專利名稱：一種非洲菊純合體植株的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種非洲菊純合體植株的選育方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
非洲菊(Gerbera jamesonil Bolus)又名扶郎花,菊科大丁草屬多年生草本花丼，為世界五大鮮切花之一，可用作切花生產(chǎn)或盆栽觀賞，全世界廣泛分布。因其花色絢麗，花朵碩大，花姿優(yōu)美以及其特有的文化內(nèi)涵深受廣大消費(fèi)者青睞。目前，生產(chǎn)中迫切需要耐低溫、耐弱光、抗病蟲害的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)非洲菊新品種。自交系間雜種的優(yōu)勢(shì)比品種間雜種優(yōu)勢(shì)大，而非洲菊為典型的異花授粉作物，由于長(zhǎng)期無(wú)性繁殖，保存著基因型的高度雜合性，其性狀遺傳極為復(fù)雜。為了克服非洲菊品種的雜合狀態(tài)，充分利用雜種優(yōu)勢(shì)，排除顯隱性的干擾，提高選擇的準(zhǔn)確性，必須通過(guò)人工控制授粉，強(qiáng)迫自交，提高親本的純合性。通常情況下，要獲得純合的自交系，需進(jìn)行多代(4 6代)，甚至10代以上的自交，花費(fèi)6 7年甚至8 9年的時(shí)間。現(xiàn)有技術(shù)中通過(guò)花粉(花藥)或未授粉子房(或胚珠)培養(yǎng)可得單倍體植株，經(jīng)染色體加倍成為純系，可縮短純合體的選育時(shí)間。在許多植物中，花藥或花粉培養(yǎng)往往是獲得單倍體植株的主要途徑。但由于非洲菊花器構(gòu)造上的特殊性(異花授粉且在花發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)雄蕊敗育)，導(dǎo)致花粉或花藥取材困難，滅菌難度較大。因而，采用胚珠來(lái)培養(yǎng)非洲菊的單倍體植株，然后通過(guò)秋水仙堿加倍，獲得純合體植株。但現(xiàn)有技術(shù)通過(guò)花粉(花藥)或未授粉子房(或胚珠)培養(yǎng)獲得單倍體植株，除單倍體外，還有二倍體植株和混倍體，需要進(jìn)行染色體鑒定選出單倍體植株，然后通過(guò)秋水仙堿加倍，加倍后的植株中，除育種家需要的單倍體、雙單倍體植株外，還包含四倍體及非整倍體等。現(xiàn)有的純合體株系的選擇必須在染色體加倍前進(jìn)行一次單倍體植株的鑒定，力口倍后再進(jìn)行加倍體植株的鑒定，通常采用細(xì)胞形態(tài)鑒定法、流式細(xì)胞鑒定法、分子標(biāo)記鑒定法，這些方法都存在費(fèi)用高、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、操作程序復(fù)雜、技術(shù)性操作要求高等特點(diǎn)；而單純的植株形態(tài)學(xué)鑒定法又存在鑒定不正確的問(wèn)題。即使育種家按常規(guī)步驟花費(fèi)大量的時(shí)間和精力來(lái)鑒別它們的基因純合性，但是獲得的純合體植株育性和性狀表現(xiàn)未必就符合育種家的選擇目標(biāo)，即使符合育種家的要求，要在短時(shí)間內(nèi)也難快速獲得大量植株。因此，需有尋找一種新的成本低、實(shí)用性強(qiáng)、簡(jiǎn)單易行、基因型絕對(duì)純合、能在短時(shí)間內(nèi)獲得具有優(yōu)良性狀純合體植株的選育方法，來(lái)獲得大量在遺傳上具有純合基因組的植株，為雜種優(yōu)勢(shì)的有效利用和構(gòu)建遺傳連鎖圖提供理想材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決現(xiàn)有采用組培技術(shù)進(jìn)行胚珠誘導(dǎo)獲得單倍體植株存在胚珠誘導(dǎo)愈傷及幼芽的誘導(dǎo)率低 ，加倍過(guò)程中由于存在嵌合體，造成基因型不純合，染色體倍性鑒定費(fèi)工、費(fèi)時(shí)，單倍體加倍率低、純合體植株鑒定與快速繁殖效果差等技術(shù)難題，提供一種簡(jiǎn)便、快速獲取非洲菊優(yōu)良純合體植株的方法。
本發(fā)明提供的一種非洲菊純合體植株的選育方法，包括以下步驟:A、外植體的選擇與預(yù)處理①選擇花序直徑為3 4cm，舌狀花長(zhǎng)于萼片1 1.5cm的Fl代雜交種花蕾；②低溫處理，剪切所述的花蕾的花梗，留花梗長(zhǎng)為4 5cm，插入裝有自來(lái)水的瓶中，放入3 6°C的冰箱中低溫處理3 7天；③低溫處理后的花蕾進(jìn)行滅菌處理，將經(jīng)滅菌處理的花蕾在解剖鏡下剝?nèi)⊥廨喩酄罨ǖ呐咧樽鳛橥庵搀w；B、愈傷組織誘導(dǎo)及幼芽分化將步驟A剝?nèi)〉呐咧榻尤胂率雠囵B(yǎng)基中:MS基本培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤Ui 1.0 mg/L
蔡乙酸0.05 0.1 mg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂6500mg/L
pH5.8 6.0；先在溫度為25°C ±2°C，黑暗培養(yǎng)15天，再轉(zhuǎn)換在光照強(qiáng)度為15001x 20001x，光照時(shí)間為10h/d 12h/d，溫度為25°C ±2°C的條件下，同步進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和幼芽分化培養(yǎng)至外植體萌發(fā)分化出Icm以上的幼芽，每個(gè)胚珠萌發(fā)的幼芽保留2個(gè)，切成苗高為0.8cm 1.2cm的單株；C、繼代培養(yǎng)將步驟B的單株分株系轉(zhuǎn)接在與步驟B相同的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次，光照強(qiáng)度為15001x 20001x，溫度為25°C ±2°C，光照時(shí)間為10h/d 12h/d，繼代周期為30d ；D、單倍體株系初步選擇、染色體加倍和純合體株系的初選與步驟A①所述的花蕾直接作為外植體，用常規(guī)植物組織培養(yǎng)方法獲得的組培增殖苗相比，選擇步驟C中植株矮小、瘦弱，葉片窄的株系為初步選擇的單倍體株系，并淘汰不符合株系；每個(gè)初步選擇的單倍體株系留25個(gè)芽，其中留5個(gè)芽在與步驟C相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)作為對(duì)照株系CK，其余20個(gè)芽，切成苗高為0.8cm 1.2cm的單株接種到下述培養(yǎng)基中進(jìn)行染色體加倍培養(yǎng):1/2MS基本培養(yǎng)液6-芐胺基嘌呤0.3mg/L
秋水仙堿O 2 0.5mg/L
萠糖30000mg/L
瓊脂6500mg/L
pH5.8 6.0；在光照強(qiáng)度為15001χ 20001χ，溫度為25V ±2°C，光照時(shí)間為10h/d 12h/d的條件下，培養(yǎng)5d IOd后，再次分株系轉(zhuǎn)接在與步驟C相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)3次；在每個(gè)株系中選擇與加倍前的對(duì)照株系CK相比，葉片寬，葉色深的植株為初步選擇的加倍體植株，同時(shí)淘汰其它植株，每個(gè)株系中初步選擇的加倍體植株只保留5株進(jìn)行編號(hào)，作為初選純合體株系；E、初選純合體株系的保種與生根培養(yǎng)每個(gè)初選純合體株系在與步驟C相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下增殖至20個(gè)芽時(shí)，取其中5個(gè)芽在與步驟C相同的條件下保種，其余15個(gè)芽接種到下述培養(yǎng)基中:MS基本培養(yǎng)液
萘乙酸0.05 0.2 mg/L
_噪丁酸0.1 0.3mg/L
蔗糖30000mg/L
瓊脂6500mg/'L
pH5.8 6.0;在光照強(qiáng)度為15001χ 20001χ，溫度為25V ±2°C，光照時(shí)間為10h/d 12h/d的條件下，生根培養(yǎng)至基部長(zhǎng)出4 8條根；F、純合體株系的田間確定①將步驟E的生根植株移至大棚內(nèi)進(jìn)行常規(guī)煉苗、移栽管理至開花，用常規(guī)雜交技術(shù)進(jìn)行株系內(nèi)雜交；②淘汰不能產(chǎn)生可散粉花藥或接受花粉后不能夠正常結(jié)實(shí)的株系；③淘汰結(jié)實(shí)正常但雜交Fl代出現(xiàn)性狀分離的株系；④保留結(jié)實(shí)正常且雜交Fl代未出現(xiàn)性狀分離的株系即為確定的純合體株系；用與步驟C相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下擴(kuò)繁E步驟保種的與F步驟確定的純合體株系有相同編號(hào)的株系，即獲得非洲菊純合體植株。步驟A③所述的低溫處理后的花蕾進(jìn)行滅菌處理可以是將低溫處理后的花蕾先用洗衣粉水清洗，后用清水沖洗，在超凈環(huán)境下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中消毒15min，再放入下述混合液中消毒lOmin，之后用無(wú)菌水沖洗5次，每次lmin，即獲得經(jīng)滅菌處理的花蕾；所述的混合液為:每IOOml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉溶液中滴加2滴吐溫20。所述的非洲菊純合體植株的選育方法，還包括在步驟F得到的純合體株系中根據(jù)育種目標(biāo)，從中選擇所需株系，取在步驟E保種的與所需株系相同編號(hào)的株系，在與C步驟相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下擴(kuò)繁至達(dá)到所需基數(shù)時(shí)，再用與步驟E相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，即獲得所需數(shù)量且目標(biāo)性狀符合育種目標(biāo)的純合體植株。上述非洲菊純合體植株的選育方法，如下步驟可以是:步驟A②低溫處理中冰箱溫度為4°C，低溫處理5天；步驟B中所述的培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤0.6mg/L
萘乙酸0.08rag/L
鹿糖30000mg./L
瓊脂6M0mg/L
pH5 9；先在溫度為25°C，黑暗培養(yǎng)15天，再轉(zhuǎn)換在光照強(qiáng)度為18001x，光照時(shí)間為Ilh/d，溫度為25°C的條件下，同步進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和幼芽分化培養(yǎng)；步驟C繼代培養(yǎng)中將步驟B的單株分株系轉(zhuǎn)接在與步驟B相同的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次，光照強(qiáng)度為18001x，溫度為25°C，光照時(shí)間為llh/d，繼代周期為30d ；步驟D單倍體株系初步選擇及染色體加倍和純合體株系的初選中進(jìn)行染色體加倍培養(yǎng)所述的培養(yǎng)基為:1/2MS基本培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤0.3mg/L
秋水仙堿0.3mg/L
蔗糖30000mg/L
瓊脂6500 Uih ,L
pH5.9；在光照強(qiáng)度為18001x，溫度為25°C，光照時(shí)間為llh/d的條件下進(jìn)行染色體加倍，培養(yǎng)8d后，再次分株系轉(zhuǎn)接在與步驟C相同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)3次；步驟E中進(jìn)行生根培養(yǎng)所述的培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)液萘乙酸0.lmg/L
吲哚丁酸O 2mg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂6500mg/L
pH4 4
在光照強(qiáng)度為18001x，溫度為25°C，光照時(shí)間為llh/d的條件下生根培養(yǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法在經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)、探索和深入研究的基礎(chǔ)上，對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的整個(gè)工藝流程進(jìn)行了如下大量改進(jìn)，只用一種培養(yǎng)基進(jìn)行胚珠的愈傷組織誘導(dǎo)、幼芽分化和繼代增殖培養(yǎng)，簡(jiǎn)化了組培流程；選擇最佳的花蕾大小，通過(guò)低溫處理和暗培養(yǎng)處理，采用最佳條件，加上適宜的培養(yǎng)基，大大提高了胚珠幼芽的誘導(dǎo)率，采用室內(nèi)間接鑒定和田間直接鑒定相結(jié)合的方法選育純合體株系，提高了純合體植株選擇的準(zhǔn)確性，省略了染色體倍性鑒定的復(fù)雜工序，避免了現(xiàn)有單倍體植株在獲取和加倍過(guò)程中由于存在嵌合體問(wèn)題，造成基因型不純合的難題，節(jié)約了成本，克服了目前非洲菊品種的雜合狀態(tài)復(fù)雜，難于充分利用雜種優(yōu)勢(shì)的缺陷和不足，各步驟為獲得既不浪費(fèi)而又能確保選育純合體植株的基本數(shù)量環(huán)環(huán)相扣地控制各步工藝參數(shù)，提高了純合體植株的選擇效率，同時(shí)也節(jié)省了成本，行之有效、使整個(gè)工序操作簡(jiǎn)便、快速、易于掌握和實(shí)施，2 3年內(nèi)即可獲得純合的自交系，在短時(shí)間內(nèi)即能簡(jiǎn)便快速選育和繁殖大量具有優(yōu)良性狀純合體植株，為新品種選育提供大量可育的、性狀優(yōu)良、穩(wěn)定的自交系植株。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便、快速、有效、操作實(shí)用性強(qiáng)的系統(tǒng)、完整的非洲菊純合體植株的選育方法。本發(fā)明還有利于育種家安排育種計(jì)劃，提高了純合體植株的利用價(jià)值。1、本發(fā)明對(duì)整個(gè)工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，只用一種培養(yǎng)基行之有效地同步進(jìn)行胚珠的愈傷組織誘導(dǎo)、幼芽分化和繼代增殖培養(yǎng)，減少了培養(yǎng)基種類，簡(jiǎn)化了組培流程。2、本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，選擇Fl代雜交種花蕾，可以獲得廣泛變異的單倍體株系；選用最佳的花蕾大小，通過(guò)低溫處理和暗培養(yǎng)處理，采用最佳條件，加上適宜的培養(yǎng)基，60天內(nèi)，胚珠誘導(dǎo)成芽的比例率達(dá)28 40%(100個(gè)胚珠中有28 40個(gè)胚珠誘導(dǎo)成芽，其中有部分胚珠未經(jīng)過(guò)愈傷誘導(dǎo)步驟而直接誘導(dǎo)出幼芽，誘導(dǎo)成芽的最短時(shí)間為28天);同時(shí)本發(fā)明采用在培養(yǎng)基中進(jìn)行染色體加倍方法，使用較小體積的處理材料、通過(guò)獨(dú)特的染色體加倍培養(yǎng)基配方及較長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間，使植株變異率達(dá)60 80%，提高了純合體植株的選擇效率。3、本發(fā)明通過(guò)步驟D的單倍體株系和純合體株系的兩次室內(nèi)植株間接鑒定初選和步驟F的一次田間直接鑒定復(fù)選相結(jié)合，既省略了常規(guī)染色體倍性鑒定費(fèi)用高、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、操作程序復(fù)雜、技術(shù)性操作要求高的缺陷和步驟，同時(shí)又易于操作和掌握、節(jié)約了土地資源；2 3年內(nèi)獲得純合的自交系，縮短了純合體植株的選擇時(shí)間和育種年限；提高了純合體植株選擇的準(zhǔn)確性；節(jié)約了大量人力、物力。4、本發(fā)明采用株系選擇前均分株系繼代，且連續(xù)繼代3次(步驟C、步驟D)，使植株性狀較為一致和穩(wěn)定，避免了單倍體植株在獲取和加倍過(guò)程中由于存在嵌合體問(wèn)題，造成基因型不純合的難度，提高了目標(biāo)純合體植株選擇的準(zhǔn)確性和有效性。
5、本發(fā)明在步驟F純合體植株一經(jīng)鑒定后，即可回到步驟C和步驟E，在與步驟C相同的培養(yǎng)基和相同的培養(yǎng)條件下，進(jìn)行繼代和大量繁殖步驟E中保種的與所選株系相同編號(hào)的株系，30天為一個(gè)周期，繁殖倍數(shù)可達(dá)3 5，縮短了非洲菊優(yōu)良自交系的快速擴(kuò)繁周期，選育的自交系材料的繁殖不受季節(jié)限制，短時(shí)內(nèi)可大量繁殖純合體植株，為新品種選育提供大量可育的自交系植株，有利于育種家安排育種計(jì)劃，提高了純合體植株的利用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例1A、外植體的選擇與預(yù)處理:①選擇花序直徑為3 4cm，舌狀花長(zhǎng)于萼片I 1.5cm的Fl代雜交種花蕾；②低溫處理，剪切所述的花蕾的花梗，留花梗長(zhǎng)為4 5cm，插入裝有自來(lái)水的瓶中，放入3°C的冰箱中低溫處理7天；③將冰箱內(nèi)取出的花蕾先用洗衣粉水清洗，后用清水沖洗干凈，在超凈環(huán)境下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中消毒15min，再放入下列混合液中消毒lOmin，之后用無(wú)菌水沖洗5次，每次lmin，即獲得經(jīng)滅菌處理的花蕾；所述的混合液為:每IOOml質(zhì)量濃度為2%的次氯酸鈉溶液中滴加2滴吐溫20。將獲得經(jīng)滅菌處理的花蕾在解剖鏡下剝?nèi)』ɡ僦型廨喩酄罨ǖ呐咧樽鳛橥庵搀w。B、愈傷組織誘導(dǎo)及幼芽分化:將A步驟剝?nèi)〉呐?珠接入下述培養(yǎng)基中:MS基本培養(yǎng)液
6-節(jié)胺基嘌呤(6-BA) 0.3mg/L 萘乙酸(NM)0.05mg/L
蔗糖30000mg/L
瓊脂6500mg/L
pH5.8先在溫度為23°C，黑暗培養(yǎng)15天，再轉(zhuǎn)換在光照強(qiáng)度為15001x，光照時(shí)間為12h/d，溫度為23°C的條件下，同步進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和幼芽分化培養(yǎng)至外植體萌發(fā)分化出Icm以上的幼芽，60天內(nèi)，胚珠誘導(dǎo)成芽的比例率達(dá)40%( 100個(gè)胚珠中有40個(gè)胚珠誘導(dǎo)成芽)，每個(gè)胚珠萌發(fā)的幼芽保留2個(gè)，切成苗高為0.8cm 1.2cm的單株；C、繼代培養(yǎng)將步驟B的單株分株系轉(zhuǎn)接在與步驟B相同的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次，光照強(qiáng)度為15001x，溫度為23°C，光照時(shí)間為12h/d。繼代周期為30d，增殖倍數(shù)可達(dá)3倍； D、單倍體株系初步選擇、染色體加倍和純合體株系的初選與步驟A①所述的花蕾直接作為外植體，用常規(guī)植物組織培養(yǎng)方法獲得的組培增殖苗相比，選擇步驟C中植株矮小、瘦弱，葉片窄的株系為初步選擇的單倍體株系，并淘汰不符合株系；每個(gè)初步選擇的單倍體株系留25個(gè)芽，其中留5個(gè)芽在與步驟C相同的培養(yǎng)基和相同的培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)作為對(duì)照株系CK，其余20個(gè)芽，切成苗高為0.8cm
1.2cm的單株接種到下述培養(yǎng)基中進(jìn)行染色體加倍培養(yǎng):1/2MS基本培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤(6-BA)0.3mg/L
秋水仙堿0.2mg/L
蔗糖30000mg/L
瓊脂6500mg/L
pHο.8在光照強(qiáng)度為15001x，溫度為23°C，光照時(shí)間為12h/d的條件下進(jìn)行染色體加倍，培養(yǎng)IOd后，再次·分株系轉(zhuǎn)接在與步驟C相同的培養(yǎng)基和相同的培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)3次，在每個(gè)株系中選擇與加倍前的對(duì)照株系CK相比，葉片寬，葉色深的植株為初步選擇的加倍體植株，植株變異率達(dá)60% ;同時(shí)淘汰其它植株，每個(gè)株系中初步選擇的加倍體植株只保留5株進(jìn)行編號(hào),作為初選純合體株系；E、初選純合體株系保種與生根培養(yǎng):每個(gè)初選純合體株系在與步驟C相同的培養(yǎng)基和相同的培養(yǎng)條件下增殖至20個(gè)芽時(shí)，取其中5個(gè)芽在與步驟C相同的培養(yǎng)條件下保種(保種采用與步驟C相同的培養(yǎng)基和相同的培養(yǎng)條件，40天為一個(gè)周期)，其余15個(gè)芽接種到下述培養(yǎng)基中:MS基本培養(yǎng)液
萘乙酸(NAA)0.05mg/L
噴哚丁酸(IBA)0.lmg/L
鹿糖30000mg/L
瓊脂6500rag/L
pH5.8在光照強(qiáng)度為15001x，溫度為23°C，光照時(shí)間為12h/d的條件下，生根培養(yǎng)至基部長(zhǎng)出4 8條根；F、純合體株系的田間確定:①將步驟E的生根植株移至大棚內(nèi)進(jìn)行常規(guī)煉苗、移栽管理至開花，用常規(guī)雜交技術(shù)進(jìn)行株系內(nèi)雜交(同一株系的不同單株作為父、母本進(jìn)行雜交)。②淘汰不能產(chǎn)生可散粉花藥或接受花粉后不能夠正常結(jié)實(shí)的株系，由此可淘汰步驟D加倍不成功未能及時(shí)淘汰的單倍體株系或育性不良的株系；③淘汰結(jié)實(shí)正常但雜交Fl代出現(xiàn)不同性狀，出現(xiàn)了與父、母本的性狀不相同的性狀表現(xiàn)，即Fl代出現(xiàn)性狀分離的株系，由此可淘汰因步驟D單倍體選擇錯(cuò)誤未能淘汰的雜合體(基因型雜合)株系；④保留結(jié)實(shí)正常且雜交Fl代的各性狀與父、母本的性狀表現(xiàn)完全一致，即F1代未出現(xiàn)性狀分離的株系即為確定的純合體株系。這些株系即為育性正常、基因型純合的自交系。用與C步驟相同的培養(yǎng)基和相同的培養(yǎng)條件下擴(kuò)繁E步驟保種的與F步驟④確定的純合體株系有相同編號(hào)的株系，即獲得非洲菊純合體植株。根據(jù)育種需要(目標(biāo))，從中選擇所需株系，取在步驟E保種的與所需株系相同編號(hào)的株系，在與步驟C相同的培養(yǎng)基和相同的培養(yǎng)條件下，快速擴(kuò)繁達(dá)到所需基數(shù)時(shí)，再用與步驟E相同的培養(yǎng)基和相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，即獲得大量(或育種所需數(shù)量)且目標(biāo)性狀符合育種需要(目標(biāo))的非洲菊純合體植株。實(shí)施例2實(shí)施例2除以下操作不同外，其余操作與實(shí)施例1相同，不再贅述。A、外植體的選擇與預(yù)處理②低溫處理中冰箱的溫度為6°C，低溫處理3天；B、愈傷組織誘導(dǎo)及幼芽分化的培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤(6-BA) 1.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.lmg/L蔗糖 30000mg/L瓊脂 6500mg/L
pH6.0先在溫度為27°C，黑暗培養(yǎng)15天，再轉(zhuǎn)換在光照強(qiáng)度為20001x，光照時(shí)間為10h/d，溫度為27°C的條件下，同步進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和幼芽分化培養(yǎng)至外植體萌發(fā)分化出1cm以上的幼芽，60天內(nèi)，胚珠誘導(dǎo)成芽的比例率達(dá)28%(100個(gè)胚珠中有28個(gè)胚珠誘導(dǎo)成芽)。C、繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為20001x，溫度為27°C，光照時(shí)間為10h/d，繼代周期為30d，
增殖倍數(shù)可達(dá)到5倍。D、單倍體株系初步選擇、染色體加倍和純合體株系的初選進(jìn)行染色體加倍培養(yǎng)所述的培養(yǎng)基為:1/2MS基本培養(yǎng)液6-芐胺基嘌呤(6-BA )0.3mg/L
秋水仙堿0.5mg/L
蔗糖30000mg/L
瓊脂6500mg./L
pH6.0在光照強(qiáng)度為2UD01X，溫度為27°C，光照時(shí)間為10h/d的條件下進(jìn)行染色體加倍，
培養(yǎng)5d后，再次分株系轉(zhuǎn)接在與步驟C相同培養(yǎng)基和相同的條件下繼代培養(yǎng)3次，植株變異率達(dá)80%。E、初選純合體株系保種與生根培養(yǎng):進(jìn)行生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)液
萘乙酸(NAA)0.2mg/L
吲哚丁酸(IBA)0.3mg/L
庶糖30000mg/L
瓊脂6500mg/L
pH6.0在光照強(qiáng)度為20001x，溫度為27°C，光照時(shí)間為10h/d的條件下生根培養(yǎng)。實(shí)施例3實(shí)施例3除以下操作不同外，其余操作與實(shí)施例1相同，不再贅述。A、外植體的選擇與預(yù)處理:②低溫處理中冰箱的溫度為4°C，低溫處理5天。B、愈傷組織誘導(dǎo)及幼芽分化的培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)液
6_芐胺基嘌呤(6-BA)0.6mg/L
萘乙酸(NAA)0.08mg/L
,蔗糖30000mg/'L
瓊脂Π iDOmg/L
pH5.9先在溫度為25°C，黑暗培養(yǎng)15天，再轉(zhuǎn)換在光照強(qiáng)度為18001x，光照時(shí)間為Ilh/d，溫度為25°C的條件下，同 步進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和幼芽分化培養(yǎng)至外植體萌發(fā)分化出Icm以上的幼芽，60天內(nèi)，胚珠誘導(dǎo)成芽的比例率達(dá)36%(100個(gè)胚珠中有36個(gè)胚珠誘導(dǎo)成芽)。
C、繼代培養(yǎng):繼代培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為18001x，溫度為25°C，光照時(shí)間為llh/d，繼代周期為30d。
增殖倍數(shù)可達(dá)4倍。D、單倍體株系初步選擇、染色體加倍和純合體株系的初選進(jìn)行染色體加倍培養(yǎng)所述的培養(yǎng)基為:1/2MS基本培養(yǎng)液
6-芐胺基嘌呤(6-BA;0.3mg/L
秋水仙堿0.3mg/L
Il 糖30000mg/L
瓊脂6500 mg/L
pH5.9； 在光照強(qiáng)度為18001x，溫度為25°C，光照時(shí)間為llh/d的條件下進(jìn)行染色體加倍，培養(yǎng)8d后，再次分株系轉(zhuǎn)接在與步驟C相同培養(yǎng)基和相同的條件下繼代培養(yǎng)3次，植株變異率達(dá)72%。E、初選純合體株系保種與生根培養(yǎng)進(jìn)行生根培養(yǎng)所述的培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)液
萘乙酸(NAA)0.lmg/L
吲哚丁酸(IBA)0.2mg/L
蔗糖30000mg/L
瓊脂6500mg/L
pH5.9；在光照強(qiáng)度為18001x，溫度為25°C，光照時(shí)間為llh/d的條件下生根培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種非洲菊純合體植株的選育方法，包括以下步驟: A、外植體的選擇與預(yù)處理 ①選擇花序直徑為3 4cm，舌狀花長(zhǎng)于萼片I 1.5cm的Fl代雜交種花蕾； ②低溫處理，剪切所述的花蕾的花梗，留花梗長(zhǎng)為4 5cm，插入裝有自來(lái)水的瓶中，放入3 6°C的冰箱中低溫處理3 7天； ③低溫處理后的花蕾進(jìn)行滅菌處理，將經(jīng)滅菌處理的花蕾在解剖鏡下剝?nèi)⊥廨喩酄罨ǖ呐咧樽鳛橥庵搀w； B、愈傷組織誘導(dǎo)及幼芽分化 將步驟A剝?nèi)〉呐咧榻尤胂率雠囵B(yǎng)基中: MS基本培養(yǎng)液 6-芐胺基嘌呤0.3 1.0 mg/L萘乙酸0.05 0.1 mg/L 蔗糖30000mg/L瓊脂6500mg/L pH5.8—6.0； 先在溫度為25°C ±2°C，黑暗培養(yǎng)15天，再轉(zhuǎn)換在光照強(qiáng)度為15001x 20001x，光照時(shí)間為10h/d 12h/d，溫度為25°C ±2°C的條件下，同步進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和幼芽分化培養(yǎng)至外植體萌發(fā)分化出Icm以上的幼芽，每個(gè)胚珠萌發(fā)的幼芽保留2個(gè)，切成苗高為.0.8cm 1.2cm的單株； C、繼代培養(yǎng) 將步驟B的單株分株系轉(zhuǎn)接在與步驟B相同的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次，光照強(qiáng)度為15001x 20001x，溫度為25°C ±2°C，光照時(shí)間為10h/d 12h/d，繼代周期為30d ； D、單倍體株系初步選擇、染色體加倍和純合體株系的初選 與步驟A①所述的花蕾直接作為外植體，用常規(guī)植物組織培養(yǎng)方法獲得的組培增殖苗相比，選擇步驟C中植株矮小、瘦弱，葉片窄的株系為初步選擇的單倍體株系，并淘汰不符合株系；每個(gè)初步選擇的單倍體株系留25個(gè)芽，其中留5個(gè)芽在與步驟C相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)作為對(duì)照株系CK，其余20個(gè)芽，切成苗高為0.8cm 1.2cm的單株接種到下述培養(yǎng)基中進(jìn)行染色體加倍培養(yǎng): 1/2MS基本培養(yǎng)液 6-芐胺基嘌呤0.3mg/L 秋水仙堿O 2 0.5mg/L蔗糖30000mg/L瓊脂6500 mg/LpH5.8 6.0;在光照強(qiáng)度為15001x 20001x，溫度為25°C ±2°C，光照時(shí)間為10h/d 12h/d的條件下，培養(yǎng)5d IOd后，再次分株系轉(zhuǎn)接在與步驟C相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)3次；在每個(gè)株系中選擇與加倍前的對(duì)照株系CK相比，葉片寬，葉色深的植株為初步選擇的加倍體植株，同時(shí)淘汰其它植株，每個(gè)株系中初步選擇的加倍體植株只保留5株進(jìn)行編號(hào)，作為初選純合體株系； E、初選純合體株系的保種與生根培養(yǎng) 每個(gè)初選純合體株系在與步驟C相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下增殖至20個(gè)芽時(shí)，取其中5個(gè)芽在與步驟C相同的條件下保種，其余15個(gè)芽接種到下述培養(yǎng)基中: MS基本培養(yǎng)液萘乙酸0.05 0.2 mg/L吲哚丁酸0.1 0.3mg/L 蔗鼽30000mg/L瓊脂6500mg /LpH5.8-6.0； 在光照強(qiáng)度為15001χ 20001x，溫度為25°C ±2°C，光照時(shí)間為10h/d 12h/d的條件下，生根培養(yǎng)至基部長(zhǎng)出4 8條根； F、純合體株系的田間確定 ①將步驟E的生根植株移至大棚內(nèi)進(jìn)行常規(guī)煉苗、移栽管理至開花，用常規(guī)雜交技術(shù)進(jìn)行株系內(nèi)雜交； ②淘汰不能產(chǎn)生可散粉花藥或接受花粉后不能夠正常結(jié)實(shí)的株系； ③淘汰結(jié)實(shí)正常但雜交Fl代出現(xiàn)性狀分離的株系； ④保留結(jié)實(shí)正常且雜交Fl代未出現(xiàn)性狀分離的株系即為確定的純合體株系；用與步驟C相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下擴(kuò)繁E步驟保種的與F步驟確定的純合體株系有相同編號(hào)的株系，即獲得非洲菊純合體植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非洲菊純合體植株的選育方法，步驟A③所述的低溫處理后的花蕾進(jìn)行滅菌處理是將低溫處理后的花蕾先用洗衣粉水清洗，后用清水沖洗，在超凈環(huán)境下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中消毒15min，再放入混合液中消毒lOmin，之后用無(wú)菌水沖洗5次，每次lmin，即獲得經(jīng)滅菌處理的花蕾；所述的混合液為:每IOOml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的次氯酸鈉溶液中滴加2滴吐溫20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的非洲菊純合體植株的選育方法，還包括在步驟F得到的純合體株系中根據(jù)育種目標(biāo)，從中選擇所需株系，取在步驟E保種的與所需株系相同編號(hào)的株系，在與步驟C相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下擴(kuò)繁至達(dá)到所需基數(shù)時(shí)，再用與步驟E相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，即獲得所需數(shù)量且目標(biāo)性狀符合育種目標(biāo)的純合體植株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的非洲菊純合體植株的選育方法，其特征在于: 步驟A②低溫處理中冰箱溫度為4°C，低溫處理5天； 步驟B中所述的培養(yǎng)基為:MS基本培養(yǎng)液6-芐胺基嘌呤0.6mg/L萘乙酸0.08nig/L庶初 30000mg/L諒脂6500mg/L pH5 9 先在溫度為25°C，黑暗培養(yǎng)15天，再轉(zhuǎn)換在光照強(qiáng)度為18001x，光照時(shí)間為llh/d，溫度為25°C的條件下，同步進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和幼芽分化培養(yǎng)； 步驟C繼代培養(yǎng)中將步驟B的單株分株系轉(zhuǎn)接在與步驟B相同的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次時(shí)光照強(qiáng)度為18001x，溫度為25°C，光照時(shí)間為llh/d，繼代周期為30d ； 步驟D單倍體株系初步選擇及染色體加倍和純合體株系的初選中進(jìn)行染色體加倍培養(yǎng)所述的培養(yǎng)基為: 1/2MS基本培養(yǎng)液6-芐胺基嘌呤0 .3mg/L秋水仙堿0.3mg/L蔗糖30000mg/L瓊脂6500 mg/L pH5.9； 在光照強(qiáng)度為18001χ，溫度為25°C，光照時(shí)間為llh/d的條件下進(jìn)行染色體加倍，培養(yǎng)8d后，再次分株系轉(zhuǎn)接在與步驟C相同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)3次； 步驟E中進(jìn)行生根培養(yǎng)所述的培養(yǎng)基為: MS基本培養(yǎng)液萘乙酸0.1 mg/L吲哚丁酸0.2mg/L辟糖30000mg/L瓊脂6500mg/L pH5.9； 在光照強(qiáng)度為18001χ，溫度為25°C，光照時(shí)間為llh/d的條件下生根培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的非洲菊純合體植株的選育方法，其特征在于: 步驟A②低溫處理中冰箱溫度為4°C，低溫處理5天； 步驟B中所述的培養(yǎng)基為: MS基本培養(yǎng)液6-芐胺基嘌呤0.6mg/L荼乙酸0.08nig/L辟糖30000mg/L瓊脂6500mg/L pHD ^ 先在溫度為25°C，黑暗培養(yǎng)15天，再轉(zhuǎn)換在光照強(qiáng)度為18001X，光照時(shí)間為llh/d，溫度為25°C的條件下，同步進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和幼芽分化培養(yǎng)； 步驟C繼代培養(yǎng)中將步驟B的單株分株系轉(zhuǎn)接在與步驟B相同的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次時(shí)光照強(qiáng)度為18001x，溫度為25°C，光照時(shí)間為llh/d，繼代周期為30d ； 步驟D單倍體株系初步選擇及染色體加倍和純合體株系的初選中進(jìn)行染色體加倍培養(yǎng)所述的培養(yǎng)基為: 1/2MS基本培養(yǎng)液6-芐胺基嘌呤0.3mg/L秋水仙堿0.3mg/L蔗糖30000mg/L瓊脂6500 mg/L pH5.9； 在光照強(qiáng)度為18001χ，溫度為25°C，光照時(shí)間為llh/d的條件下進(jìn)行染色體加倍，培養(yǎng)8d后，再次分株系轉(zhuǎn)接在與步驟C相同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)3次； 步驟E中進(jìn)行生根培養(yǎng)所述的培養(yǎng)基為: MS基本培養(yǎng)液萘乙酸0.1 mg/L吲哚丁酸0.2mg/L蔗掛:30000mg/L諒胎6500mg/L pH5 9； 在光照強(qiáng)度為18001χ，溫度為25°C，光照時(shí)間為llh/d的條件下生根培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種非洲菊純合體植株的選育方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法通過(guò)花蕾選擇、低溫處理和消毒，剝?nèi)∨咧榻尤胪环N培養(yǎng)基中同步進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、幼芽分化和繼代培養(yǎng)，將初步選擇的單倍體植株進(jìn)行染色體加倍，并初步選擇已加倍株系進(jìn)行擴(kuò)繁和生根培養(yǎng)，田間株系內(nèi)雜交，再次選擇得到優(yōu)良純合體植株。本發(fā)明只用一種培養(yǎng)基進(jìn)行胚珠的愈傷組織誘導(dǎo)、幼芽分化和繼代增殖培養(yǎng)，簡(jiǎn)化了組培流程；采用室內(nèi)間接鑒定和田間直接鑒定相結(jié)合的方法，省略了染色體倍性鑒定步驟，避免了單倍體植株在獲取和加倍過(guò)程中由于存在嵌合體問(wèn)題，造成基因型不純合的難題，能簡(jiǎn)便快速選育和繁殖出非洲菊純合體植株，為新品種選育提供了性狀優(yōu)良、穩(wěn)定的自交系。
文檔編號(hào)A01H1/04GK103109736SQ20131007310
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月8日
發(fā)明者單芹麗, 楊春梅, 李紳崇, 王繼華, 吳麗芳, 屈云慧, 汪國(guó)鮮, 曹樺, 張婷, 許鳳, 李金澤, 阮繼偉 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所