專利名稱：一種核酸和鑒定真菌菌株致病型的方法以及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)作物病害防治領(lǐng)域，具體地，涉及一種核酸、一種鑒定真菌菌株致病型的方法和一種試劑盒。
背景技術(shù)：
大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)是一種植物致病真菌,它可以導(dǎo)致植物(特別是棉花)發(fā)生黃萎病等病害。但是，不同的大麗輪枝菌菌株的致病型差別很大，例如某些致病型高的菌株感染棉花后會(huì)導(dǎo)致棉花的嚴(yán)重病害而引起農(nóng)田產(chǎn)量的下降，而某些致病型低的菌株感染棉花后僅導(dǎo)致棉花的輕微病害且對(duì)農(nóng)田產(chǎn)量影響較小。此外，大麗輪枝菌的致病型還表現(xiàn)出一定的潛伏性，即當(dāng)年感染的高致病型菌株可能不致病，而在次年大范圍地嚴(yán)重致病。如果能夠檢測(cè)出農(nóng)田中大麗輪枝菌的主要菌株類型，并對(duì)其致病型作出準(zhǔn)確的判
斷，就可以結(jié)合藥物防治和輪作等農(nóng)業(yè)手段抑制病害的發(fā)生，從而增加經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決如何準(zhǔn)確判斷大麗輪枝菌菌株的致病型的技術(shù)問題，提供一種核酸、一種鑒定真菌菌株致病型的方法和一種試劑盒。SEQ ID NO:1所示的序列和SEQ ID NO:2所示的序列分別為本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在高致病型的大麗輪枝菌菌株的基因組序列中不出現(xiàn)而在低致病型的大麗輪枝菌的基因組序列中出現(xiàn)的序列。因而，對(duì)于某一致病型待測(cè)的大麗輪枝菌菌株，只要鑒定該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中是否存在SEQ ID NO:1所示的序列或SEQ ID NO:2所示的序列，即可獲知該大麗輪枝菌菌株是否為高致病型大麗輪枝菌。具體地，如果鑒定出該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列或SEQ ID NO:2所示的序列，則判斷該大麗輪枝菌菌株屬于高致病型；如果鑒定出該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中存在SEQ ID NO:1所示的序列或SEQ ID NO:2所示的序列，則判斷該大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型。并且，如果該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列，就能夠充分證明該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQID NO:1所示的序列；如果該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQID NO:2所示的序列中的特異性序列，就能夠充分證明該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:2所示的序列。并且，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO:1所示的序列和SEQ ID NO:2所示的序列要么同時(shí)都出現(xiàn)于大麗輪枝菌菌株的基因組序列中，要么同時(shí)都不出現(xiàn)于大麗輪枝菌菌株的基因組序列中。由此，本發(fā)明的發(fā)明人得到了本發(fā)明的技術(shù)方案。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種核酸，該核酸具有SEQ IDNO:1或SEQID NO:2所示的序列，或者具有SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列或SEQ ID NO:2所示的序列中的特異性序列，并且所述SEQID NO:1所示的序列中的特異性序列在大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列范圍內(nèi)僅存在于SEQ ID NO:1所示的序列中，所述SEQ ID NO:2所示的序列中的特異性序列在大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列范圍內(nèi)僅存在于SEQ ID NO:2所示的序列中。另一方面，本發(fā)明還提供了與如上所述的核酸互補(bǔ)的核酸。另一方面，本發(fā)明還提供了一種鑒定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株為大麗輪枝菌(Verticillium dahliae),該方法包括以下步驟:(I)制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測(cè)樣本；(2)檢測(cè)所述待測(cè)樣本中是否存在第一分子標(biāo)記，所述第一分子標(biāo)記為如上所述的核酸；(3)根據(jù)步驟(2)的檢測(cè)結(jié)果判斷大麗輪枝菌菌株致病型，在所述檢測(cè)結(jié)果顯示所述待測(cè)樣本中不存在所述第一分子標(biāo)記的情況下，則指示所述大麗輪枝菌菌株屬于高致病型；在所述檢測(cè)結(jié)果顯示所述待測(cè)樣本中存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸或它的互補(bǔ)核酸，并且存在具有SEQ ID NO:2所示的序列的核酸或它的互補(bǔ)核酸的情況下，則指示所述大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型。另一方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒含有如上所述的核酸，以及PCR試劑和/或分子雜交試劑。通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明鑒定的高致病型的大麗輪枝菌的導(dǎo)致棉花發(fā)生黃萎病的平均病情指數(shù)為56.6 ;本發(fā)明鑒定的低致病型的大麗輪枝菌的導(dǎo)致棉花發(fā)生黃萎病的平均病情指數(shù)為12.0。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式
部分予以詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明提供一種核酸,該核酸具有SEQ ID NO:1所示的序列或SEQ IDNO:2所示的序列，或者具有SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列或SEQ ID NO:2所示的序列中的特異性序列所示的序列，并且所述SEQ IDNO:1所示的序列中的特異性序列在大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列范圍內(nèi)僅存在于SEQ ID NO:1所示的序列中，所述SEQ ID NO:2所示的序列中的特異性序列在大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列范圍內(nèi)僅存在于SEQ ID NO:2所示的序列中。其中，術(shù)語(yǔ)“大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列”是指已經(jīng)公布在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列,具體是指文獻(xiàn)(Klosterman SJ et.al,Comparative genomics yields insights into niche adaptationof plant vascular wilt pathogens.PLoS Pathog.2011 Jul ；7 (7):el002137.Epub 2011Jul 28.)中提及的數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.broadinstitute.0rg)中公布的大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列。其中，SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列或SEQ ID NO:2所示的序列中的特異性序列可以基于SEQ ID NO:1所示的序列或SEQ ID NO:2所示的序列，和大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列，通過本領(lǐng)域常規(guī)的序列比對(duì)(blast)方法得至IJ。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以憑借已公開的計(jì)算機(jī)程序(商業(yè)化的和免費(fèi)的均可，例如NCB1-PRMERBLAST)，窮舉SEQ ID NO:1所示的序列或SEQ ID NO:2所示的序列的所有可能的片段，然后將其與大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列進(jìn)行--比對(duì)，
如果該片段僅出現(xiàn)于SEQ ID NO:1所示的序列中，而不出現(xiàn)于SEQID NO:1所示的序列以外的序列中，該片段即為SEQ ID NO:1所示的序列所示的序列中的特異性序列；如果該片段僅出現(xiàn)于SEQ ID NO:2所示的序列中，而不出現(xiàn)于SEQ ID NO:2所示的序列以外的序列中，該片段即為SEQ ID NO:2所示的序列所示的序列中的特異性序列。其中，本發(fā)明中所述的SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列是用于鑒定SEQID NO:1所示的序列是否存在的，因此SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度沒有特別的要求，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所選取的檢測(cè)方法進(jìn)行常規(guī)的選擇。例如，所述SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度可以為15-5000bp。其中，為了使SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列可以作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法鑒定SEQ ID NO:1所示的序列的擴(kuò)增祀(amplified target)序列，優(yōu)選情況下,所述SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度為100-5000bp，更優(yōu)選為lOO-lOOObp，進(jìn)一步優(yōu)選為100-500bp，更進(jìn)一步優(yōu)選為150-250bp。其中，為了使SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列可以作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法鑒定SEQ ID NO:1所示的序列的引物(primer)序列，或者作為核酸雜交(如Southern Blot)法鑒定SEQ ID NO:1所示的序列的探針(probe)序列,優(yōu)選情況下,所述SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度為15-99bp，更優(yōu)選為18_50bp，進(jìn)一步優(yōu)選為20-40bp，更進(jìn)一步優(yōu)選為22-35bp。其中，本發(fā)明中所述的SEQ ID NO:2所示的序列中的特異性序列是用于鑒定SEQID NO:2所示的序列是否存在的，因此SEQ ID NO:2所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度沒有特別的要求，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所選取的檢測(cè)方法進(jìn)行常規(guī)的選擇。例如，所述SEQ ID NO:2所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度可以為15-5000bp。其中，為了使SEQ ID NO:2所示的序列中的特異性序列可以作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法鑒定SEQ ID NO:2·所示的序列的擴(kuò)增祀(amplified target)序列，優(yōu)選情況下,所述SEQ ID NO:2所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度為100-5000bp，更優(yōu)選為lOO-lOOObp，進(jìn)一步優(yōu)選為100-500bp，更進(jìn)一步優(yōu)選為150-250bp。其中，為了使SEQ ID NO:2所示的序列中的特異性序列可以作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法鑒定SEQ ID NO:2所示的序列的引物(primer)序列，或者作為核酸雜交(如Southern Blot)法鑒定SEQ ID NO:2所示的序列的探針(probe)序列，優(yōu)選情況下,所述SEQ ID NO:2所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度為15-99bp，更優(yōu)選為18_50bp，進(jìn)一步優(yōu)選為20-40bp，更進(jìn)一步優(yōu)選為22-35bp。本發(fā)明還提供了與如上所述的核酸互補(bǔ)的核酸。需要說明的是，本發(fā)明如上所述的各種核酸中，除堿基序列外，均無特別的要求，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)如上所述的各種核酸進(jìn)行各種修飾，修飾后的核酸也屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明還提供了一種鑒定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株為大麗輪枝菌，該方法包括以下步驟:⑴制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測(cè)樣本；(2)檢測(cè)所述待測(cè)樣本中是否存在第一分子標(biāo)記，所述第一分子標(biāo)記為如上所述的核酸；(3)根據(jù)步驟
(2)的檢測(cè)結(jié)果判斷大麗輪枝菌菌株致病型，在所述檢測(cè)結(jié)果顯示所述待測(cè)樣本中不存在所述第一分子標(biāo)記的情況下，則指示所述大麗輪枝菌菌株屬于高致病型；在所述檢測(cè)結(jié)果顯示所述待測(cè)樣本中存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸或它的互補(bǔ)核酸，并且存在具有SEQ ID NO:2所示的序列的核酸或它的互補(bǔ)核酸的情況下，則指示所述大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型。其中，制備待測(cè)樣本的步驟可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的制備用于檢測(cè)核酸的樣本的方法進(jìn)行，本發(fā)明沒有特別的要求，例如可以從棉花植株上采集組織，并且將采集的組織在含有抗性的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并且篩選、辨別和分離大麗輪枝菌的菌落，然后按照(《植物基因工程》(何光源著，科學(xué)出版社，2007年出版))中所述的方法提取大麗輪枝菌的基因組DNA，即可制備得到待測(cè)樣本。其中，檢測(cè)所述待測(cè)樣本中是否存在第一分子標(biāo)記的方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的檢測(cè)核酸的方法，本發(fā)明沒有特殊的要求，例如可以為測(cè)序法(如雙脫氧核糖核苷酸中止測(cè)序法和芯片測(cè)序法)、PCR法(如實(shí)時(shí)定量PCR法)和核酸雜交法(如Southern Blot法)中的至少一種。其中，判斷所述檢測(cè)結(jié)果顯示所述待測(cè)樣本中是否存在所述第一分子標(biāo)記或具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸或SEQ ID NO:2所示的序列的核酸，可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，例如可以通過設(shè)置外參和/或內(nèi)參進(jìn)行平行檢測(cè)，并且通過平行檢測(cè)結(jié)果來進(jìn)一步判斷。另一方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒含有如上所述的核酸，以及PCR試劑和/或分子雜交試劑。以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中，各種大麗輪枝菌的菌株屬于經(jīng)過合法渠道獲得的遺傳資源。需要說明的是，SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2所示的序列中，出現(xiàn)了由連續(xù)的η (η為a，c，g，或t)組成的片段，該片段表示在不同的大麗輪枝菌菌株中可以自由改變的堿基序列，其不影響大麗輪枝菌菌株的致病型的判斷。實(shí)施例1本實(shí)施例用于說明待測(cè)樣本的制備。具體地，是從80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株(編號(hào)為VDGl至VDG80)的基因組DNA的制備。切取棉花植株離地表約10_35cm處的莖，切成Imm3左右大小的小塊，接種在在含有抗生素(氨芐青霉素、利福平和鏈霉素，濃度均為lOOyg/ml)的PDA培養(yǎng)基(含有馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L)上，25°C下培養(yǎng)7天，根據(jù)大麗輪枝菌的標(biāo)準(zhǔn)菌落形態(tài)鑒別大麗輪枝菌的菌落。得到鑒別的大麗輪枝菌的菌落即作為大麗輪枝菌菌株樣品。按照上述方法，從80個(gè)不同的棉花植株中取得80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株，將上述80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株按照《植物基因工程》(何光源著，科學(xué)出版社，2007年出版)中所述的方法，分別提取基因組DNA樣本，得到待測(cè)樣本1-80。實(shí)施例2本實(shí)施例用于說明上述80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株的致病型的檢測(cè)結(jié)果。參照文獻(xiàn)(朱 荷琴，馮自力，李志芳，趙麗紅，師勇強(qiáng).蛭石沙土無底紙缽定量蘸菌液法鑒定棉花品種(系)的抗黃萎病性.中國(guó)棉花，2010,37(12):15-17)中的蛭石沙土無底紙缽定量蘸菌液法，對(duì)實(shí)施例1中所述的80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株進(jìn)行棉花苗期致病型鑒定。以所述的80個(gè)不同的大麗輪枝菌菌株在接種健康棉花植株后的病情指數(shù)來表征致病型的高低。具體地，將大麗輪枝菌在查比克培養(yǎng)基(2g/L的NaNO3, lg/L的K2HPO4,0.5g/L的KCl, 0.5g/L的MgSO4,0.0 lg/L的FeSO4, 30g/L的蔗糖，20g/L的瓊脂)上培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子，用無菌水洗下孢子得到孢子懸液，并將孢子懸液中的孢子濃度調(diào)整至5X IO6個(gè)/ml。然后，播種在紙缽的棉花幼苗至少有一片真葉展開時(shí)接種，向紙牒底部注入IOmL孢子懸浮液，將紙缽放入紙牒中，接種棉苗30株以上。接種后4周發(fā)病情況，調(diào)查采用5級(jí)分級(jí)法，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí)，健苗、無病狀；1級(jí)，1-2片子葉表現(xiàn)病狀、子葉變黃、真葉不顯病狀；2級(jí)，子葉和I片真葉表現(xiàn)病狀；3級(jí)、2片真葉表現(xiàn)病狀；4級(jí)，全部葉片表現(xiàn)病狀，嚴(yán)重時(shí)葉片脫落，頂心枯死。根據(jù)調(diào)查結(jié)果，計(jì)算出病情指數(shù)，公式如下所示:
權(quán)利要求
1.一種核酸，該核酸具有SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示的序列，或者具有SEQ IDNO 1所示的序列中的特異性序列或SEQ ID NO 2所示的序列中的特異性序列，并且所述SEQ ID NO :1所示的序列中的特異性序列在大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列范圍內(nèi)僅存在于SEQ ID NO: I所示的序列中，所述SEQ ID NO :2所示的序列中的特異性序列在大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列范圍內(nèi)僅存在于SEQIDNO : 2所示的序列中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸，其中，所述SEQID NO :1所示的序列中的特異性序列或SEQ ID NO :2所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度為100-5000bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸，其中，所述SEQID NO 1所示的序列中的特異性序列或SEQ ID NO :2所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度為100-1000bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸，其中，所述SEQID NO :1所示的序列中的特異性序列或SEQ ID NO :2所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度為100-500bp，優(yōu)選為150_250bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸，其中，所述SEQID NO :1所示的序列中的特異性序列或SEQ ID NO 2所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度為15-99bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸，其中，所述SEQID NO :1所示的序列中的特異性序列或SEQ ID NO :2所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度為18-50bp。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸，其中，所述SEQID NO 1所示的序列中的特異性序列或SEQ ID N0:2所示的序列中的特異性序列的長(zhǎng)度為20-40bp，優(yōu)選為22_35bp。
8.—種核酸,該核酸與權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的核酸互補(bǔ)。
9.一種鑒定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株為大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae),該方法包括以下步驟 (1)制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測(cè)樣本； (2)檢測(cè)所述待測(cè)樣本中是否存在第一分子標(biāo)記，所述第一分子標(biāo)記為根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的核酸； (3)根據(jù)步驟(2)的檢測(cè)結(jié)果判斷真菌菌株致病型，在所述檢測(cè)結(jié)果顯示所述待測(cè)樣本中不存在所述第一分子標(biāo)記的情況下，則指示所述大麗輪枝菌菌株屬于高致病型；在所述檢測(cè)結(jié)果顯示所述待測(cè)樣本中存在具有SEQID NO 1所示的序列的核酸或它的互補(bǔ)核酸，并且存在具有SEQ ID NO :2所示的序列的核酸或它的互補(bǔ)核酸的情況下，則指示該大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型。
10.一種試劑盒，所述試劑盒含有根據(jù)權(quán)利要求8中任意一項(xiàng)所述的核酸，以及PCR試劑和/或分子雜交試劑。
全文摘要
發(fā)明提供了一種核酸，該核酸具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的序列，或者具有SEQ ID NO1所示的序列中的特異性序列或SEQ IDNO2所示的序列中的特異性序列。本發(fā)明還提供了與如上所述的核酸互補(bǔ)的核酸。本發(fā)明還提供了一種鑒定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株為大麗輪枝菌，該方法包括以下步驟(1)制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測(cè)樣本；(2)檢測(cè)所述待測(cè)樣本中是否存在第一分子標(biāo)記，所述第一分子標(biāo)記為如上所述的核酸；(3)根據(jù)步驟(2)的檢測(cè)結(jié)果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型。本發(fā)明還提供了一種試劑盒。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103255136SQ20121005227
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者戴小楓, 李蕾, 陳捷胤, 陳相永, 柳少燕, 王金龍, 肖紅利 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所