵母突變體(6、12、19分別代表YM-6、YM-12、YM-19 ；m :陽性對照；空陰性對照)。圖5 :酵母液泡形態觀察A:酵母野生型菌株(WT);B: MoMonl基因互補酵母(S.cerevisiae) Amonl 突變體；C:酵母(S. cerevisiae) Amonl 突變體。圖6 :基因置換載體1300-MoMonl的構建策略。圖7 MoMonl基因的目標置換。圖8 :部分稻瘟病菌轉化子PCR檢測結果。圖9 Southern雜交驗證MoMonl的敲除。圖10 =TMHMM模型預測蛋白跨膜區。紅色表示跨膜區，藍色表示細胞膜內側，粉紅色表示細胞外膜側。圖11 : pGFP-MoMonl載體構建示意圖。圖12 : MoMonl基因在細胞中的定位。GFP-MoMonl融合蛋白在菌絲、分生孢子和附著胞中的表達。標尺= 0.5 u mo圖13 :菌株在CM培養基上的生長特性。圖14 : AMoMonl突變體的產孢量。圖15 :Guyll、AMoMonl和Com-12分別與2539的交配(交界處箭頭所指黑色斑
點為子囊殼)。圖16 分生孢子的誘導萌發(A :附著胞，C :分生孢子)標尺=10. 0 Um0圖17 :細胞自噬過程被阻斷a :液體CM培養基中正常生長的菌絲；b =MM-N饑餓誘導后的菌絲。箭頭位置為自噬泡。圖18 :基因MoMonl缺失影響了液泡的生長發育(標尺=5. 0 ii m)。圖19 :菌株對Monensin敏感性測定。圖20 : A MoMonl 突變體對藥劑敏感性增強。a: Congo Red (200 mg/ml); b: SDS(0.01%); c: caffeine (2 mM)。圖21 :離體大麥葉片上的致病性測試。
圖22 :在水稻葉片上的致病性測試(噴霧接種)。I =Guyll ；2 : AMoMonl突變體；3 Com-12 ；4 :0. 2% :明膠作對照。圖23 :在水稻根部的致病性測試(菌塊接種)。I : AMoMonl突變體；2 =Guyll ；3 :未接菌對照;4:Com-12。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。實施例I :MoMonl基因的分離和克隆從 http://www. yeastgenome. org/ 網站搜索獲得 Saccharomyces cerevisiaeMonl/YGL124C基因的蛋白序列，在稻瘟病菌基因組數據庫中http://Ww.broadinstitute. org/annotation/genome/magnaporthe_grisea/MultiHome. html 通過blastP進行同源序列搜索，獲得一個預測蛋白MGG_05755. 6，命名為MoMonl。為了研究MoMonl基因的功能,從稻痕病菌野生型菌株Guyl I (Magnaporthe oryzae Guy-11)的基因組中，利用引物McDNApl和McDNAp2克隆了 MoMonl基因全序列，并且連接到pUCm_T載體上，進行了測序；同時，在野生型菌株Guyll的孢子萌發2h的cDNA文庫中克隆了該基因的編碼序列，I 893bp，并且連接到pUCm-T載體上，進行了測序分析。DNA序列見SEQ ID NO 1(即，序列表的N01)，CDNA序列見SEQ ID NO 2 (即，序列表的N02)。預測稻瘟病菌MoMonl基因編碼一個液泡融合相關蛋白，編碼631個氨基酸(SEQID NO :3中表示終止子的“星號”被省略)(即，序列表的N03)，約158kDa。在有關蛋白結構的報道中，將Monl基因分類到SAND家族，雖然在這個家族已知的結構域中沒有發現典型的相似性。SAND 家族在植物(Arabidopsis thaliana)、果妮(Drosophila melanogaster)、線蟲(Caenorhabditis elegans)和酵母(S. cerevisiae)等多種生物中都有存在,是一個功能和進化上都非常保守的蛋白。MoMonl具有保守的結構域，在與液泡相關的融合過程中發揮重要的作用。利用ClustalW對稻瘟病菌MoMonl與其它真核生物進行同源序列的比對(http://www. ebi. ac. uk/clustalw/),比對結果再經過GENED0C軟件進行適當調整獲得最佳匹配。結果表明，MoMonl 與曲霉(Aspergillus oryzae，XP_001819506. 2)有 91% 的相似性;與赤霉(Gibberella zeae, XP_387259. I)有 96% 的相似性，里氏木霉(Trichodermareesei, EGR50254. I) 93%的相似性。稻瘟病菌MoMonl與其它真核生物同源序列比對的部分結果見圖I。用MEGA4.0軟件NJ法(Neighbor-joining)構建的進化樹見圖2。實施例2 =MoMonl同源性分析為了證明稻瘟病菌與酵母的Monl功能的相似性，利用引物YES-M-Pl和YES-M-P2克隆了稻瘟病菌MoMonl的編碼區，含有起始密碼子ATG但不含終止密碼子TAA，引物酶切位點 EcoRI 和 XbaI。弓丨物YES-M-PI 的序列為CGGAATTCATGGCTCAAGAAGACCAT，引物YES-M-P2 的序列為GCTCTAGATTAAAATACACCGCCACC。PCR 體系為(50 U I):梭板DNA約IOOng
Taq polymerase5U
IOxbuffer (+MgCl2)5pJ
dNTP (25mmoI/L, each)0.4^1
SO^mol/L upper primer0,5jxl
50^imol/L lower primer0.5卩I
dd 11 .■；()至50plPCR擴增程序為 I. 94°C預變 5 分鐘2. 94°C 30 秒3. 52 °C 30 秒4. 720C (I 分鐘 /lkb) 2 分鐘2-4. 35 個循環5. 72 0C 10 分鐘6. 40C 保溫。PCR產物連接到pMD18-T載體上，得到載體pMD18_MoMonl ;利用EcoRI和XbaI酶切載體pMD18-MoMonl，回收MoMonl的編碼區片段，約2kb ;選擇經過EcoRI和XbaI酶切驗證正確的克隆(圖3，即表現為pMD18-MoMonl經雙酶切后有目的帶2kb出現和約3kb大小的PMD18-T載體)；回收MoMonl的編碼區片段連接到pYES2載體(含有GALl強啟動子，誘導基因的表達)相應的EcoRI/Xbal位點，得到載體pYES- MoMonl。應用醋酸鋰/PEG酵母小量轉化的方法轉化酵母Monl基因缺失突變體AMonl (根據實施例3制備而得)，轉化得到的轉化子用尿嘧啶缺乏選擇培養基(SC-U)篩選。挑取能夠在SC-U選擇培養基上生長的單菌落，繼續在SC-U的液體培養基上篩選，30° C，200 rpm/min振蕩培養過夜。然后將菌液各取10 ill移至新的YH)液體培養基中再次培養。30° C，200rpm/min振蕩培養過夜后，提取酵母質粒。以質粒DNA為模板,用Monl_yzpl和Monl_yzp2引物對篩選菌株進行PCR驗證，取pYES2空載體質粒作陰性對照，pYES-MoMonI質粒作陽性對照(圖4)，對PCR有條帶的菌株進行單菌落分離。引物Monl_yzpl 的序列為GGAGATCAACCGCAAGAGCCGCG引物Monl_yzp2 的序列為GCAGTGTCAGGGTGGAAAGAATCPCR體系為等同于實施例2 ；PCR擴增程序為I. 94°C預變 5 分鐘2. 940C 30 秒3. 55 0C 30 秒4. 720C (I 分鐘 /lkb) 50 秒2-4. 25 個循環5. 72 0C 10 分鐘
6. 4°C 保溫。隨機挑取有條帶的酵母突變體菌株YM-6、YM-12和YM-19，在液體YPD培養基上過夜培養后，在顯微鏡下觀察酵母液泡的形態。觀察發現，在酵母Monl基因缺失突變體AMonl中，存在大量小而呈碎片狀的液泡；而野生型菌株(WT)中則只有一個典型的曲線圓滑且大的液泡。同樣，轉化了稻瘟病菌MoMonl基因的酵母菌株YM-6、YM-12和M-19中也含有典型的曲線圓滑的大液泡，雖然也有部分細胞中含有多個小液泡，但是小液泡的外形非常規整，未呈破碎狀(圖5)。可見，稻瘟病菌MoMonl基因可以互補酵母Monl基因缺失突變體，使其恢復部分細胞生長過程，至少是與液泡有關的部分途徑或者液泡的生長發育得到恢復。由此可以推斷，稻瘟病菌MoMonl基因與酵母Monl基因在結構和功能上是同源的。實施例3 =MoMonl基因缺失突變體和互補突變體的獲得3. I MoMonl基因敲除載體的構建 利用引物Monl-uppl和Monl_upp2,以野生型Guyll基因組為模板,擴增I. 02 kb含有Xhol/Sall位點的MoMonl基因上游片段，連接到pbs_HPHl載體的Xhol/Sall位點，得到載體 pBS-MoMonlup ;同樣的利用引物 Monl-lowpl 和 Monl_lowp2 獲得 I. 0 kb Pstl/Xbal下游片段，連接到pBS-MoMonlup的Pstl/Xbal位點，得到載體pBS_MoMonl。最后用XhoI和XbaI雙酶切，將MoMonlup-HPH-Monllow大片段從pBS上切下來，并連接到1300X的XhoI/XbaI酶切位點，最終得到置換載體1300-MoMonl。具體構建方法見圖6。3.2 AMoMonl突變體的獲得包含MoMonl基因上游序列-潮霉素抗性基因_下游片段的1300-MoMonl載體轉化到農桿菌中后，通過ATMT方法利用農桿菌轉化稻瘟病菌野生型菌株Guyll。在基因置換過程中，大部分外源DNA插入到稻瘟病菌的基因組中，由于兩端同源序列的存在，部分會發生同源置換，同源置換的過程見圖7。試驗中總共得到56個轉化子，提取所得轉化子的基因組DNA，利用Monl_yzpl和Monl_yzp2引物進行PCR驗證，其中部分轉化子PCR產物電泳沒有497bp的目的條帶(圖8)，初步斷定這些沒有目的條帶的轉化子為基因置換突變體(這部分被潮霉素抗性基因替換)。選取其中三個突變體monl-12、monl-35和monl-49大量提取基因組DNA,進行Southern雜交驗證。用ApaI對monl-12、monl-35和monl-49的基因組進行酶切，野生型Guyll為對照，引物Monl-Iowpl和Monl_lowp2的PCR擴增產物，
I.Okb的片段，合成雜交探針。雜交結果顯示，野生型Guyll菌株在3. 87kb處有雜交信號，而monl-12、monl-35和monl-49在7. 5kb處有雜交信號并且是單拷貝，該雜交結果證實了monl-12、monl_35和monl-49為MoMonl基因缺失突變體(圖9)。選取monl-35進行單抱分離并保存進行后續試驗。3.3互補載體的構建為了驗證突變體的表型是因為基因MoMonl的缺失引起的，構建了互補載體P1300SUR-M0N1。利用引物P-M-Lpl和P_M_Lp2擴增了含有I. 5 kb的上游序列和0. 98 kb下游序列的全長MoMonl基因，克隆到pUCm-T載體。用EcoRI和XbaI雙酶切后，回收4. 38kb的MoMonl基因片段，連接到pCAMBIA1300X-SUR載體的EcoRI/Xbal位點上，獲得互補載體pl300SUR-M0Nl。選擇標記基因SUR擴增自pCB1532載體并且連接到pCAMBIA1300X的EcoRV/EcoRI位點，構成pCAMBIA1300X-SUR。將pl300SUR_M0Nl載體轉化到農桿菌中后，通過ATMT方法利用農桿菌轉化稻瘟病菌突變體A MoMonl。
由于MoMonl缺失突變體和野生型的差異非常大，互補后，缺失突變體的表型得到恢復。結合PCR驗證和氯嘧磺隆抗性篩選(在DCM培養基上MoMonl缺失突變體和野生型菌株對100 u g/mL濃度的氯嘧磺隆敏感不能生長，而互補菌株因為含有氯嘧磺隆抗性而正常生長)可以推斷，AMoMonl表型的變化是由MoMonl基因的缺失引起的。選取互補菌株Com-12進行后續試驗。3. 4 RT-PCR 和 QP CR為了確定突變體在表達水平上缺失基因MoMonl，進行了實時熒光定量PCR(QPCR)0分別提取野生型Guyll，突變體AMoMonl和互補型Com-12菌株的總RNA，利用引物MqRTpl和MqRTp2進行RT-PCR，以微管蛋白(P -tubulin)為內參進行QPCR。循環條件是50° C，2 分鐘；95° C，30 秒；循環 95° C，5 秒；58° C，31 秒，40 個循環，60° C 讀取熒光；融解曲線從72° C到60° C 0.5° C遞減，每個溫度都讀取熒光。數據分析利用Mastercycler ep realplex軟件。結果的計算按照(Livak et al. , 2001)的方法,野生型Guyll中，基因MoMonl的表達量約是突變體AMoMonl中表達量的I. 2 X IO3倍，互補型Com-12約是突變體AMoMonl中表達量的I. 8X IO3倍，相對表達量都很高。由此可以得出，基因缺失突變體A MoMonI沒有MoMonI基因的表達，說明A MoMonI中的MoMonI基因被替換。而Com-12恢復了 MoMonl基因的表達。實施例4 =MoMonl基因的細胞內定位4. I MoMonl蛋白的結構預測Monl是一個液泡融合相關蛋白，我們推測該蛋白可能結合在液泡膜上發揮作用，因此使用 TMHMM 模型(http://genome, cbs. dtu. dk/services/TMHMM/)預測了 MoMonl 的跨膜區。結果顯示該蛋白沒有明顯的跨膜區域(圖10)，表明MoMonl與液泡膜的結合可能是一種瞬時行為，或者MoMonl是一種輔助因子，調控其他蛋白與液泡膜的結合。4. 2通用載體pl300RPGFP的構建首先以稻瘟病菌野生型菌株Guyll的基因組為模板擴增RP27啟動子(ribosomalprotein 27 promoter),酶切位點為Smal/Ncol ;然后將RP27片段插入到pEGFP載體的Smal/Ncol酶切位點處，構建形成pRP_EGFP載體；以pRP-EGFP載體為模板擴增出含有RP27的EGFP基因；然后將該片段與T載體連接克隆后酶切插入到pBlueSCript_SK (+)載體的EcoRI/PstI位點，形成pBS-RPGFP載體。以pBARKSl質粒為模板擴增選擇標記基因Bar。隨后將Bar克隆酶切后連接到pBS-RPGFP載體的Clal/EcoRV位點。最后將同時含有Bar基因、EGFP基因以及RP27啟動子的大片段用XhoI/SacI雙酶切，連接到pCAMBIA1300載體的XhoI/SacI位點，最終構成pl300RPGFP熒光表達通用載體。4. 3 GFP-MoMonl融合載體的構建為了研究MoMonl基因在稻瘟病菌中的空間表達情況，構建了載體pGFP- MoMonl。首先構建了在MoMonl基因自身啟動子的作用下的GFP融合載體，但是轉化后得到的突變體熒光表達非常弱，因此改用稻瘟病菌本身一個強啟動子RP27重新構建熒光載體。利用引物McDNApl和McDNAp3擴增含有終止密碼子(TAA)的MoMonl基因編碼序列并連接到P1300RPGFP的相應SpeI酶切位點，挑取經過酶切驗證以及連接方向驗證正確的載體，最終得到載體PGFP-MoMonl (示意圖見圖11)。載體pGFP-MoMonl直接利用ATMT方法轉化稻瘟病菌MoMonl基因的缺失突變體AMoMonl。經過PCR、QPCR以及草胺磷抗性(200 y g/ml)的篩選得到MoMonl的熒光表達突變體RP-MGFP。綠色熒光蛋白GFP基因與MoMonl基因在RP27啟動子的作用下融合表達。4.4熒光觀察CM液體培養基上培養突變體RP-MGFP，挑取分生孢子和菌絲，在共聚焦熒光顯微鏡Leica TCS SP5下觀察，可以看到熒光在分生孢子、菌絲的細胞質和液泡上均有表達。在分生孢子萌發16個小時后，熒光依然是不均勻分布。將分生孢子的懸浮液(IO5個/ml)滴到塑料蓋玻片的表面上，用無菌水代替液體CM培養基誘導附著胞形成，觀察熒光表達情況，結果誘導6小時后熒光信號主要集中在分生孢子和附著胞的液泡上(圖12)。表明MoMonl蛋白可能通過結合在液泡上參與稻瘟病菌附著胞的 形成過程。實施例5 :突變體表型分析5. I突變體菌落形態在CM培養基上，AMoMonl菌落的氣生菌絲非常稀疏，中央菌絲尤其貧乏，只有在菌落的邊緣才可以看到明顯的氣生菌絲；而野生型Guyll和互補型Com-12的氣生菌絲濃密，菌落呈灰褐色(圖13)。MoMonl基因的缺失影響了稻瘟病菌的菌落形態。5.2突變體AMoMonl氣生菌絲產孢量明顯下降將菌株接種在CM培養基上，16小時光照，26° C生長7天后，無菌水將菌落表面菌絲洗掉，然后在超凈工作臺上，經無菌風吹干后繼續培養3天。然后打孔，統計分生孢子產量。野生型Guyll的孢子產量為4. 22±0. 87X 105個/ml，互補型Com-12的孢子產量為3. 8±0. 33X IO5個/ml，而基因缺失突變體AMoMonl的孢子產量僅為0. 2±0. 45X 105個/ml，約為野生型Guyll的1/45 ;互補型的孢子產量恢復，與野生型相近(圖14)。突變體AMoMonl的產孢量雖然下降，但是分生孢子的形態沒有改變，與Guyll和Com_12沒有明顯的差別。因此，基因MoMonl缺失，嚴重影響稻瘟病菌的產孢能力。5.3突變體育性降低將突變體AMoMonl與2539 (MATl-I)菌株進行交配試驗，首先在16小時光照，26° C培養三天，然后20° C恒溫持續光照培養4周。野生型Guyll和互補型Com-12與2539的交界處分別形成大量子囊殼，而在AMoMonl與2539的交界處則不能形成子囊殼(圖15)。說明，MoMonl基因的缺失，影響了稻瘟病菌的育性。5.4突變體附著胞的形成受阻分別將Guyll、AMoMonl和Com_12的分生孢子懸浮液(IO4個/ml)，每滴20W滴在塑料蓋玻片表面，誘導孢子萌發和附著胞形成。結果發現，突變體的分生孢子和野生型一樣在2小時內都可以萌發形成芽管。但是誘導培養24小時后，AMoMonl的分生孢子仍然延續菌絲生長而不能形成附著胞；野生型Guyll和互補型Com-12均在誘導24小時后有90%以上的分生孢子萌發形成附著胞(圖16)。說明，MoMonl基因的缺失，沒有影響分生孢子的初始萌發，但是卻完全阻斷了附著胞的形成。實施例6 :突變體細胞內物質運轉途徑6.1突變體AMoMonl的細胞自噬過程中斷利用透射電鏡觀察稻瘟病菌中細胞自噬過程的發生。在液體CM培養基中，26° C，150rpm，振蕩培養48小時的稻瘟病菌菌絲，用無菌水徹底洗去培養基，接種到含有2mmol/L PMSF的氮缺乏培養基(MM-N)中，繼續培養4小時。然后，用無菌水將菌絲洗干凈，戊二醛固定過夜，處理樣品，包埋，切片，電鏡觀察。從圖17的b可以看到，在野生型Guyll和互補型Com-12的大液泡中均有自噬泡出現；而AMoMonl突變體中沒有自噬泡的積累。因此，MoMonl基因缺失，稻瘟病菌細胞自噬過程被阻斷。6. 2突變體中大量小液泡堆積在上文透射電鏡觀察細胞自噬過程的試驗中，直接誘導培養后挑取菌絲在普通電子顯微鏡下觀察。在野生型Guyll的菌絲中，有典型的大液泡，并且液泡中存在大量肉眼可見的迅速移動的自噬體；而突變體AMoMonl的菌絲中則存在大量小而呈破碎狀的小液泡，同時在小液泡中沒有觀察到肉眼可見的游動顆粒(圖18)。互補型Com-12則恢復了細胞自噬過程，菌絲形態和野生型沒有明顯差別。在上文觀察細胞自噬過程的試驗中也發現了突變體AMoMonl中大量小液泡的堆積，說明，MoMonl的缺失不僅阻斷了稻瘟病菌的細胞自噬過程，還影響了液泡的生長發育。6. 3突變體細胞內蛋白運轉受阻 Monensin是一種Na+/H+離子載體，它可以抑制細胞內的蛋白運轉，常被用作蛋白轉運抑制劑。酵母中許多與液泡的合成或功能有關的突變體都對Monensin敏感(MarieGustavsson, 2008),同時Monl基因最早也是在對Monensin的抗性篩選中發現的(Mur6n etal. , 2001)。因此，我們在稻瘟病菌中AMoMonl突變體對Monensin的敏感性也做了檢測。菌株在CM平板上活化生長7天后，菌塊打孔接種到含有5 ug/ml Monensin的CM平板上，26° C培養7天后觀察拍照。結果發現，同等條件下，雖然野生型Guyll和互補型Com-12的菌落生長也受到一定程度的抑制，但是菌落還可以緩慢生長擴展，而AMoMonl突變體的生長幾乎完全被抑制(圖19)。說明MoMonl基因的敲除，影響了稻瘟病菌中蛋白的運轉。6.4 AMoMonl突變體細胞壁完整性被破壞對一些細胞壁干擾藥劑的敏感性測定方法同上。結果發現，與野生型Guyll和互補型 Com-12 相比，在分別含有 Congo red (200 ug/ml), SDS (0. 01%)和 caffeine (2 mM)的CM平板上時，AMoMonl的生長更加緩慢，尤其是在Congo red和SDS的情況下(圖20)受到的抑制更明顯。表明，MoMonl基因的敲除影響了稻瘟病菌中細胞壁的完整性。實施例7 A MoMonl突變體致病性喪失7. I離體大麥葉片接種在實驗室條件下，菌株在CM平板上生長7天后，打孔。將菌塊接種在育苗8天的大麥離體葉片上，未接菌的葉片作對照。保濕4天后觀察發病情況。結果顯示，Guyll和Com-12接種的葉片上產生黃褐的病斑(圖21);而AMoMonl沒有可見病斑產生。7. 2水稻噴霧接種分別用Guyl I、A MoMonl和Com_12的孢子懸浮液(I X 105/ml，含0. 25%明膠)對三葉一心的水稻進行噴霧接種，每缽30株苗用孢子液10ml，22° C黑暗保濕48小時，隨后轉移到培養室中26° C、12小時光照培養。水稻接種7d后觀察記錄發病情況。試驗重復3次。結果顯示，Guyll和Com-12在水稻葉片上可見典型的稻瘟病病斑，病斑邊緣黃褐色、中央灰色。而AMoMonl在水稻上沒有產生肉眼可見的病斑(圖22)。7. 3根部侵染在CM平板上生長7天的菌株，打孔，接種在催芽的水稻苗上。22° C，16小時光照培養兩周后，洗掉根部的蛭石，拍照觀察致病情況。結果顯示，野生型Guyll和互補型Com-12都可以在水稻根部產生典型的褐色病斑，而AMoMonl突變體則沒有形成可見的病斑(圖23)。實施例8 :利用MONl蛋白的表達或修飾作為靶標，篩選抗真菌的藥物把受MoMonl基因調控的下游基因的啟動子與熒光蛋白GFP構建成融合蛋白載體，通過實施例3的方法轉入到稻瘟病菌中，然后把在下游基因的啟動子調控下的GFP表達的稻瘟病菌轉化子菌株在液體完全培養基中大量培養，收集菌絲后分成若干小份，每一份中加入待篩選的化合物或候選藥物繼續在完全培養基培養數小時至數天，取菌絲在熒光顯微鏡下觀察菌絲的GFP的綠色熒光表達情況。如果MoMonl蛋白被候選藥物抑制而失去活性，則失去對下游基因的啟動子表達的調控能力，GFP蛋白不表達從而菌絲失去綠色熒光，說明該侯選藥物具有抑制MoMonl蛋白的作用。獲得的具有抑制MoMonl蛋白功能的候選藥物再 利用實施例4的方法，在接種的孢子液中加入侯選藥物，測定野生型稻瘟病菌在這種侯選藥物存在的條件下對水稻的致病性有沒有減弱，進一步確定化合物的抗真菌效果。當測定結果為野生型稻瘟病菌株對水稻的致病性減弱時，說明候選藥物具有明顯的抗真菌效果，可以作為抗真菌藥物的來源；當測定結果為野生型稻瘟病菌株對水稻的致病性沒有變化或增強時，說明侯選藥物沒有抗真菌效果，不能用作抗真菌藥物。備注說明首先以pRP-EGFP載體為模板擴增出EGFP基因；然后將該片段與T載體連接克隆后酶切插入到pBluesCript_SK(+)載體，形成pBS_GFP載體。以pBARKSl質粒為模板擴增選擇標記基因Bar。隨后將Bar克隆酶切后連接到pBS_GFP載體，形成pBS_GFP_Bar。以稻瘟病菌野生型菌株Guyll的基因組為模板擴增受MoMonl基因調控的下游基因的啟動子，然后將該啟動子克隆酶切連接到pBS-GFP-Bar。最后將同時含有Bar基因、EGFP基因以及啟動子的大片段酶切后連接到PCAMBIA1300載體，最終構成“融合蛋白載體”。最后將“融合蛋白載體”根據實施例3的方法轉化野生型菌株GuylI，通過草胺磷抗性篩選得到“在下游基因的啟動子調控下的GFP表達的稻瘟病菌轉化子菌株”。實施例9 :利用MoMonl的表達作為靶標，篩選抗真菌的藥物。把稻痕病菌在液體完全培養基中大量培養，收集菌絲后分成若干小份，每一份中加入待篩選的化合物或候選藥物繼續在液體完全培養基培養數小時，提取菌絲的RNA，采用實時定量PCR的方法檢測MoMonl的表達狀況。如果MoMonl的表達被候選藥物抑制，則菌絲細胞內沒有MoMonl的轉錄本或減少。獲得的化合物再利用實施例4的方法，測定野生型稻瘟病菌在這種化合物存在的條件下對水稻的致病性有沒有減弱，進一步確定化合物的抗真囷效果。實施例10 :利用MoMonl的啟動子作為靶標，篩選抗真菌的藥物。把MoMonl的啟動子與熒光蛋白GFP構建成融合蛋白載體，或把MoMonl的啟動子與熒光蛋白GFP以及MoMonl蛋白一起構建成融合蛋白載體，通過實施例3的方法轉入到稻瘟病菌中，然后把在MoMonl的啟動子調控下的GFP表達的稻瘟病菌轉化子菌株在液體完全培養基中大量培養，收集菌絲后分成若干小份，每一份中加入待篩選的化合物或候選藥物繼續在完全培養基培養數小時至數天，取菌絲在熒光顯微鏡下觀察菌絲的GFP的綠色熒光表達情況。如果MoMonl的啟動子的被化合物抑制而失去活性，則GFP蛋白不表達從而菌絲失去綠色熒光。獲得的化合物再利用實施例4的方法，測定野生型稻瘟病菌在這種化合物存在的條件下對水稻的致病性有沒有減弱，進一步確定化合物的抗真菌效果。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可 以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種源于稻瘟病菌的真菌致病性基因MoMonl，其特征是該基因的核苷酸序列或其互補鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示。
2.如權利要求I所述的基因MoMonl編碼的cDNA序列，其特征是所述的cDNA具有SEQID NO :2所示的核苷酸序列。
3.如權利要求I所述的基因MoMonl編碼的蛋白質，其特征是所述的蛋白質為SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列。
4.如權利要求I所述的基因MoMonl的用途，其特征是基因MoMonl的表達作為用于設計和篩選抗真菌藥物的靶標。
5.如權利要求3所述的蛋白質的用途，其特征是所述蛋白質的表達和修飾作為設計和篩選抗真菌藥物的靶標。
全文摘要
本發明公開了一種源于稻瘟病菌的真菌致病性基因MoMon1，該基因的核苷酸序列或其互補鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO1所示。本發明還同時公開了上述基因MoMon1編碼的cDNA序列，其具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。本發明還同時公開了上述基因MoMon1編碼的蛋白質，其具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。本發明還同時公開了上述基因MoMon1的用途基因MoMon1的表達作為用于設計和篩選抗真菌藥物的靶標。本發明還同時公開了上述蛋白質的用途蛋白質的表達和修飾作為設計和篩選抗真菌藥物的靶標。
文檔編號C12N15/31GK102776209SQ20121023190
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月5日 優先權日2012年6月20日
發明者馮曉曉, 劉小紅, 盧建平, 曾曉清, 林福呈, 高惠敏 申請人:浙江大學