專利名稱：一種人參內生多粘類芽孢桿菌生物防治菌劑制備方法
技術領域：
本發明涉及一種人參內生多粘類芽孢桿菌生物防治菌劑制備方法，屬生物技術領域。
背景技術：
隨著環境壓力的增大和人們對健康及食品安全要求的提高，微生物農藥受到越來越多的重視。目前，用于生防細菌的種類有:枯草芽孢桿菌{Bacillus subtilis)、多粘芽抱桿菌^Paenibacillus、臘狀芽抱桿菌{Bacillus cereus)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)和短小芽抱桿菌(Jiacilluspumilis)等。許多生防細菌產生的拮抗物質，抗菌作用是廣譜的。多黏類芽孢桿菌{Paenibacillus polymyxa)中很多菌株作為重要的生防資源，用于多種植物病害的生物防治，美國環境保護署已將其列為可商業上應用的微生物種類之一，我國農業部也將其列為免做安全鑒定的一級菌種。我國許多學者分尚到多個多黏類芽孢桿菌生防菌株，分別對黃瓜枯萎病、番爺灰霉病、稻痕病、蒸枝霜疫霉病等具有較好地抑制作用，但現已報道的多黏類芽孢桿菌主要分離自土壤，少數為植物內生菌，本發明采用人參內生多粘類芽孢桿菌菌株是從人參植株中分離獲得的，該菌株的發酵液對人參黑斑病菌panax Whetz )> 參.腐舊iCyIindrocarpondestructans Zinns)、人參菌核病菌(.Sclerotinia schinseng^ang)> 人參立才古病菌{Rhizoctonia solani Kuhn)、人參根腐病菌solani App)及人參細菌性軟腐病{Erwinia carotovora subsp)等病原菌具有明顯的防病效果,表現了良好的生防前景,為了進一步較好地開發利用該菌株進行植物病害的生物防治，本發明系統研究了該菌株的發酵條件，旨在為該菌株生物農藥和制劑的開發提供依據。

發明內容

本發明提供一種人參內生多粘類芽孢桿菌生物防治菌劑制備方法，該菌株抑菌譜廣、抑菌能力強，用于防治人參、西洋參等植物的病害。該方法可應用在制備防治人參、西洋參等植物病害的菌劑或制劑中。本發明所述人參內生多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa),已于2013年2月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC 7250。本發明所述人參內生多粘類芽孢桿菌制劑的制備方法:將保存的人參內生多粘類芽孢桿菌接入滅菌的PDA斜面培養基，25°C -35°C培養24h_48h，進行人參內生多粘類芽孢桿菌菌種活化。挑取活化的人參內生多粘類芽孢桿菌菌種，接入滅菌的PDB培養基中，120rpm/min, 25°C培養24h_48h，培養到OD6tltl值為0.5左右，得種子液。將人參內生多粘類芽孢桿菌種子液按體積比2%接種量，接種入滅菌的PDB培養基中，120rpm/min，25°C培養24h-48h，芽胞形成85%以上時，得發酵液。將人參內生多粘類芽孢桿菌發酵液經細菌計數后，調整到108CFU/ml，包裝，陰涼避光保存。
具體實施例方式本發明提供了人參內生多粘類芽孢桿菌制劑的制備方法，本發明領域技術人員可借鑒本發明內容，適當改進工藝參數實現，所有類似的替換和改動對本領域技術人員是顯而易見的，都視為本發明。本發明所述人人參內生多粘類芽孢桿菌制劑的制備方法已通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。下面結合實施例，進一步闡述本發明。實施例1本發明人參內生多粘類芽孢桿菌生防菌菌劑的制備
1、菌種:人參內生多粘類芽孢桿菌polymyxa),已于2013年2月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 7250。2、人參內生多粘類芽孢桿菌菌種活化
將保存的人參內生多粘類芽孢桿菌接入滅菌的P D A斜面培養基，2 5 °C - 3 5 °C培養24h-48h。PDA培養基制備方法:馬鈴薯洗凈去皮后稱取200g，切成小塊，加蒸餾水煮至沸騰后20-30min (馬鈴薯能用玻璃棒戳破即可)，然后用四層紗布過濾，向濾液中加20g葡萄糖及20g瓊脂粉，繼續加熱至溶解，加蒸餾水至1000ml，115°C下高壓滅菌20min。溫度降至50°C左右時倒入試管中，制成斜面培養基，凝固后倒置24h無菌生長即可使用。3、人參內生多粘類芽孢桿菌種子液制備
挑取活化的人參內生多粘類芽孢桿菌菌種，接入滅菌的PDB培養基中，120rpm/min, 25°C培養24h_48h，培養到OD6tltl值為0.5左右，得種子液。PDB培養基制備方法:馬鈴薯洗凈去皮后稱取200g，切成小塊，加蒸餾水煮至沸騰后20-30min(馬鈴薯能用玻璃棒戳破即可)，然后用四層紗布過濾，向濾液中加20g葡萄糖，繼續加熱至溶解，加蒸餾水至1000ml，溫度降至50°C左右時倒入三角瓶中，250ml三角瓶中加50ml培養基，包扎后115°C下高壓滅菌20min，冷卻后備用。4、人參內生多粘類芽孢桿菌發酵液制備
(1)培養基優化
將人參內生多粘類芽孢桿菌種子液按體積比2%接種量，分別接種入滅菌的PDB培養基、發酵培養基、NB培養基、LB培養基和YEH)培養基中，每個培養基做4個重復。120rpm/min, 25 °C，培養48h后測定菌株生物量。結果見表1，由表I可見，人參內生多粘類芽孢桿菌發酵液制備的最優培養基為PDB培養基。表I培養基對菌株生物量的影響
權利要求
1.一種人參內生多粘類芽孢桿菌生物防治菌劑制備方法，即防治人參、西洋參等植物病害的生物菌劑的制備方法。
2.按權利要求I所述，菌種培養本發明所用菌種為人參內生多粘類芽孢桿菌{Paenibacillus polymyxa )保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為 CGMCC 7250。
3.將保存的人參內生多粘類芽孢桿菌接入滅菌的PDA斜面培養基，25°C-35°C培養24h-48h，活化人參內生多粘類芽孢桿菌菌種。
4.按權利要求I所述，種子液制備挑取活化的人參內生多粘類芽孢桿菌菌種，接入滅菌的PDB培養基中，120rpm/min，25°C培養24h_48h，培養到OD6tltl值為O. 5左右，得種子液。
5.按權利要求I所述，發酵液制備將人參內生多粘類芽孢桿菌種子液按體積比2%接種量，接種入滅菌的PDB培養基中，120rpm/min, 25°C培養24h_48h，芽胞形成85%以上時，得發酵液。
6.按權利要求I所述，人參內生多粘類芽孢桿菌生物防治菌劑成品將人參內生多粘類芽孢桿菌發酵液經細菌計數后，調整到108CFU/ml，包裝，陰涼避光保存。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域,具體公開了一種人參內生多粘類芽孢桿菌生物防治菌劑制備方法。本發明所用菌種為人參內生多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)，已于2013年2月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No.7250。本發明方法包括人參內生多粘類芽孢桿菌菌種培養，種子液制備，發酵液制備，成品制備。本發明生物防治菌劑生產操作簡單、成本低、菌體發酵完全、芽孢形成率高，為人參內生多粘類芽孢桿菌大規模培養和開發利用打下堅實基礎。
文檔編號A01N63/02GK103250741SQ20131006769
公開日2013年8月21日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者郜玉鋼, 張連學, 臧埔, 盧宗志, 祝彥海, 趙巖, 楊鶴, 王玉方, 李 學, 趙雪亮, 李麗 申請人:吉林農業大學