專利名稱：提高作物抗性的化合物及其應(yīng)用的制作方法
提高作物抗性的化合物及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物栽培領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及提高作物抗性的脯氨酸類化合物、制劑及其在小麥抗寒的應(yīng)用等。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾霓r(nóng)作物之一，在我國(guó)北方以及高海拔地區(qū)都有廣泛種植，其中冬小麥需要越冬，對(duì)抗寒性有一定要求。因此，目前我國(guó)推廣種植的冬小麥基本都是人工選育的抗寒品種。
對(duì)于非抗寒品種，通過施加抗寒/凍劑，可以提高植物的抗寒性，其中也可以用脯氨酸作為植物內(nèi)源性的抗寒指標(biāo)。例如，中國(guó)專利申請(qǐng)00128262公開了大豆抗寒齊U，其中含有脫落酸等物質(zhì)，能夠提高大豆植株內(nèi)的脯氨酸含量；又如，中國(guó)專利申請(qǐng)200810010789公開了植物抗逆(包括抗凍抗寒)誘導(dǎo)劑，其中含有殼寡糖等物質(zhì)，能夠提高大豆植株內(nèi)的脯氨酸含量。另外，脯氨酸也可以直接作為外源抗寒成分使用。例如，中國(guó)專利02100473公開了抗逆(包括抗寒等多種逆境)保鈴型棉花專用葉面噴施劑，在其多種成分中包含少量脯氨酸；中國(guó)專利200610155114公開了用于超甜玉米種子的種子包衣劑，在其多種成分中包含少量脯氨酸作為抗寒活性成分；還有，中國(guó)專利200910042200公開了用于水稻直播的抗冷型浸種劑，在其多種成分中包含少量脯氨酸作為抗冷劑。然而，對(duì)于抗寒品種，尤其是小麥抗寒品種，這些抗寒/凍劑是否能有抗寒/凍效用，現(xiàn)有技術(shù)并沒有給出啟示；另外，由于目前我國(guó)推廣種植的冬小麥基本都是抗寒品種，也被認(rèn)為沒有必要使用額外的抗寒/凍劑，更沒有必要單獨(dú)施用活性成分僅有抗寒成分的制劑。
經(jīng)本發(fā)明人長(zhǎng)期研究和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，目前現(xiàn)有的抗寒小麥品種的抗寒能力主要體現(xiàn)在越冬期，而進(jìn)入春季返青后，抗寒能力就會(huì)急劇下降，此時(shí)如果遇到倒春寒氣候就會(huì)對(duì)(抗寒)小麥會(huì)造成凍害；而且，提前施用脯氨酸溶液，雖然會(huì)有一定效果，但是倒春寒氣候一般發(fā)生在春季降雨后，脯氨酸容易流失而減效，而在倒春寒氣候來臨時(shí)才進(jìn)行施用，一來天氣難以預(yù)測(cè)，二是會(huì)給農(nóng)民帶來了負(fù)擔(dān)，三是如果加穩(wěn)定劑容易造成污染。所以，結(jié)合本發(fā)明人長(zhǎng)期研究和實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)，令人意外地獲得了一種蛋白，能夠更穩(wěn)定地提高(抗寒)小麥的抗寒能力，尤其是在發(fā)生倒春寒的時(shí)候。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解 決的技術(shù)問題在于提供新的小麥抗寒的制劑，其能夠提高(抗寒)小麥的抗寒能力，尤其是在發(fā)生倒春寒的時(shí)候。另外，本發(fā)明還提供了與之相關(guān)的防寒方法、抗寒應(yīng)用、試驗(yàn)方法以及制備中間體等。
具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了小麥抗寒制劑，其包括脯氨酸類化合物和農(nóng)學(xué)上可接受的輔料。有抗寒需求的小麥多為冬小麥，因此在本發(fā)明中，優(yōu)選小麥?zhǔn)嵌←?。在本文中，“農(nóng)學(xué)上可接受的輔料”指的是不干擾、甚至能增強(qiáng)脯氨酸類似物起效的農(nóng)用輔料，包括賦形劑、稀釋劑、乳化劑、PH調(diào)節(jié)劑等。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，農(nóng)學(xué)上可接受的輔料是水。這樣，可以不使用穩(wěn)定劑的情況下施用，無論對(duì)于成本和污染治理，都是很有益的。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的制劑由脯氨酸類化合物和農(nóng)學(xué)上可接受的輔料組成。也就是說，除了脯氨酸類化合物，并且除了農(nóng)學(xué)上可接受的輔料，本發(fā)明第一方面的制劑可以不添加其他物質(zhì)。例如，本發(fā)明第一方面的制劑可以由游離的脯氨酸類化合物和農(nóng)學(xué)上可接受的輔料組成。本發(fā)明第一方面的制劑中可以直接采用游離的脯氨酸，在某些灌溉方式下，這能夠取得不錯(cuò)的抗寒效果。優(yōu)選采用在本發(fā)明的抗寒蛋白，在不受理論限制的情況下，這甚至能在蛋白中脯氨酸量減少的時(shí)候增強(qiáng)抗寒效果，說明蛋白質(zhì)的抗寒效果應(yīng)該不僅僅來源于(降解產(chǎn)生的)脯氨酸，可能還涉及其他。因此，優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的制劑中，脯氨酸類化合物是由氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的抗寒蛋白或其變體提供的。即，本發(fā)明第一方面的制劑包含氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的抗寒蛋白或其變體和農(nóng)學(xué)上可接受的輔料。在本文中，抗寒蛋白的變體的氨基酸序列是對(duì)SEQ ID No:1缺失、添加和取代一個(gè)或幾個(gè)(優(yōu)選不超過7個(gè)，更優(yōu)選不超過5個(gè)，如不超過3個(gè))氨基酸殘基而獲得的保留SEQID No:1抗寒活性的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過重組DNA技術(shù)，能夠制備出經(jīng)缺失、添加和/或取代氨基酸殘基而獲得的變體蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)蛋白的氨基酸序列推導(dǎo)出其編碼的核苷酸序列，優(yōu)選是密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，抗寒蛋白是由如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列編碼的。更優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的制劑中，抗寒蛋白的提供是由核苷酸序列如SEQ IDNo:2所示的基因在酵母中表達(dá)而得的上清液提供的。即，本發(fā)明第一方面的制劑包含由核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的基因在酵母中表達(dá)而得的上清液體和農(nóng)學(xué)上可接受的輔料。這樣，無需提純，進(jìn) 一步節(jié)約了成本。多核苷酸可以通過各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方式被導(dǎo)入菌中，使該菌表達(dá)所述多核苷酸編碼的蛋白。所述多核苷酸可以直接被導(dǎo)入，例如利用微粒體、基因槍等導(dǎo)入細(xì)胞；也可以間接被導(dǎo)入，例如可以通過構(gòu)建在質(zhì)粒載體上導(dǎo)入細(xì)胞。導(dǎo)入的所述多核苷酸可以整合在細(xì)胞的基因組上表達(dá)，也可以游離表達(dá)。優(yōu)選本發(fā)明中，編碼蛋白的多核苷酸可以利用穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入菌中，如抗寒蛋白的多核苷酸可以利用大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入分泌表達(dá)菌(如畢氏酵母)中，其表達(dá)的上清液中含有氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的抗寒蛋白。在第二方面，本發(fā)明提供了小麥防寒的方法，其包括在小麥越冬期施用本發(fā)明第一方面的制劑。在本文中，抗寒包括在寒冷到來前的預(yù)防性抗寒(即，防寒)和在寒冷到來后的補(bǔ)救性抗寒。對(duì)于可以預(yù)測(cè)的冬季寒冷的大趨勢(shì)，由于目前市售的小麥(冬小麥)都具有一定的抗寒能力，因此只要選擇正確適于當(dāng)?shù)卦蕉男←?冬小麥)品種即可，一般無需額外的防凍劑，因此優(yōu)選對(duì)于倒春寒進(jìn)行預(yù)防。因此優(yōu)選本發(fā)明第二發(fā)明的方法是小麥防倒春寒的方法。施用本發(fā)明第一方面的制劑的量和次數(shù)會(huì)隨著小麥品種的變化而有所變化，通常以制劑中的脯氨酸計(jì)，施用量為1-1OOg/畝，優(yōu)選為5-50g/畝，更優(yōu)選為10-20g/畝，可以分f 5次施用，優(yōu)選分f 3次施用。在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的制劑在小麥抗寒中的應(yīng)用。出于施用的方便和規(guī)范性，優(yōu)選其中抗寒是防寒；出于對(duì)倒春寒的預(yù)測(cè)難度，更優(yōu)選其中抗寒是防
倒春寒。在第四方面，本發(fā)明提供了模擬小麥經(jīng)歷倒春寒的方法，其包括:
(1)在小麥越冬前架設(shè)溫室支架，同時(shí)不封閉溫室，使得溫室內(nèi)的溫度與環(huán)境溫度相
同；
(2)在小麥越冬期間封閉溫室，使溫室內(nèi)的溫度高于環(huán)境溫度；和，
(3 )在小麥提前返青時(shí)重新不封閉溫室，使得溫室內(nèi)的溫度與環(huán)境溫度相同。在第五方面，本發(fā)明提供了抗寒蛋白或其變體，所述抗寒蛋白的氨基酸序列如SEQID No:1所示，所述抗寒蛋白的變體的氨基酸序列是對(duì)SEQ ID No: 2缺失、添加和取代一個(gè)或幾個(gè)(優(yōu)選不超過7個(gè)，更優(yōu)選不超過5個(gè)，如不超過3個(gè))氨基酸殘基而獲得的保留SEQID No:1抗寒活性的序列。在第六方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明第五方面的抗寒蛋白或其變體的基因，優(yōu)選其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。在第七方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明第六方面的基因的載體，優(yōu)選是大腸桿菌-酵母穿梭載體。在第八方面，本發(fā)明提供了菌種，尤其是分泌表達(dá)菌(如，酵母)，其包含第六方面的基因，或用第七方面的載體轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染。在第九方面，本發(fā)明提供了獲得包含本發(fā)明第五方面的抗寒蛋白或其變體的上清液的方法，其包括在發(fā)酵條件下培養(yǎng)本發(fā)明第八方面的菌種，過濾后保留上清液，任選對(duì)上清液進(jìn)行濃縮和/或干燥。在第十方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第九方面的方法獲得的上清液在制備小麥抗寒制劑中的應(yīng)用，優(yōu)選在制備本發(fā)明第一方面的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明的制劑對(duì)植物抗寒/凍劑中一直為人忽視的小麥抗寒重新做了彌補(bǔ)，尤其適用于小麥抗倒春寒，特別是本發(fā)明的抗寒蛋白不容易流失而減效，減輕了農(nóng)民的負(fù)擔(dān)。另外，本發(fā)明的抗寒蛋白發(fā)酵成本低，過程簡(jiǎn)單，上清液可以直接(稀釋)施用，便于推廣。為了便于理解，以下將通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā) 明的內(nèi)容。如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說明書等參考。
實(shí)施例1抗寒蛋白的基因的表達(dá)構(gòu)建體 根據(jù)我們的設(shè)計(jì)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成抗寒蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如序列表的SEQ ID No:2所示，所編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。然后，根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》以及所用商品化試劑的操作指南構(gòu)建分泌表達(dá)的酵母，簡(jiǎn)而言之，即將編碼該木聚糖酶的基因用正向引物如序列表的SEQ ID No: 3所示(弓丨入了 EcoR I內(nèi)切酶位點(diǎn))、反向引物如序列表的SEQ ID No:4所示(引入了 Not I內(nèi)切酶位點(diǎn))擴(kuò)增后用EcoR I和Not I雙酶切，并與經(jīng)這兩個(gè)內(nèi)切酶酶切的pPIC3.5質(zhì)粒(可購(gòu)自Invitrogen公司)用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α中。挑出陽性克隆，抽提出其中的質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，將陽性質(zhì)粒用Sal I酶切線性化后，通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入畢氏酵母GSl 15株，在含G418的平板上挑出陽性酵母轉(zhuǎn)化株，寄回。
實(shí)施例2抗寒蛋白的表達(dá) 將實(shí)施例1獲得的陽性酵母轉(zhuǎn)化株接種到50ml BMGY液體培養(yǎng)基(IOOmM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，其中含1%酵母提取物、2%蛋白胨，酵母含氮堿基1.34%，生物素4*10_5%，葡萄糖2%，甘油1%)中，于30°C、200rpm培養(yǎng)至0D600達(dá)到5.0。
將上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到IL BMGY液體培養(yǎng)基中，于30°C、200rpm培養(yǎng)24小時(shí)，加入5ml甲醇,然后繼續(xù)于30°C、200rpm培養(yǎng)8天,期間每24小時(shí)補(bǔ)加5ml甲醇,通氣控制溶氧(DO)大于20%，并控制pH為6.0 (用氨水調(diào)節(jié))。培養(yǎng)完成后，用0.22 μ m濾膜過濾并保留上清液，該上清液經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)其中對(duì)應(yīng)8kDa的抗寒蛋白(其中脯氨酸含量約占61%)，發(fā)現(xiàn)其表量達(dá)到7g/L，直接冷凍干燥。使用時(shí)，直接用水溶解后稀釋成抗寒蛋白水溶液使用。
實(shí)施例3小麥抗倒春寒試驗(yàn) 倒春寒這種自然現(xiàn)象的發(fā)生難以預(yù)測(cè)，目前也沒有合適的田間模擬試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，為此，我們于10月19日播種較新培育的抗寒小麥品種新麥19號(hào)，并將地塊隨機(jī)劃分成陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、脯氨酸1、脯氨酸2、蛋白I和蛋白2組等6組。其中，陽性對(duì)照組的栽培條件(化肥施用等)均參照敦煌種業(yè)對(duì)所售“ 新麥19號(hào)”的說明書，即大田栽培，不搭溫室大棚，等到小麥開始返青后(次年2月27日)正常進(jìn)行水肥管理；其他5組均在播種后搭溫室大棚支架，但是不覆蓋塑料膜，直至12月6日覆蓋塑料膜，控制棚內(nèi)溫度為8-16°C，于次年I月26日小麥開始有返青現(xiàn)象出現(xiàn)時(shí)，就提前進(jìn)行水肥管理(其中陰性對(duì)照、脯氨酸I組和蛋白I組采用漫灌，脯氨酸2組和蛋白2組采用噴灌)，并于I月29日揭開塑料膜(此時(shí)棚外溫度為-3_4°C);另外，脯氨酸I組和脯氨酸2組于I月10日和I月20日各噴灑1.5g/L脯氨酸溶液一次，每畝IOL ;蛋白I組和蛋白2組也于I月10日和I月20日各噴灑含實(shí)施例2制備的抗寒蛋白水溶液(以抗寒蛋白計(jì)，2g/L，折合脯氨酸含量約為1.2g/L)—次，每畝IOL0觀察相對(duì)于陽性對(duì)照的主莖幼穗凍死率和總產(chǎn)量。
結(jié)果如表I所示，相對(duì)于沒有經(jīng)歷倒春寒的栽培(陽性對(duì)照)，經(jīng)歷倒春寒的各組均有不同程度的凍死現(xiàn)象的產(chǎn)生以及產(chǎn)量的下降，其中，沒有施用任何抗寒劑的栽培(陰性對(duì)照)，凍死率達(dá)15%以上，產(chǎn)量下降40% ;而其他施用了脯氨酸或者本發(fā)明的抗寒蛋白的，凍死率和產(chǎn)量下降程度都有所減輕，尤其是施用了本發(fā)明的抗寒蛋白的，優(yōu)于直接施用脯氨酸的；另外，灌溉的方式也會(huì)影響脯氨酸或者本發(fā)明的抗寒蛋白的抗寒效果，采用噴灌更容易影響(尤其對(duì)于直接施用脯氨酸的)，這可能是由于本發(fā)明的抗寒蛋白具有更佳的附著力而不容易被水(雨水、灌溉水)沖刷流失造成的。表I小麥抗倒春寒試驗(yàn)數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.小麥(尤其是冬小麥)抗寒制劑，其包括脯氨酸類化合物和農(nóng)學(xué)上可接受的輔料，優(yōu)選其由脯氨酸類化合物和農(nóng)學(xué)上可接受的輔料組成。
2.權(quán)利要求1所述的制劑，其中脯氨酸類化合物是由氨基酸序列如SEQID No:l所示的抗寒蛋白或其變體提供的。
3.權(quán)利要求2所述的制劑，其中抗寒蛋白的提供是由核苷酸序列如SEQID No:2所示的基因在酵母中表達(dá)而得的上清液提供的。
4.小麥(尤其是冬小麥)防寒的方法，其包括在小麥(尤其是冬小麥)越冬期施用權(quán)利要求1-3之任一所述的制劑。
5.權(quán)利要求1-3之任一所述的制劑在小麥(尤其是冬小麥)抗寒中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中抗寒是防寒，優(yōu)選是防倒春寒。
7.模擬小麥(尤其是冬小麥)經(jīng)歷倒春寒的方法，其包括: (1)在小麥(尤其是冬小麥)越冬前架設(shè)溫室支架，同時(shí)不封閉溫室，使得溫室內(nèi)的溫度與環(huán)境溫度相同； (2)在小麥(尤其是冬小麥)越冬期間封閉溫室，使溫室內(nèi)的溫度高于環(huán)境溫度；和， (3)在小麥(尤其是冬小麥)提前返青時(shí)重新不封閉溫室，使得溫室內(nèi)的溫度與環(huán)境溫度相問。
8.抗寒蛋白或其變體，所述抗寒蛋白的氨基酸序列如SEQID No:1所示。
9.編碼權(quán)利要求8所述的抗寒蛋白或其變體的基因，優(yōu)選其核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。
10.獲得包含權(quán)利要求8所述的抗寒蛋白或其變體的上清液的方法，其包括在發(fā)酵條件下培養(yǎng)分泌表達(dá)菌(如，酵母)，過濾后保留上清液，任選對(duì)上清液進(jìn)行濃縮和/或干燥，優(yōu)選其中分泌表達(dá)菌(如，酵母)包含權(quán)利要求9所述的基因，或者用包含權(quán)利要求9所述的基因的載體(如，大腸桿菌 -酵母穿梭載體)轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染。
全文摘要
本發(fā)明提供了提高小麥(尤其是冬小麥)抗性(尤其是抗寒)的化合物及其制劑，其包括脯氨酸類化合物，能用于小麥的防寒，如防倒春寒。另外，本發(fā)明還提供了相關(guān)的防寒方法、抗寒應(yīng)用、試驗(yàn)方法以及制備中間體等。
文檔編號(hào)A01P21/00GK103141498SQ20131006001
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者何其明 申請(qǐng)人:成都新朝陽作物科學(xué)有限公司